Artykuł metodologiczny

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54372

⸱

16 grudnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Streszczenie

Ten protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) poprzez nadekspresję czynników transkrypcyjnych (TF). Najpierw zaprojektowaliśmy ekran reporterski przy użyciu MEF od ludzkich myszy podwójnie transgenicznych CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP). Komórki CD34 + z tych myszy znakują histony H2B za pomocą GFP i przestają znakować po dodaniu doksycykliny (DOX). MEFS transdukowano z kandydującymi TF, a następnie obserwowano pojawienie się komórek GFP+, które wskazywałyby na nabycie losu komórek krwiotwórczych lub śródbłonka. Zaczynając od 18 kandydujących TF i poprzez proces eliminacji kombinatorycznej, uzyskaliśmy minimalny zestaw czynników, które indukowałyby najwyższy odsetek komórek GFP+. Stwierdziliśmy, że Gata2, Gfi1b i cFos były konieczne, a dodanie Etv6 zapewniło optymalną indukcję. Seria analiz ekspresji genów przeprowadzonych w różnych punktach czasowych podczas procesu przeprogramowania ujawniła, że komórki te wydawały się przechodzić przez komórkę prekursorową, która przeszła przejście śródbłonka do układu krwiotwórczego (EHT). W związku z tym ten proces przeprogramowania naśladuje rozwojową hematopoezę "w naczyniu", umożliwiając badanie hematopoezy in vitro i platformę do identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw tej specyfikacji. Metodologia ta zapewnia również ramy dla przełożenia tej pracy na system ludzki w nadziei na wygenerowanie alternatywnego źródła specyficznych dla pacjenta hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) do wielu zastosowań w leczeniu i badaniu chorób hematologicznych.

Wprowadzenie

Hematopoeza to złożony proces rozwojowy, w którym hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) pączkują z hemogennego śródbłonka obecnego w różnych embrionalnych miejscach krwiotwórczych, takich jak aorta-gonada-mesonephros i łożysko1,2. Brak możliwości hodowli HSC in vitro uniemożliwia dogłębną analizę tego procesu, jak również kliniczne zastosowanie tych badań. Aby obejść to ograniczenie, wcześniejsze badania próbowały wyprowadzić HSC de novo albo poprzez różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC)3, albo indukowaną plastyczność w komórkach somatycznych i ukierunkowane różnicowanie za pomocą pożywekprzeprogramowujących 4,5. Badania te nie generują jednak klinicznie bezpiecznych komórek do wszczepienia ani nie pozwalają na badanie ostatecznej hematopoezy rozwojowej "w naczyniu".

Nowatorska praca założona przez Yamanakę i współpracowników w celu generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z fibroblastów somatycznych dostarcza ram dla strategii nadekspresji opartych na czynniku transkrypcyjnym (TF) w przeprogramowaniu losu komórki6,7. Prace te skłoniły badaczy z kilku dziedzin do wygenerowania wybranych typów komórek poprzez przeprogramowanie TF łatwych do uzyskania komórek somatycznych. Celem opisanej tutaj strategii przeprogramowania jest wywołanie procesu hemogennego z mysich komórek somatycznych przy użyciu podejścia do przeprogramowania opartego na TF w celu przełożenia tych wyników na system ludzki w celu przeprogramowania fibroblastów specyficznych dla pacjenta w celu zbadania ludzkiej hematopoezy in vitro i wygenerowania specyficznych dla pacjenta produktów krwiopochodnych do modelowania choroby, testowania leków, i przeszczep komórek macierzystych.

Pierwszym krokiem do zapewnienia prawidłowego przeprogramowania w tym systemie myszy było opracowanie linii reporterowej, która służyła jako odczyt ekspresji CD34, znanego markera w komórkach progenitorowych śródbłonka i HSC. Aby to zrobić, transgeniczne linie myszy huCD34-tTA i TetO-H2BGFP wykorzystano do wygenerowania podwójnie transgenicznych mysich fibroblastów embrionalnych (MEF), obecnie oznaczonych jako 34 / H2BGFP, które fluoryzują na zielono po aktywacji promotora CD348. Umożliwiło to badania przesiewowe różnych TF, o których wiadomo, że są wymagane w różnych momentach specyfikacji i rozwoju układu krwiotwórczego. Począwszy od 18 TF w wektorach retrowialnych pMX (określonych poprzez eksplorację literatury i profilowanie HSC zatrzymujących etykietę GFP od wcześniej opisanych myszy 34 / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEF transdukowano wszystkimi czynnikami i hodowano na komórkach zrębowych wspierających HSC AFT024. Po wykryciu aktywacji 34/H2BGFP, TF zostały następnie usunięte z koktajlu przeprogramowującego, aż do zidentyfikowania optymalnego zestawu TF do aktywacji reporterowej. Po tym wstępnym badaniu przesiewowym czynniki przeniesiono do indukowanego przez DOX systemu wektorów pFUW, aby umożliwić kontrolowaną ekspresję TF. Ponieważ te dwa systemy sterowane DOX są niekompatybilne (komórki 34 / H2BGFP i wektory indukowane pFUW), wymagane były MEF od myszy C57BL / 6 typu dzikiego. Konieczne było również zapewnienie odpowiedniego mikrośrodowiska, które umożliwiłoby postęp hemogenezy i wytworzenie wieloliniowych klonogennych prekursorów.

Obecne badania próbujące przeprogramować komórki somatyczne na hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) spotkały się z różnym sukcesem9-11. Do tej pory nie udało się wytworzyć zarówno myszy, jak i ludzi przeszczepialnych, które mają długoterminową i samoodnawiającą się zdolność do ponownego zasiedlania, przy użyciu tego samego zestawu TF. W tym protokole przedstawiamy szczegółowy opis wcześniej ustalonej strategii powtarzalnego indukowania hemogenezy w MEF. Wykazaliśmy, że wprowadzenie minimalnego zestawu TF (Gata2, Gfi1b, cFos i Etv6) jest w stanie zainicjować złożony program rozwojowy in vitro, który stanowi platformę, za pomocą której można dalej badać rozwojową hematopoezę i kliniczne zastosowanie przeprogramowania układu krwiotwórczego12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Linie komórkowe myszy są uzyskiwane zgodnie z wytycznymi Icahn School of Medicine w Mount Sinai dotyczącymi opieki nad zwierzętami i powinny być wykonywane zgodnie z każdą instytucją goszczącą.

1. Izolacja mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) myszy C57BL/6

  1. Ustaw krycie czasowe13. Po uwidocznieniu czopa dopochwowego rozważ ten Dzień 0,5.
  2. Oddziel zatkane samice w dniu zatyczki i sprawdź je w dniu 10-11, aby potwierdzić ciążę.
  3. W dniach 13.5-14.5 poddać eutanazji ciężarne samice myszy poprzez wdychanie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Namocz brzuch ciężarnej kobiety w 70% etanolem, wypreparuj jamę brzuszną sterylnymi nożyczkami i kleszczami wzdłuż linii środkowej oraz chirurgicznie usuń rogi macicy zawierające zarodki14. Delikatnie wyjmij zarodki, odcinając pozostałą tkankę brzuszną.
    UWAGA: Odzyskaj około 8 zarodków po 4 z każdej strony.
  5. Umieść rogi macicy zawierające zarodki w 10-centymetrowym naczyniu z 5-10 ml sterylnie schłodzonego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  6. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie wzdłuż rogów macicy, aby odizolować woreczki zawierające zarodki. Przenieś woreczki do nowego 10 cm naczynia z 5-10 ml sterylnie schłodzonego PBS i umieść na lodzie.
  7. Umieść kilka woreczków w nowym 10-centymetrowym naczyniu z 5-10 ml sterylnie schłodzonego PBS. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy delikatnie rozetnij woreczki (nie nacinając zbyt głęboko), aby uniknąć przekłuwania zarodków.
  8. Oddziel zarodki od łożyska, przecinając pępowinę.
  9. Przenieś zarodki do nowego 10-centymetrowego naczynia zawierającego 5-10 ml schłodzonego PBS i pozostaw na lodzie, kończąc pozostałe sekcje.
  10. Odetnij głowy zarodkom za pomocą sterylnych kleszczy. Ostrożnie odetnij linię środkową zarodka za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy, zaczynając od obszaru pozbawionego głowy, aby otworzyć brzuch. Umieść kleszcze pod narządami trzewnymi (w tym sercem, wątrobą i płucami) i zeskrob je15.
  11. Pozostałą tkankę pokrój na małe kawałki za pomocą nożyczek i kleszczyków i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml trypsyny.
  12. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml 20-30 razy, aby wymieszać i zdysocjować tkankę.
  13. Inkubować mieszaninę tkanki i trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 45 minut, od czasu do czasu mieszając.
  14. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml przez około 5 minut, aby wymieszać zawartość.
  15. Dodaj trypsynizowane komórki do 3x objętości standardowego Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 μg/ml penicyliny/streptomycyny (P/S) i 1 mM L-Glutaminy (L-GLUT) w 10 cm szalkach (~10 ml) i hoduj w temperaturze 37 °C aż do zlewu (około 2-4 dni). Hodowla około 1-2 zarodków na 10 cm naczynie.
    UWAGA: Zamroź komórki, gdy płytki się zlewają. Zamrożone komórki można rozmrozić i pasażować jeszcze 2 razy. Komórki można alternatywnie podzielić 2 razy przed zamrożeniem, a następnie jeszcze raz po rozmrożeniu.

2. Produkcja wirusów

  1. Rozwiń komórki 293T na 10-centymetrowych płytkach za pomocą 10 ml DMEM z 10% FBS, 1% P/S i 1% L-GLUT do transfekcji.
    1. Trypsynizować komórki 293T za pomocą 2 ml trypsyny, inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, zebrać komórki do probówek o pojemności 15 ml, wirować przy 300 x g i odpowiednio rozlać na płytki (10 ml na 10 cm naczynie).
  2. 24 godziny przed transfekcją podzielić zlewającą się 10-centymetrową płytkę komórek 293T 1:6 i nasiona w 10 cm pokrytych żelatyną (0,1% żelatyny w PBS) płytkach.
    UWAGA: Wymagane będą 4 płytki na wirusa.
    1. Aby pokryć płytki żelatyną, dodaj co najmniej 2 ml 0,1% roztworu żelatyny, aby pokryć spód 10 cm talerzy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 minut. Odessać żelatynę przed dodaniem komórek do płytek.
  3. W probówce o pojemności 15 ml dodaj 84 μg plazmidu (np. Gata2, Gfi1b, cFos lub Etv6 (subklonowany do wektora pFUW-TetO16) lub FUW-M2rtTA17), 84 μg psPAX2 i 42 μg pMD2.G. Dodać wodę (H2O), aby uzupełnić objętość do 2 ml. Przygotuj probówkę dla każdego czynnika (np. Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 oraz FUW-M2rtTA).
  4. Dodać 250 μl 2M CaCl2 do każdej probówki zawierającej 2 ml mieszaniny złożonej z 84 μg wybranego genu (Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 lub FUW-M2rtTA) + 84 μg psPAX2 + 42 μg pMD2.G + H2O.
  5. Używając pipety Pasteura włożonej do pomocy pipetowej, uwolnić pęcherzyki do mieszaniny 2,25 ml DNA + H2O + 2 M CaCl2. Podczas wytwarzania pęcherzyków przyłóż końcówkę P1000 do szklanej pipety i powoli wysypuj 2 ml soli fizjologicznej kwasu N,N-bis (2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowego (BES) o pojemności 100 mM do pipety Pasteura po 1 ml na raz.
  6. Inkubować wszystkie probówki w okapie hodowlanym w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.
    UWAGA: Mieszanina o objętości 4,25 ml (teraz DNA +H2O+ 2M CaCl2 + sól fizjologiczna BES) będzie wyglądać na lekko mętną.
  7. Podczas inkubacji mieszaniny odessać pożywkę z płytek 293T i dodać 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-Glutaminy + 25 nM chlorochiny.
    UWAGA: Ten nośnik nie zawiera P/S.
  8. Po co najmniej 15 minutach inkubacji (lub do czasu zmiany pożywki na komórkach 293T), dodać kroplami 4,25 ml mieszaniny DNA +H2O+ 2 M CaCl2 + BES soli fizjologicznej do komórek 293T, równomiernie rozprowadzając na 4 płytkach komórkowych na probówkę (tj. nieco więcej niż 1 ml mieszaniny na płytkę).
  9. Inkubować płytki przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
  10. 24 godziny po inkubacji zastąp pożywkę na wszystkich płytkach 4 ml standardowego DMEM (patrz krok 1.15).
  11. Od teraz należy przechowywać komórki w inkubatorze o temperaturze 32 °C.
  12. Po upływie 24 godzin od wykonania kroku 2.10 należy zebrać podłoże do oddzielnych probówek o pojemności 50 ml. Zastąp zebraną pożywkę z każdej płytki 4 ml wzorcowego DMEM.
    UWAGA: 4 płytki na początkową mieszaninę probówek dają 16 ml zebranej pożywki.
    1. Po 12 godzinach inkubacji ponownie zebrać pożywkę do tych samych probówek o pojemności 50 ml i zastąpić kolejnymi 4 ml standardowego DMEM.
    2. Po 12 godzinach inkubacji zebrać pożywkę i dodać do tych samych probówek o pojemności 50 ml.
      UWAGA: każda probówka powinna teraz zawierać około 48 ml pożywki zawierającej wirusa.
  13. Aby zagęścić zebrany wirus, najpierw przefiltruj zebrane pożywki przez filtry o niskiej zawartości białka o średnicy 0,45 μM.
  14. Przefiltrowaną pożywkę zawierającą wirusa przelać do probówek wirówkowych o stężeniu wirusa (jednorazowo około 16 ml).
  15. Wirować w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez 25 minut i usunąć przepływ.
    UWAGA: W filtrze będzie widoczna niewielka objętość skoncentrowanego podłoża i wirusa.
  16. Dodać kolejne 16 ml przefiltrowanej pożywki zawierającej wirusa do stężonej pożywki + objętości wirusa pozostałej w filtrze i wymieszać, odwracając probówkę.
  17. Ponownie wirować probówkę przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez 25 minut i wyrzucić przepływ.
  18. Dodaj pozostałą przefiltrowaną kolekcję do skoncentrowanej pożywki + objętości wirusa pozostałej w filtrze i wymieszaj, odwracając probówkę.
  19. Wirować jeszcze raz w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10-20 minut (w zależności od objętości w filtrze) i upewnić się, że pozostała objętość stężonej pożywki + wirusa pozostała w filtrze wynosi około 1 ml. Jeśli w filtrze pozostaje więcej niż 1 ml stężonej pożywki + wirusa, należy ponownie wirować przy 4 000 x g przez 1 minutę i powtarzać do momentu, aż 1 ml pozostanie w filtrze.
  20. Porcję 200 μl zagęszczonego wirusa rozlać do probówek o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć.

3. Przeprogramowanie MEF

  1. Wstępnie pokryj 6 dołków 0,5 ml 0,1% żelatyny w PBS na studzienkę, upewniając się, że żelatyna pokrywa całą powierzchnię studzienki. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i inkubować przez co najmniej 20 minut. Po inkubacji usunąć płytki i odessać żelatynę.
  2. Płytki MEF ze standardowym DMEM o gęstości 25 000 komórek na basenik (150 000 komórek na płytkę 6-dołkową) na żelatynizowanej płytce 6-dołkowej z kroku 3.1 i pozostawić do osadzenia O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. Przygotuj koktajl wirusowy o objętości 100 μl, mieszając 50 μl M2rtTA i pozostałe 50 μl mieszaniny Gata2, Gfi1b, cFos i Etv6 (po 12,5 μl każdy).
  4. Odessać pożywkę z MEF i dodać 2 ml wzorcowego DMEM z 8 μg/ml bromku heksadimetryny.
  5. Wprowadzić do każdego dołka płytek MEF 15 μl koktajlu wirusa i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: To jest dzień 0 procesu przeprogramowywania.
  6. W dniu 1, po 16-20 godzinach inkubacji, zastąp pożywkę 2 ml świeżego wzorcowego DMEM uzupełnionego 1 μg/ml DOX na basenik.
  7. Przygotować pożywkę do hodowli krwiotwórczej z dodatkiem hydrokortyzonu (10-6 M), czynnika komórek macierzystych 100 ng/ml (SCF), liganda kinazy tyrozynowej 3 związanego z Fms 100 ng/ml (Flt3L), 20 ng/ml interleukiny-3 (IL-3), 20 ng/ml interleukiny-6 (IL-6) i 1 μg/ml DOX.
  8. W dniu 4 odessać pożywkę z każdej studzienki i przemyć komórki 1 ml PBS na studzienkę.
  9. Odessać PBS, zdysocjować komórki za pomocą 1 ml 0,05% trypsyny na dołek i zebrać komórki.
  10. Policz komórki za pomocą hemocytometru, wiruj z prędkością 300 x g przez 5 minut, ponownie zawieś w 12 ml pożywki krwiotwórczej opisanej w kroku 3.7 i umieść 60 000 komórek na płytce 6-dołkowej na 0,1% płytkach pokrytych żelatyną (2 ml na dołek, 10 000 komórek na dołek).
  11. Pożywki należy zastępować świeżymi, uzupełnionymi pożywkami do hodowli krwiotwórczych co 6 dni przez cały okres hodowli (35 do 36 dni).
  12. Analizuj komórki pośrednie lub pojawiające się komórki hematopoetyczne za pomocą barwienia immunologicznego12, analizy FACS8,12, qRT-PCR12 i sekwencjonowania mRNA12, aby potwierdzić nabycie hemogennych markerów śródbłonka lub podobnych do HSC i ekspresji genów.

4. Testy agregacji łożyska i tworzenia kolonii (CFU) w metylocelulozie

  1. Wypreparuj łożyska ciężarnych myszy C57BL/6, jak opisano wcześniej18 w E12.5 i utrzymuj tkankę na lodzie.
  2. Aby rozpocząć dysocjację łożyska19, przemyj tkankę łożyska w 2-5 ml 0,2% kolagenazy typu I w PBS z 20% FBS i mechanicznie dysocjuj za pomocą igły 18G umieszczonej w strzykawce o pojemności 5 ml poprzez przejście łożyska i PBS przez igłę co najmniej 3 razy.
  3. Po dysocjacji mechanicznej komórki łożyska należy przechowywać w 2-5 ml roztworu kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny.
  4. Kilkakrotnie przepuszczaj komórki przez igły 20-25 G zamontowane na strzykawkach o pojemności 5 ml w celu dalszej mechanicznej dysocjacji komórek łożyska.
  5. Filtruj zawiesiny pojedynczych komórek przez sitka do komórek 70 μm.
  6. Policz komórki za pomocą hemocytometru i naświetlaj pod ciśnieniem 2,000 cGy w celu inaktywacji mitotycznej20.
  7. Do 10-centymetrowego naczynia dodać 10 ml pożywki do hodowli krwiotwórczych uzupełnionych 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml Flt3L, 20 ng/ml IL-3, 20 ng/ml IL-6 i 10 ng/ml trombopoetyny (TPO).
    UWAGA: Na tym etapie DOX nie jest wymagany.
  8. Umieść filtr 0,65 μm bezpośrednio na pożywce do hodowli hematopoetycznych w naczyniu, pozwalając mu unosić się na wodzie, tworząc granicę faz ciecz-gaz i odłóż naczynie na bok.
  9. Dysocjuj transdukowane MEF-y dnia 25 (pochodzące z kroku 3.11) zgodnie z opisem w krokach 3.8-3.10 i wymieszaj 33 000 transdukowanych MEF ze 167 000 komórek agregatów łożyskowych z kroku 4.6 (stosunek 1:6).
  10. Aby wytworzyć agregat18,21, najpierw odwiruj mieszaninę MEF i komórek łożyska z kroku 4.9 przez 5 minut przy 300 x g. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić granulowane komórki w 30-50 μl standardowego DMEM za pomocą pipety P200, wciągając zawiesinę pojedynczej komórki do niefazowanej końcówki pipety o objętości 200 μl.
  11. Zatkać końcówkę pipety folią parafinową. Umieść zablokowaną końcówkę w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez 5 minut przy 300 x g, aby na zakrytym końcu końcówki utworzył się osad
    12. .
  12. Ostrożnie wyjmij końcówkę z probówki o pojemności 15 ml i umieść końcówkę na końcu pipety P200. Wyrzucić folię parafinową i wycisnąć osad komórkowy na filtr pływający z kroku 4.8.
    UWAGA: Płytka co najwyżej 3 agregaty na filtr.
  13. Hodować agregaty na pływających filtrach 0,65 μm przez 4-5 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  14. Zebrać agregaty (maksymalnie 3 na filtr) za pomocą skrobaka do komórek, połączyć je i trawić 0,2% kolagenazą, postępując zgodnie z tym samym protokołem, co w przypadku całych łożysk w celu dysocjacji komórek (kroki 4.2-4.5).
  15. Po dysocjacji przemyć agregaty 2-5 ml PBS uzupełnionego 5% FBS i odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 min.
  16. Zawiesić agregaty w 500 μl DMEM bez FBS, P/S lub L-GLUT. Pobrać tę 500 μl zawiesiny i dodać ją do 3 ml 1% pożywki metylocelulozowej uzupełnionej 10 ng/ml TPO, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków. Płytkę o równych objętościach tej mieszaniny umieścić na 3 niepoddanych działaniu substancji szalkach hodowlanych o wymiarach 35 x 10 mm do oznaczaniaCFU 12.
  17. Jako kontrolę, hodowla napromieniowanych agregatów łożyskowych bez mieszania z przeprogramowanymi MEF 4-5 dni i umieszczenie w testach CFU, jak opisano powyżej w krokach 4.7-4.16.
    UWAGA: Te agregaty same w sobie nie tworzą kolonii.
  18. Kolonie krwiotwórcze należy policzyć ręcznie pod mikroskopem po 10-14 dniach hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  19. Cytospin22 wybrał kolonie, aby pokazać fenotyp morfologiczny pojedynczych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hematopoeza jest złożonym procesem rozwojowym, który rozpoczyna się w różnych miejscach embrionalnych. W miejscach tych znajdują się hemogenne komórki śródbłonka, z których poprzez pączkowanie powstają HSC23. Proces ten nie może być obecnie odtworzony poprzez hodowlę HSC lub prekursorów hematopoetycznych, co sprawia, że niezbędna jest metodologia umożliwiająca pozyskanie tych komórek in vitro, albo poprzez ekspansję HSPC ex vivo, albo ich generowanie de no...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie HSPC de novo z łatwo dostępnych komórek somatycznych oferuje unikalną metodę badania hematopoezy in vitro oraz możliwość potencjalnego zastosowania tej technologii w organizmie człowieka. To tłumaczenie pozwoliłoby na stworzenie nowego narzędzia do badania ludzkich chorób hematologicznych w naczyniu, a także dostarczyłoby platform do testowania leków i możliwości celowania genów w celu leczenia wielu zaburzeń za pomocą nowatorskich terapii lub przeszczepów HSC. W tej dziedzinie niedawne bada...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem NHLBI dla K.M. i I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira był laureatem stypendium Revson Senior Biomedical Fellowship. Wyrażamy wdzięczność Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility oraz S. D'Souza za pomoc w przygotowaniu materiałów i protokołów. Dziękujemy również ośrodkom Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics i Mysi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMInvitrogen11965-092
0.45 μ Filtry MCorning430625
Filtry odśrodkowe Amicon UltraMilliporeUFC900324
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140-122
L-GlutaminaInvitrogen25030-081
FBSGemini's Benchmark100-106
PBSLife Technologies14190-144
Igły 18 GBD305195
Igły 20 GBD305175
Igły 25 GBD305125
Kolagenaza Typ ISigmaC0130-100MG
TrypLE ExpressInvitrogen12605-010
Pożywka mielokultycznaTechnologie komórek macierzystychM5300
SCFR & D Systems455-MC
Flt3LR & D Systems427-FL
IL-3R & D Systems403-ML
IL-6R & D Systems406-ML
TPOR & D Systems488-TO
DoksycyklinaSigmaD9891-1G
Polibren (bromek heksadimetryny)SigmaAL-118
Durapore 0,65 μ Filtry membranowe MMilliporeDVPP14250
Medie metylocelulozoweTechnologie komórek macierzystychMethocult M3434
HydrokortyzonTechnologie komórek macierzystych07904
C57BL/6 MyszyLaboratorium Jacksona000664
ŻelatynaSigmaG-1890 100g
pFUW-tetOAddgenePlazmid #20321
Gata2OrygenezaMR226728
Gfi1bOrigeneMR204861
cFos Plazmid Addgene#19259
Etv6OrigeneMR207053
psPAX2Plazmid Addgene#12260
pMD2.GPlazmid Addgene#12259
CaCl2SigmaC5670-100g
FUW-M2rtTAPlazmid Addgene#20342
Kultura 35 mm x 10 mm naczyniaThermo Scientific171099

Bibliografia

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nadekspresja czynnika transkrypcyjnegoindukcja programu hemogennegokom rki prekursorowe uk adu krwiotw rczegoprzej cie r db onkowe w krwiotw rczeGata2 Gfi1b cFos Etv6myszy CD34 tTA TetO H2BGFPtest CFU w metyloceluloziehodowla agregat w o yskowychsystem indukowalny DOX

Powiązane artykuły