Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów (PDTX) stanowią niezbędną platformę ułatwiającą opracowywanie leków przeciwnowotworowych przed badaniami na ludziach. Ludzkie fragmenty guza są wstrzykiwane podskórnie nagim myszom atymicznym (z obniżoną odpornością, z niedoborem limfocytów T) w celu stworzenia banku guzów, a następnie są przenoszone do różnych pokoleń myszy w celu utrzymania tych guzów przed pacjentami. Co ważne, heterogeniczność komórkowa pierwotnego guza jest ściśle naśladowana w tym modelu, który zapewnia bardziej istotny klinicznie model do oceny badań skuteczności leków (pojedynczy lek i kombinacja), analizy biomarkerów, szlaków oporności i biologii nowotworowych komórek macierzystych. Niektóre ograniczenia modelu PDTX obejmują zastąpienie zrębu ludzkiego zrębem myszy po pierwszym pokoleniu u myszy, niemożność zbadania wpływu leczenia na przerzuty z powodu podskórnych wstrzyknięć guzów oraz brak oceny immunoterapii z powodu stosowania myszy z obniżoną odpornością. Jednak nawet przy tych ograniczeniach model PDTX stanowi potężną platformę przedkliniczną w procesie odkrywania leków.
Wprowadzenie
Rak jelita grubego (CRC) stanowi istotny wkład w liczbę zgonów z powodu nowotworów w Stanach Zjednoczonych. W 2015 roku szacowano, że wystąpiło 132 700 nowych przypadków CRC, z czego 49 700 zakończyło się śmiercią 1. Chociaż rokowania u pacjentów z chorobą ograniczoną do miejsca wystąpienia są doskonałe, pacjenci w stadium zaawansowanym mają złe wyniki leczenia, co czyni opracowanie nowych terapii priorytetem. Mimo stosowania standardowych schematów chemioterapii oraz nowszych leków biologicznych w walce z tą chorobą, odnotowano jedynie niewielki wzrost przeżywalności całkowitej. W związku z tym podejmowane są znaczące wysiłki w celu zrozumienia szlaków sterujących, które ułatwiają wzrost guza w tej chorobie. Sieć The Cancer Genome Atlas zidentyfikowała niedawno liczne główne szlaki uwikłane w dysregulację CRC, do których należą: WNT, fosfoinozytydo-3-kinaza (PI3K), RAS, czynnik wzrostu transformującego-β (TGF-β) oraz TP53 2. Razem z badaniami opisującymi inne szlaki potęgujące wzrost w CRC, zapoczątkowało to rozwój nowszych terapii mających na celu znaczną poprawę przeżywalności w tej populacji pacjentów 3-5. Wykorzystanie modeli przedklinicznych w opracowywaniu leków onkologicznych było w tym procesie niezbędne do przewidzenia aktywności klinicznej tych nowych związków.
W procesie opracowywania leków wykorzystywano różne modele przedkliniczne. Biorąc pod uwagę, że przedkliniczne modele zwierzęce transgeniczne oraz unieśmiertelnione linie komórkowe okazały się nieskuteczne w określaniu aktywności klinicznej nowych terapii onkologicznych, głównie ze względu na ich niezdolność do odzwierciedlenia złożoności ludzkich nowotworów, opracowano modele ksenoprzeszczepów guzów pochodzących od pacjentów (PDTX). Największą zaletą tego modelu jest zachowanie heterogeniczności guza, która ściśle odzwierciedla charakterystykę molekularną i klonalność guza pierwotnego u pacjenta 6-9. Modele PDTX stanowią doskonałą przedkliniczną platformę in vivo do badania nowych czynników terapeutycznych, szlaków oporności na leki, strategii skojarzonych oraz biologii komórek macierzystych nowotworów 10.
Ogólny przegląd procesu PDTX przedstawiono na Rysunku 1. Rozpoczyna się on w klinice, gdzie pacjenci wyrażają zgodę na wykorzystanie części nadmiarowej tkanki guza do celów badawczych. Następnie, podczas operacji, fragment guza zostaje pobrany przez patologa i umieszczony w medium w celu transportu do personelu badawczego. Bezpośrednio po tym fragment guza zostaje pocięty na małe kawałki i wszczepiony podskórnie immunodeficyjnym myszom. Po wzroście guza jest on przenoszony do kolejnych generacji myszy w celu jego utrzymania10. Zazwyczaj po generacji F3 guz może zostać powielony w badaniu terapeutycznym, w którym ocenia się nowe związki i/lub terapie skojarzone. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji (Exome Seq, RNA Seq i macierz SNP), odkrywa się potencjalne biomarkery prognostyczne, które pomagają w wyborze pacjentów mogących odnieść korzyść z konkretnego leczenia.
Głównymi celami wykorzystania modeli PDTX są: 1) ocena skuteczności nowych terapii jako monoterapii lub w skojarzeniu oraz 2) identyfikacja biomarkerów prognostycznych wrażliwości lub oporności przed badaniami klinicznymi. W niniejszym manuskrypcie przedstawiamy metodologię tworzenia i utrzymywania banku PDTX w raku jelita grubego (CRC) oraz omawiamy zalety i ograniczenia tego modelu w procesie odkrywania leków.
Rycina 1. Przegląd protokołu modelu CRC PDTX. Guz pochodzący od pacjenta zostaje pobrany podczas operacji i niezwłocznie wstrzyknięty podskórnie myszom nago athymicznym. Po wzroście guza jest on powielany w kolejnych generacjach i ostatecznie rozszerzany na potrzeby badań nad leczeniem. Ocenia się odpowiedzi na leczenie i identyfikuje predykcyjne biomarkery, które mogą pomóc w doborze pacjentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Próbki guza gruczolakoraka jelita grubego pobrane od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę, zostały pobrane od pacjentów w Szpitalu Uniwersytetu Kolorado zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Colorado Multiple Institutional Review Board (08-0439). Wszystkie prace na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami na zwierzętach zatwierdzonymi przez University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Protokół # 51412(06)1E i 96813(04)1E).
1. Przyjmowanie i przygotowywanie krwi pacjenta
- Zebrać 1 - 2 ml krwi do probówki do separacji krwi/komórek zawierającej cytrynian sodu (fazy probówki obejmują osocze, limfocyty i pasmo monocytów, płyn gradientu gęstości, barierę żelową oraz erytrocyty i neutrofile). Uwaga, postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi patogenów przenoszonych przez krew z krwią lub tkankami.
Uwaga: PBMC i osocze mogą być wykorzystane w przyszłych badaniach, które mogą obejmować: porównanie zmienności genetycznej linii zarodkowej z mutacjami nowotworowymi, izolację krążących komórek nowotworowych, ocenę wolnego DNA komórkowego (cfDNA), badanie białek i mikroRNA itp. - Odwirować probówkę do separacji krwi/komórek o stężeniu 2 500 x g przez 15 minut bez hamowania przy temperaturze pokojowej.
- Zebrać jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC w limfocytach i pasmie monocytów probówki) i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (przezroczystej, autoklawowalnej, wolnej od DNaz, RNaz i pirogenów) i napełnić do góry probówki sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Wirować przy 2 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby na dnie probówki uformować osad PBMC. Następnie ostrożnie usunąć supernatant. Dodać 1 ml sterylnego PBS do przepłukania osadu i odwirować przy 3 000 x g przez 30 sekund, a następnie usunąć supernatant.
- Za pomocą pipety pobrać osocze z probówki do separacji krwi/komórek (w fazie plazmowej probówki) do sterylnej fiolki kriogenicznej o pojemności 1,5 ml (bez DNaz i RNaz, bez ludzkiego DNA, bez endotoksyn) i umieść osocze i osady PMBC w zamrażarce o temperaturze -80 °C do przechowywania.
2. Przyjmowanie i przygotowywanie próbki guza pacjenta
- Przygotować pożywkę RPMI lub DMEM z 1:100 (10%) penicyliny-streptomycyny i aminokwasów endogennych, 1:1000 (1%) plazmocyny i 10% inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (kompletna pożywka) i dodać 20 - 25 ml do sterylnego kubka zbiorczego dla próbki guza.
- Pobrać próbkę guza do sterylnego kubka zawierającego kompletną pożywkę na lodzie lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
Uwaga: Próbka guza to fragment nadmiaru tkanki nowotworowej pacjenta, który jest usuwany przez chirurga, przetwarzany przez patologa i umieszczany w sterylnym kubku zbiorczym z kompletnym podłożem. Ostrożnie, postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi patogenów przenoszonych przez krew z krwią lub tkankami. Ponadto, najlepiej wstrzyknąć pięć myszy, guz powinien mieć około 1 cm³. - Przynieś próbkę guza do zakładu dla zwierząt w celu wstrzyknięcia myszom z obniżoną odpornością.
Uwaga: Najlepiej jest przetworzyć próbkę guza tak szybko, jak to możliwe.- W kapturze z przepływem laminarnym umieść próbkę guza w sterylnym plastikowym naczyniu do krojenia z kubka guza. Za pomocą autoklawowanych małych nożyczek i kleszczyków pokrój na 10 - 12 kawałków o wymiarach około 3 x 3 x 3 mm i umieść w autoklawowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej 300 μl galaretowatego roztworu mieszaniny białek. Trzymaj probówkę na lodzie.
- W pierwszej kolejności wstrzyknij guz myszom, ale jeśli pozostał jakiś guz, zbierz zamrożone fiolki (FF), kubki z zatopioną parafiną w formalinie (FFPE) i żywą fiolkę z guzem.
- W przypadku FF należy pobrać małe kawałki tkanek nowotworowych ze sterylnej fiolki kriogenicznej w celu dalszej analizy, takiej jak izolacja białka, RNA lub DNA. Umieść FF natychmiast w ciekłym azocie Dewara i przechowuj przez długi czas w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- W przypadku FFPE, jeśli guza jest wystarczająco, umieść 3 małe kawałki w kubku o pojemności 10 ml 10% formaliny i przetwórz na bloki zatopione w parafinie, gdy guz będzie w formalinie przez co najmniej 24 godziny.
Uwaga: 24 godziny są oparte na naszych podstawowych sugestiach histologicznych 11. - Na koniec umieść pozostały guz w probówce kriogenicznej. Wytwarzać żywotne podłoża, dodając 10 % sulfotlenku dimetylu (DMSO) do kompletnych pożywek. Następnie dodaj 1 ml do probówki kriogenicznej i przechowuj na lodzie. Uwaga: Nie trzymaj na lodzie przez dłuższy czas.
- Pokrój resztki guza na małe kawałki, które w idealnym przypadku wystarczą do wstrzyknięcia 10 guzów 5 myszom w przyszłości. Następnie umieść żywą rurkę nowotworową na lodzie, aż będzie można ją umieścić w pojemniku do zamrażania z alkoholem izopropylowym (powoli zamraża guz 1 °C na raz) i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby upewnić się, że guzy nie umrą podczas procesu zamrażania.
Uwaga: W celu długotrwałego przechowywania guzy są usuwane (po 2 - 3 dniach) i umieszczane w dużym dewarze z ciekłym azotem. Należy pamiętać, że żywe probówki nie powinny być dopuszczone do rozmrożenia, chyba że są wyjmowane w celu wstrzyknięcia myszom.
- Pokrój resztki guza na małe kawałki, które w idealnym przypadku wystarczą do wstrzyknięcia 10 guzów 5 myszom w przyszłości. Następnie umieść żywą rurkę nowotworową na lodzie, aż będzie można ją umieścić w pojemniku do zamrażania z alkoholem izopropylowym (powoli zamraża guz 1 °C na raz) i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby upewnić się, że guzy nie umrą podczas procesu zamrażania.
3. Wstrzykiwanie ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjenta
- Użyj pięciu 6-8 tygodniowych samców i / lub samic nagich myszy atymicznych (z niedoborem komórek T) dla każdego oddzielnego guza pochodzącego od pacjenta. Wstrzyknij łącznie 10 guzów (2 wstrzyknięcia na mysz) podskórnie (SQ).
Uwaga: Pierwotny ludzki guz jest oznaczony jako F0, a następnie po wstrzyknięciu myszom następne pokolenie to F1. Używaj również autoklawowanych kleszczy, nożyczek i trokarów do każdego unikalnego eksplantatu. - Załaduj kawałki guza z galaretowatego roztworu mieszaniny białek do autoklawowanych trokarów 12 G i upewnij się, że guz jest całkowicie wepchnięty do trokaru.
- W sterylnym okapie z przepływem laminarnym umieść 5 myszy w komorze anestezjologicznej, która jest podłączona do aparatu do znieczulania Isoflurane (uruchomionego z początkową dawką 5% izofluranu, 3-4% tlenu i 2-3% izofluranu w celu utrzymania znieczulenia) i filtra węglowego (pochłania nadmiar gazu).
Uwaga: Doświadczony technik powinien być w stanie wykonać całą procedurę na klatce składającej się z 5 myszy w ciągu około 5 minut (około 30 sekund na mysz). Dlatego na ogół nie stosuje się dodatkowego wsparcia termicznego i smarowania oczu. W przypadku osób mniej doświadczonych lub podczas treningu zdecydowanie zaleca się, aby osoby wykonywały zabieg na mniejszej liczbie zwierząt jednocześnie i/lub używały podkładki rozgrzewającej/smarowania oczu podczas zabiegu, jeśli zwierzęta będą znieczulone dłużej niż 5 minut. Procedura jest oparta na standardach IACUC na naszej uczelni.
- W sterylnym okapie z przepływem laminarnym umieść 5 myszy w komorze anestezjologicznej, która jest podłączona do aparatu do znieczulania Isoflurane (uruchomionego z początkową dawką 5% izofluranu, 3-4% tlenu i 2-3% izofluranu w celu utrzymania znieczulenia) i filtra węglowego (pochłania nadmiar gazu).
- Ściśnij palec myszy u nogi, aby upewnić się, że mysz nie reaguje, a następnie wyjmij mysz z pudełka z izofluranem. Umieść mysz na czystym polu, aby wstrzyknąć guzy w środkowej okolicy szyi grzbietowej i przesuwaj trokar podskórnie w dół, aż do obszaru bocznego za pomocą autoklawowanych trokarów 12 G.
- Dostarcz jeden guz podskórnie po każdej stronie boku myszy. Uszczypnij guz, gdy trokar zostanie wyciągnięty, upewniając się, że guz pozostaje w pożądanym obszarze boku. Galaretowata mieszanina białek twardnieje wraz z temperaturą ciała myszy i otacza guz przez około 1 tydzień, aby pomóc guzowi rosnąć i przymocować go do tkanki łącznej SQ. Zmiana wykonana przez trokar nie jest większa niż 4 mm i nie ma potrzeby zamykania skóry zszywkami.
Uwaga: Nasi weterynarze stwierdzili, że nie ma potrzeby zamykania na podstawie bardzo małego rozmiaru zmiany, szybkiego czasu gojenia (środkowa część grzbietu szyi zmniejsza napięcie skóry lub pielęgnację zmiany), nie stwierdzono żadnych infekcji i ścisłego monitorowania zwierząt w tym okresie.
- Dostarcz jeden guz podskórnie po każdej stronie boku myszy. Uszczypnij guz, gdy trokar zostanie wyciągnięty, upewniając się, że guz pozostaje w pożądanym obszarze boku. Galaretowata mieszanina białek twardnieje wraz z temperaturą ciała myszy i otacza guz przez około 1 tydzień, aby pomóc guzowi rosnąć i przymocować go do tkanki łącznej SQ. Zmiana wykonana przez trokar nie jest większa niż 4 mm i nie ma potrzeby zamykania skóry zszywkami.
- Zanim mysz całkowicie się obudzi, wstrzyknij meloksykam 2 mg/kg SQ (lek przeciwbólowy) z dala od miejsca wstrzyknięcia guza. Następnie umieść mysz w klatce i monitoruj, aż mysz się obudzi i zacznie się poruszać.
Uwaga: Nie pozostawiaj powracających do zdrowia zwierząt bez opieki, dopóki nie zostanie w pełni obudzony. Dawkowanie meloksykamu jest oparte na standardach IACUC na naszej uczelni.- Następnie powtórz tę samą procedurę z 4 pozostałymi myszami i monitoruj ich oddech.
Uwaga: Należy pamiętać, że jest to bardzo szybka procedura i myszy budzą się bardzo szybko po wstrzyknięciu meloksykamu, ale w razie potrzeby dostosuj izofluran. Za każdym razem, gdy mysz jest wyjmowana, wyłącz Isoflurane. Meloksykam będzie trwał 24 godziny, a zmiany z trokarów w pełni zagoją się w ciągu 1 tygodnia.
- Następnie powtórz tę samą procedurę z 4 pozostałymi myszami i monitoruj ich oddech.
4. Utrzymanie Banku Ksenoprzeszczepów Nowotworowych pochodzących od Pacjentów
- Monitoruj wzrost i zdrowie myszy co najmniej raz w tygodniu. Użyj arkusza kalkulacyjnego (lub innego systemu śledzenia), aby śledzić rozmiary guza, powstawanie guza, datę wstrzyknięcia guza i stan zdrowia myszy.
Uwaga: Jeśli myszy straciły 15% swojej pierwotnej masy ciała, niskie wyniki kondycji ciała (≥ 2), mają owrzodzenia guza, guzy osiągające 2,000 mm3 lub całkowite guzy 3,000 mm3 lub są chore (zgarbione, zimne, ospałe itp.) w jakikolwiek sposób, myszy są uśmiercane za pomocą CO₂ lub znieczulane, a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metoda wtórna. Eutanazja przez znieczulenie i zwichnięcie szyjki macicy w przypadku pobrania guza, w przeciwnym razie myszy są uśmiercane za pomocą CO₂ i zwichnięcia szyjki macicy. - Gdy guz ma około 1500-2000 mm3 należy znieczulić myszy, jak opisano powyżej, a następnie wykonać zwichnięcie szyjki macicy w celu eutanazji.
- Sprawdź, czy mysz nie ma bicia serca. Wytnij guz SQ za pomocą autoklawowanych nożyczek i kleszczy.
UWAGA: Pozwól guzom rosnąć przez okres do 1 roku, a jeśli nie widać guza, poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną. - Przejście najlepiej rosnącego guza do następnego pokolenia (czyli nowego zestawu 5 myszy). Skorzystaj z powyższych instrukcji, aby zebrać 10 - 12 guzów do przejścia, a następnie zebrać pozostały guz, jak również opisano powyżej.
Uwaga: Zbieranie wielu żywotnych probówek jest bardzo ważne we wczesnych generacjach (F1 - F8); dlatego zbierz kilka żywotnych probówek, probówek FF i 1 FFPE na pokolenie. - Trzymaj pozostałe myszy do momentu, gdy nowe pokolenie myszy osiągnie wzrost guza około 300 mm3. Gdy pozostałe myszy mają duże guzy, kontynuuj zbieranie, jak opisano powyżej.
- Sprawdź, czy mysz nie ma bicia serca. Wytnij guz SQ za pomocą autoklawowanych nożyczek i kleszczy.
- Kontynuuj pasaż guzów i zbieraj na każdym etapie aż do F15. W tym momencie weź żywą rurkę najwcześniejszej możliwej generacji z ciekłego azotu i pozwól jej rozmrozić się na lodzie, a następnie postępuj zgodnie z procedurami wstrzykiwania guza opisanymi powyżej.
Uwaga: Guzy, które wyrastają z żywotnych rurek, potrzebują więcej czasu, aby rosnąć u myszy w porównaniu do przechodzenia z pokolenia na pokolenie, więc należy o tym pamiętać podczas planowania. Jeśli dany model PDTX nie jest już potrzebny przy żadnym pasażu, poddaj go eutanazji i zbierz guz, aby zapewnić pobranie wielu żywych probówek do wykorzystania w przyszłości.
5. Terapie rozwojowe z ksenoprzeszczepami nowotworowymi pochodzącymi od pacjentów
Uwaga: Większość nowotworów generacji F3 ma dobrą kinetykę wzrostu (rośnie szybciej i bardziej konsekwentnie), dlatego należy przejść do badań skuteczności leków PDTX.
- Gdy pożądany guz jest bardzo duży (1,500 - 2,000 mm3), postępuj zgodnie z powyższymi procedurami, aby zebrać guz, aby rozszerzyć się do pożądanej ilości myszy.
- W zależności od testowanej hipotezy należy określić liczbę guzów potrzebnych na grupę leczoną.
Uwaga: 1 ml galaretowatego roztworu mieszaniny białek może w przybliżeniu zmieścić 30 małych kawałków guza (w zależności od morfologii guza) do wstrzyknięcia myszom.
- W zależności od testowanej hipotezy należy określić liczbę guzów potrzebnych na grupę leczoną.
- Sprawdzaj myszy z guzami co tydzień, a gdy większość guzów jest widocznie mała (w przybliżeniu między 50 a 300 mm³), zmierz guzy suwmiarką, aby określić objętość guza. Objętość guza = [szerokość² (najmniejszy pomiar) x długość (największy pomiar)] x 0,52,
Uwaga: Galaretowaty roztwór mieszaniny białek otacza wstrzyknięte kawałki guza przez tydzień, a po tygodniu wzrost guza będzie dokładny. - Użyj objętości guza w zakresie od 50 do 300 mm³, a następnie uśrednij lewy i prawy guz. Następnie losowo podziel się na grupy terapeutyczne z 10 guzami na grupę i średnią grupy w odległości kilku liczb od siebie. Następnie posortuj myszy w grupy i rozpocznij pożądane badanie leczenia.
- Podawaj myszom lek (harmonogram zależny od leku), waż i mierz (guz) dwa razy w tygodniu. Pod koniec badania należy poddać myszy eutanazji za pomocą znieczulenia i zwichnięcia szyjki macicy, a następnie pobrać guz do przyszłej analizy farmakodynamicznej w laboratorium.
Uwaga: Badanie trwa 30 dni w zależności od wielkości guza pojazdu i stanu zdrowia myszy.
6. Organizacja banku PDTX
- Zachowaj dobrze udokumentowany formularz, aby zapobiec powtarzaniu badań i właściwemu wykorzystaniu zwierząt.
UWAGA: Jest to klucz do sukcesu banku PDTX.- Korzystaj z arkuszy kalkulacyjnych, aby śledzić guz od pacjenta w klinice, do myszy w banku PDTX, leczenia, danych i tego, co jest zbierane. Uwaga: obejmuje to również zamrażarkę, dewary z ciekłym azotem i przechowywanie FFPE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podobieństwa powszechnych mutacji w modelach PDTX CRC oraz w TCGA
Zbadaliśmy, czy odsetek powszechnych mutacji (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 i TP53) w banku PDTX CRC jest reprezentatywny dla częstości mutacji obserwowanej w populacji pacjentów z CRC. Jak pokazano na Rysunku 2A (TCGA) oraz B (bank PDTX CRC), częstość mutacji w tych genach była bardzo podobna pom...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Platforma PDTX do odkrywania leków oferuje ulepszony model niedociągnięć innych modeli przedklinicznych, które są niewiarygodne w przewidywaniu aktywności klinicznej nowych związków. Co ważne, nowotwory w tym modelu są biologicznie stabilne, zachowują potencjał przerzutowy i wykazują podobną reakcję na leki z pokolenia na pokolenie. W tym modelu guzy pochodzące od pacjentów są wstrzykiwane nagim myszom atymicznym, pasażowane, a następnie wykorzystywane w ocenie terapeutycznej. Istnieje kilka krytycznych kroków dla udaneg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant 1R01CA152303-01.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI lub DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicylina-Streptomycyna | Corning | 30-002-CI | |
| Aminokwasy endogenne | Corning | 25-025-CI | |
| Surowica bydlęca | płodu Corning | 35-010-CV | Rozmrażanie w -4 & stopni; C, a następnie aktywuj na 30 minut przy 60 & stopni; C Kąpiel wodna |
| CPT probówka do krwi | Vacutainer BD | 362761 | |
| Probówka do mikrowirówek | Surelock | A-7002 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Corning | 21-040-CV | |
| Fiolki cyrogeniczne | Cyroking | C0732901 | |
| Plastikowe naczynie do wycinania guzów | Trueline | TR4001 | |
| Nożyczki | Roboz | RS-5881 | |
| Kleszcze | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (galaretowata mieszanina białek) | Corning | 354234 | Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C, następnie rozmrozić na lodzie, nie zostawiać w RT |
| 10% kubki z formaliną | Protokół | 032-059 | |
| Termolyne | przechowywania ciekłego azotu Dewara | CY50900 | |
| Przenośny ciekły azot dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Pojemnik do zamrażania: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Alkohol izopropylowy | Decon | 64-17-5 | |
| Trokary | Innowacyjne badania Ameryki | MP-182 | |
| Maszyna anestezjologiczna | Patterson Weterynaryjne | ||
| pudełko anestezjologiczne | Patterson Weterynaryjny | ||
| izofluran | Weterynarz jeden | 1038005 | |
| Kanister F-Air | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Zaciski | Fowler | 54-100-167 | |
| Waga | Ohaus | Scout Pro SP601 |
Bibliografia
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109 (3), 667-675 (2013).
- Hubbard, J., Grothey, A. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer. Curr Opin Oncol. 22 (4), 374-380 (2010).
- van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435 (7044), 959-963 (2005).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18 (19), 5314-5328 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. , American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
- Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18 (9), 2704-2714 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138 (1), 195-205 (2016).
- Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16 (16), 4165-4177 (2010).
- Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6 (33), 34561-34572 (2015).
- Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35(2013).
- Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136 (8), 1967-1975 (2015).
- Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9 (12), 3351-3362 (2010).
- Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3 (6), 658-673 (2013).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1 (6), 508-523 (2011).
- Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120(2015).
- Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18 (4), 1051-1062 (2012).
- Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9 (11), e113037(2014).
- Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).
- Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).
- Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).
- Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).
- Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
