Artykuł metodologiczny

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

DOI:

10.3791/54397

⸱

13 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urządzenia mikroprzepływowe są w stanie stworzyć precyzyjne i kontrolowane mikrośrodowisko komórkowe o pH, temperaturze, stężeniu soli i innych fizycznych lub chemicznych bodźcach. Są one powszechnie stosowane do badań komórkowych in vitro, zapewniając otoczenie podobne do in vivo. Zwłaszcza sposób, w jaki komórki reagują na gradienty chemiczne, pola elektryczne i naprężenia ścinające, przyciągnął wiele zainteresowań, ponieważ zjawiska te są ważne dla zrozumienia właściwości i funkcji komórek. Te chipy mikroprzepływowe mogą być wykonane z podłoży szklanych, wafli krzemowych, polimerów polidimetylosiloksanu (PDMS), podłoży z polimetakrylanu metylu (PMMA) lub podłoży z polietylenu eteroftalanu (PET). Spośród tych materiałów podłoża PMMA są tanie i można je łatwo obrabiać za pomocą ablacji laserowej i pisania. Chociaż kilka urządzeń mikroprzepływowych zostało zaprojektowanych i wyprodukowanych do generowania wielu, współistniejących bodźców chemicznych i elektrycznych, żadne z nich nie zostało uznane za wystarczająco skuteczne w zmniejszaniu liczby powtórzeń eksperymentalnych, szczególnie do celów przesiewowych. W tym raporcie opisujemy nasz projekt i produkcję dwóch mikroprzepływowych chipów na bazie PMMA do badania odpowiedzi komórkowych w produkcji reaktywnych form tlenu i migracji pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających. Pierwszy chip generuje pięć względnych stężeń 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1 w regionach hodowli, wraz z gradientem naprężeń ścinających wytwarzanym w każdym z tych obszarów. Drugi chip generuje te same względne stężenia, ale z pięcioma różnymi natężeniami pola elektrycznego wytworzonego w każdym obszarze hodowli. Urządzenia te nie tylko zapewniają komórkom precyzyjne, kontrolowane mikrośrodowisko, ale także znacznie zwiększają przepustowość eksperymentalną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki in vivo są otoczone przez różne biomolekuły, w tym macierz zewnątrzkomórkową (ECM), węglowodany, lipidy i inne komórki. Funkcjonalizują się, reagując na bodźce mikrośrodowiskowe, takie jak interakcje z ECM i reakcje na gradienty chemiczne różnych czynników wzrostu. Tradycyjnie, badania komórkowe in vitro przeprowadza się w szalkach do hodowli komórkowych, gdzie zużycie komórek i odczynników jest duże, a komórki rosną w statycznym (niekrążącym) środowisku. Ostatnio mikrofabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami płynnymi zapewniły alternatywną platformę do badań nad komórkami w bardziej kontrolowany sposób. Takie urządzenia są w stanie stworzyć precyzyjne mikrośrodowisko bodźców chemicznych i fizycznych, jednocześnie minimalizując zużycie komórek i odczynników. Te chipy mikroprzepływowe mogą być wykonane z podłoży szklanych, wafli krzemowych, polimerów polidimetylosiloksanu (PDMS), podłoży z polimetakrylanu metylu (PMMA) lub podłoży z politylenetereftalanu etylenu (PET) 1-3. Urządzenia oparte na PDMS są przezroczyste, biokompatybilne i przepuszczalne dla gazów, dzięki czemu nadają się do długotrwałych hodowli komórkowych i badań. Podłoża PMMA i PET są tanie i łatwe w obróbce za pomocą ablacji laserowej i pisania.

Urządzenia mikroprzepływowe powinny zapewnić komórkom stabilne i kontrolowane mikrośrodowisko, w którym komórki są poddawane różnym bodźcom chemicznym i fizycznym. Na przykład chipy mikroprzepływowe są używane do badania chemotaksji komórek. Zamiast tradycyjnych metod, które wykorzystują komorę Boydena i kapilarnę 4,5, te zminiaturyzowane urządzenia fluidalne mogą generować precyzyjne gradienty chemiczne do badania zachowań komórek 1,6,7. Innym przykładem jest badanie kierunkowej migracji komórek pod wpływem pól elektrycznych (EF), zjawisko zwane elektrotaksją. Stwierdzono, że zachowania elektrotaktyczne komórek są związane z regeneracją nerwów8, rozwojem embrionalnym 9 i gojeniem się ran 10,11. Przeprowadzono wiele badań w celu zbadania elektrotaksji różnych typów komórek, w tym komórek rakowych 12,13, limfocytów 14,15, komórek białaczkowych 11 i komórek macierzystych 16. Tradycyjnie szalki Petriego i szkła nakrywkowe są używane do konstruowania komór elektrotaktycznych do generowania EFs 17. Takie proste układy stwarzają problemy związane z parowaniem medium i nieprecyzyjnymi EF, ale mogą być one przezwyciężone przez urządzenia mikroprzepływowe z zamkniętymi, dobrze zdefiniowanymi kanałami fluidycznymi 12,18,19.

Aby systematycznie badać reakcje komórkowe pod wpływem precyzyjnych, kontrolowanych bodźców chemicznych i elektrycznych, byłoby bardzo przydatne opracowanie urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do dostarczania komórkom wielu bodźców jednocześnie. Na przykład Li i wsp. opisano urządzenie mikroprzepływowe oparte na PDMS do tworzenia pojedynczych lub współistniejących gradientów chemicznych i EF 20. Kao i wsp. opracowano podobny chip mikroprzepływowy do modulowania chemotaksji komórek raka płuc za pomocą EFs 6. Ponadto, aby zwiększyć przepustowość, Hou i wsp. zaprojektował i wyprodukował wielokanałowy chip o podwójnym polu elektrycznym na bazie PMMA, aby zapewnić komórkom 8 różnych połączonych bodźców, tj. (2 siły EF x 4 stężenia chemiczne)21. Aby jeszcze bardziej zwiększyć przenikanie i dodać bodziec naprężeń ścinających, opracowaliśmy dwa urządzenia mikroprzepływowe na bazie PMMA do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Zgłoszone przez Lo et al. 22,23, urządzenia te zawierają pięć niezależnych kanałów hodowli komórkowych podlegających ciągłemu przepływowi płynów, naśladując układ krążenia in vivo. W pierwszym chipie (chipie naprężeń ścinających chemicznie lub chipie CSS) w regionach hodowli generowanych jest pięć stężeń względnych 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1, a w każdym z pięciu obszarów kultury wytwarzany jest gradient naprężeń ścinających. W drugim chipie (chipie chemiczno-elektrycznym lub chipie CEF), przy użyciu jednego zestawu elektrod i 2 pomp strzykawkowych, generowanych jest pięć mocy EF oprócz pięciu różnych stężeń chemicznych w tych obszarach hodowli. Obliczenia numeryczne i symulacje są wykonywane w celu lepszego zaprojektowania i obsługi tych chipów, a komórki raka płuc hodowane w tych urządzeniach są poddawane pojedynczym lub współistniejącym bodźcom w celu obserwacji ich reakcji w odniesieniu do produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), szybkości migracji i kierunku migracji. Wykazano, że chipy te są oszczędzającymi czas, wysokowydajnymi i niezawodnymi urządzeniami do badania, jak komórki reagują na różne bodźce mikrośrodowiskowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i produkcja chipów

  1. Rysuj wzory do ablacji na podłożach PMMA i taśmach dwustronnych za pomocą komercyjnego oprogramowania 24.
    1. Aby zbadać wpływ stężeń chemicznych i naprężeń ścinających, narysuj wzór "choinki" o różnej szerokości na końcu w każdym z pięciu obszarów hodowli (rysunek 1A i 1B).
    2. Aby zbadać wpływ stężeń chemicznych i pól elektrycznych, narysuj wzór "choinki" z dwoma bardziej płynnymi kanałami dla mostków solnych (Rysunek 2A i 2B).
  2. Narysuj indywidualny wzór na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej, ładując odpowiedni plik do rysika laserowego CO2.
    1. Włącz rysik laserowy i sprawdź jego połączenie z komputerem. Otwórz wzór, który ma zostać usunięty, za pomocą komercyjnego oprogramowania.
    2. Umieść arkusz PMMA lub taśmę dwustronną na stoliku rysika. W razie potrzeby wyreguluj ostrość lasera CO2 za pomocą paska kalibracyjnego i widocznego lasera He-Ne.
    3. Załaduj wzór do rysika w celu ablacji na arkuszu PMMA lub taśmie.
    4. Podnieś wzorzysty arkusz lub taśmę, usuń niechciane kawałki i oczyść powierzchnię za pomocą przedmuchiwania azotem.
      UWAGA: Grubość arkusza PMMA wynosi 1 mm, a taśmy dwustronnej 0,07 mm lub 0,22 mm.

2. Montaż chipów

  1. Za pomocą super kleju przymocuj adaptery akrylowe (długość x szerokość x wysokość = 10 mm x 10 mm x 5 mm, z gwintami śrubowymi pośrodku) do najwyższej warstwy chipa, wyrównując gwinty i otwory na najwyższej warstwie. Adaptery te służą jako średnie wloty/wyloty i łączniki mostka solnego.
  2. Zamontuj chip mikroprzepływowy w okapie z przepływem laminarnym.
  3. Zmontuj chip mikroprzepływowy z naprężeniem chemicznym (układ CSS).
    1. Przymocuj 3 arkusze przetartych arkuszy PMMA za pomocą 2 kawałków dwustronnej taśmy z traskami. (Rysunek 1A i 1B).
    2. Dodaj jeszcze jeden kawałek dwustronnej taśmy o grubości 0,07 mm do dolnej części chipa i przymocuj wiór do szalki Petriego o średnicy 10 cm.
    3. Umieść chip montażowy w komorze próżniowej na noc.
  4. Aby zmontować chip chemiczno-elektryczny (chip CEF), przymocuj arkusz PMMA do taśmy dwustronnej o grubości = 0,22 mm (rysunek 2A i 2B).
    1. Przymocuj narysowany arkusz PMMA i taśmę dwustronną do szalki Petriego o średnicy 10 cm za pomocą tego samego kawałka taśmy.
  5. Pozostaw zmontowany chip w okapie i wystawij go na działanie promieniowania UV przez 30 minut w celu sterylizacji.
  6. Podłączyć wloty do dwóch strzykawek o pojemności 3 ml za pomocą plastikowych rurek i nakrętek dokręcanych palcami. Podłącz wylot do rurki odpływowej za pomocą plastikowej rurki i nakrętki dokręcanej palcami.
    UWAGA: Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie probówki i nakrętki w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
  7. Powoli wcisnąć tłok na strzykawce, aby napełnić kanały płynowe PBS. Przesuwać strzykawki w przód i w tył, aby usunąć pęcherzyki.
  8. Umieścić wióry w inkubatorze na noc w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2,
    UWAGA: Te dwa kroki mają na celu umycie chipa i usunięcie wszelkich pozostałych pęcherzyków w chipie.
  9. Wyjmij chip z inkubatora.
  10. Przygotuj mostki soli agarowej do generowania pól elektrycznych w chipie CEF.
    1. Rozpuść 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1x buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) za pomocą kuchenki mikrofalowej.
    2. Wstrzyknąć agarozę w fazie roztworu do kanału mostka solnego i wprowadzić elektrody przed zestaleniem się roztworu.
    3. Umieść elektrody srebra/chlorku srebra w nakrętkach rurkowych.
  11. Podłączyć strzykawki do pomp strzykawkowych i w sposób ciągły przepływać pożywkę hodowlaną (pożywkę Modified Eagle firmy Dulbecco, DMEM) do kanału fluidycznego przez 10 minut z natężeniem przepływu 20 μl/min w celu zastąpienia PBS.

3. Przygotowanie komórek i konfiguracja eksperymentalna

UWAGA: Przed użyciem podgrzej 1x PBS, pożywkę hodowlaną (DMEM plus FBS) i trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.

  1. Płytka 2 x 105 komórek CL1-5 raka płuc25,26 na 10 cm szalce Petriego zaopatrzonej w DMEM plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze poniżej 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do 90% konfluencji.
  2. Odessać pożywkę i raz umyć komórki wstępnie podgrzanym 1x PBS. Dodać 2 ml 0,05% buforu trypsyny do komórek i odczekać 2 do 3 minut w temperaturze 37 °C, aby odłączyć komórki.
  3. Przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać do niej 6 ml pożywki hodowlanej. Delikatnie odwrócić probówkę do mieszania i wyjąć 5 μl pożywki zawierającej komórkę do zliczenia liczby komórek w hemocytometrze.
  4. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut. Zawiesić 10-6 komórek w 1 ml pożywki hodowlanej i umieścić pożywkę zawierającą komórki w strzykawce o pojemności 1 ml.
  5. Wlej pożywkę zawierającą komórkę do chipa mikroprzepływowego z wylotu i upewnij się, że roztwór rozprowadzi się w całości po pięciu obszarach hodowli. Inkubować chip w inkubatorze w temperaturze poniżej 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.

4. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Wyjmij chip z inkubatora i umieść go na przezroczystym grzejniku z tlenku indu i cyny (ITO).
    UWAGA: Szkło ITO jest podłączone do regulatora proporcjonalno-całkującego (PID) w celu utrzymania temperatury na poziomie 37 ± 0,5 °C poprzez sprzężenie zwrotne ze sprzęgła termicznego mocno zaciśniętego między grzałką ITO a chipem.
  2. Umieść zespół grzałki chipów na zmotoryzowanym stoliku XY odwróconego mikroskopu do śledzenia migracji komórek lub stałym stoliku XY odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do pomiaru produkcji ROS.
  3. Aby wytworzyć różne stężenia chemiczne, napełnij dwie strzykawki 5 ml roztworów chemicznych o względnych stężeniach 0 i 1 (rozpuszczonych w pożywce hodowlanej) i wpompuj je do chipa z żądaną szybkością przepływu: w chipie CSS przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min przez 1 godzinę; w chipie CEF przy natężeniu przepływu 20 μl/min przez pierwsze 20 minut i natężeniu przepływu 20 μl/ godz. przez kolejne 120 min (całkowity czas = 2 godz.).
  4. W chipie CEF, do śledzenia migracji komórek, zaprogramuj stolik XY mikroskopu tak, aby powtarzał robienie zdjęć za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej (DSLR) określonego pola widzenia (FOV) w obszarach hodowlanych co 15 minut przez 2 godziny.
  5. Do pomiaru produkcji RFT należy użyć wskaźnika opartego na fluorescencji dioctanu 2′-dichlorodihydrofluorescencji (2′-7′-DCFDA).
    1. Przygotować zapas 2′-7′-DCFDA w stężeniu 10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO) klasy biologii molekularnej. Rozcieńczyć DCFDA w DMEM tylko bez surowicy (5 μM w DMEM). Potencjalna deacetylaza może zwiększać sygnały tła i zmniejszać sygnały w komórkach.
    2. Po 1 godzinie bodźca naprężenia ścinającego w chipie CSS lub po 2 godzinach bodźca EF w chipie CEF, pompuj 2′-7′-DCFDA (5 μM w DMEM) do chipa z natężeniem przepływu 20 μl/min przez pierwsze 20 minut i natężeniem przepływu 20 μl/h przez kolejne 20 minut. Do mycia pompować DMEM do wióra z natężeniem przepływu 20 μl/h przez 20 minut.
    3. Rób zdjęcia, za pomocą kamery ze sprzężonym ładunkiem (CCD), niektórych pól widzenia w obszarach hodowli w celu analizy intensywności fluorescencji.

5. Obliczenia stężeń chemicznych, naprężeń ścinających i pól elektrycznych

  1. Zarówno w chipie CSS, jak i w chipie CEF oblicz stężenia chemiczne w pięciu obszarach hodowli. Na przykład poprzez wstrzykiwanieH2O2 o stężeniach 0 i 200 μM z dwóch wlotów, uzyskuje się stężenia 0, 25, 100, 175 i 200 μM.
    UWAGA: Zakładając, że wszystkie ciecze rozdzielają się płynnie i równomiernie wokół widelca, względne stężenia w pięciu obszarach hodowli wynoszą odpowiednio 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1.
  2. W chipie CSS oblicz naprężenie ścinające (τ) w każdym z obszarów hodowli za pomocą figure-protocol-1 27, gdzie Q to objętościowe natężenie przepływu, η to lepkość płynna, h to wysokość kanału, a w to szerokość kanału.
    UWAGA: Ustawiając Q = 0,3 ml/min w każdym wlocie (Q = 0,12 ml/min w każdym obszarze hodowli), η = 0,0008 Pa·s dla pożywki hodowlanej, h = 1 mm i w = 1 ~ 4 mm, naprężenie ścinające oblicza się w zakresie od 0,0048 Pa (obszar o szerokości 4 mm) do 0,0192 Pa (obszar o szerokości 1 mm).
  3. W chipie CEF oblicz siłę EF w każdym z obszarów hodowli, używając E = I/(σAeff) (prawo Ohma), gdzie I to prąd elektryczny przepływający przez kanał płynowy, σ to przewodność elektryczna pożywki hodowlanej, a Aeff to efektywna powierzchnia przekroju poprzecznego kanału.
    UWAGA: Przyjmując σ = 1,38 Ω-1 m-1 dla pożywki hodowlanej i Aeff = 0,22 mm2 (szerokość = 1 mm i wysokość = 0,22 mm), wytrzymałość EF oblicza się jako E (mV/mm) = I (A) × 3,3 × 106.
    1. Jak pokazano na rysunku 2D, traktuj obwód zastępczy jako pięć obwodów przekroju C z czterema (8 + 35 + 8) segmentami i jednym (5 + 35 + 5) segmentem.
      UWAGA: Analizując ten równoległy obwód zgodnie z prawem napięcia Kirchhoffa i prawem Ohma, prądy płynące przez pięć obszarów kulturowych, I1 do I5 od dołu do góry, oblicza się na około 0,49I (obszar 1), 0,25I (obszar 2), 0,13I (obszar 3), 0,08I (obszar 4) i 0,05I (obszar 5), odpowiednio, gdzie I jest całkowitym prądem stałym (dc). Przy przyłożonym prądzie stałym 0,157 mA, w pięciu obszarach hodowli generowane są EF 254, 130, 67, 41 i 26 mV/mm.
      UWAGA: W celu uproszczenia analizy elektrycznej sieci mikroprzepływowej wszystkie segmenty przepływów są traktowane jako rezystory o rezystancji proporcjonalnej do ich długości.

6. Analiza danych

Uwaga: Analiza danych jest wykonywana za pomocą oprogramowania ImageJ.

  1. Analizuj produkcję ROS.
    1. Uruchom oprogramowanie ImageJ. Przejdź do "Plik" → Otwórz, aby załadować obraz fluorescencyjny do analizy.
    2. Przejdź do "Obraz" → "Typ" → "16-bitowy", aby zmienić obraz na skalę szarości.
    3. Narysuj wielokąt, aby objąć komórkę. Przejdź do "Analizuj" → "Zmierz", aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji komórki.
    4. Powtórzyć czynności opisane w ppkt 6.1.3 w celu zebrania natężeń z co najmniej 50 komórek z trzech niezależnych doświadczeń i obliczyć średnią intensywność z błędem standardowym średniej (SEM).
    5. Powtórzyć czynności opisane w pkt 6.1.1-6.1.4 dla każdego warunku doświadczalnego.
  2. Analizowanie migracji komórek.
    1. Uruchom oprogramowanie ImageJ. Przejdź do "Plik" → Otwórz, aby załadować obraz zrobiony w czasie = 0 do analizy.
    2. Narysuj wielokąt, aby objąć komórkę. Przejdź do "Analizuj" → "Zmierz", aby zmierzyć środek masy komórki jako (x1, y1).
    3. Powtórz 6.2.1-6.2.2, aby zmierzyć środek masy tej samej komórki, co (x2, y2) z innego zdjęcia wykonanego w czasie = t.
    4. Oblicz szybkość migracji (w μm/h) tej komórki jako figure-protocol-2.
    5. Powtórzyć czynności opisane w pkt 6.2.1-6.2.4, aby zebrać wskaźniki migracji z co najmniej 50 komórek z trzech niezależnych eksperymentów i obliczyć średnią szybkość migracji z błędem standardowym średniej (SEM).
    6. Z 6.2.2 i 6.2.3 oblicz kierunkowość migracji tej komórki jako cosinus θ lub figure-protocol-3, gdzie θ jest kątem między wektorem zastosowanego EF (od dodatniego do ujemnego) a wektorem od pozycji początkowej do końcowej komórki (rysunek 2G).
    7. Powtórzyć ppkt 6.2.6, aby zebrać ukierunkowanie migracji z co najmniej 50 komórek z trzech niezależnych doświadczeń i obliczyć średnią ukierunkowanie migracji z błędem standardowym średniej (SEM).
    8. Obliczyć średni współczynnik migracji za pomocą SEM i średni ukierunkowanie migracji za pomocą SEM dla każdego warunku doświadczalnego.
      UWAGA: Kierunkowość +1 oznacza, że wszystkie komórki migrują w kierunku katody, a wartość -1 oznacza, że wszystkie komórki migrują w kierunku anody. Ukierunkowanie grupy losowo poruszających się komórek jest bliskie 0.
  3. Analizuj wyrównanie komórek.
    1. Uruchom oprogramowanie ImageJ. Przejdź do "Plik" → "Otwórz", aby załadować obraz do analizy.
    2. Potraktuj komórkę jako elipsę i narysuj linię, aby wskazać długą oś komórki. Przejdź do "Analizuj" → "Zmierz", aby zmierzyć kąt β między linią a poziomym kierunkiem EF.
    3. Powtórzyć czynności opisane w ppkt 6.3.2, aby zebrać β z co najmniej 50 komórek z trzech niezależnych doświadczeń i obliczyć średnią β cosinusa z błędem standardowym średniej (SEM).
    4. Powtórzyć czynności opisane w pkt 6.3.1-6.3.3 dla każdego warunku doświadczalnego.
      UWAGA: Współczynnik cosβ +1 oznacza, że wszystkie komórki są wyrównywane równolegle do zastosowanego EF, a wartość 0 oznacza, że wszystkie komórki są wyrównywane prostopadle do zastosowanego EF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ scalony naprężeń chemiczno-ścinających (CSS)

Układ CSS składa się z trzech arkuszy PMMA, każdy o grubości 1 mm, połączonych ze sobą za pomocą dwóch dwustronnych taśm, każda o grubości 0,07 mm (Rysunek 1A i 1B). Struktura "choinki" generuje pięć względnych stężeń 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1 w pięciu obszarach kulturowych. Projektując obszar hodowli jako trójkąt, w każdym z obszarów tworzony jest g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chipy na bazie PMMA są wytwarzane przy użyciu ablacji laserowej i pisania, które są tańszymi i łatwiejszymi metodami w porównaniu z chipami opartymi na PDMS, które wymagają bardziej skomplikowanej miękkiej litografii. Po zaprojektowaniu chipa mikroprzepływowego, produkcja i montaż mogą zostać wykonane w ciągu zaledwie 5 minut. Istnieje kilka krytycznych kroków, na które należy zwrócić uwagę podczas przeprowadzania eksperymentu. Pierwszą z nich jest kwestia "montażu". Adaptery powinny być odpowiednio przyklejone do najwyż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana finansowo przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu na podstawie Kontraktu Nr. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), nr MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun) oraz Projekt Rozwoju Kariery Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego (103R7888) (K. Y. Lo). Autorzy dziękują również Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, za korzystanie z pomieszczenia do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM)Gibco11965-092Pożywka do hodowli komórkowych
TrypsynaGibco25300-054odłącz komórkę od naczynia
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10082147Pożywka do hodowli komórkowych
10 cm Szalka Petriego do hodowli komórkowychNunc150350Hodowla komórkowa
Bright-Line  HemacytometrSigmaZ359629Sprzęt do liczenia komórek
PMMADostosowanyDostosowanydo chipów mikroprzepływowych
IndywidualnyIndywidualny chip mikroprzepływowy
Taśma dwustronna 0,07 / 0,22 mm 3M8018/9088Układ mikroprzepływowy
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaSigmaA9414Mostek solny
Dioctan 2'-7'-dichlorodihydrofluorescencjiSigmaD6883Wewnątrzkomórkowy pomiar ROS
Szkło z tlenku indu i cyny (ITO)Merck300739Heater
Sterownik proporcjonalno-całkująco-pochodny JETEC Electronics Sp. z o.o.TTM-J4-R-ABRegulator temperatury
Łącznik termicznyTECPELTPK-02ARegulator temperatury
Rysik laserowy CO2Narzędzia laserowe i Technika Corp.ILS2Produkcja chipów mikroprzepływowych
Pompy strzykawkoweNew EraNE-300Pompowanie medium i chemikaliów do chipa
ZasilanieGłówna nauka MP-300VDostarczanie prądu stałego
Mikroskop odwróconyOlympusCKX41Monitorowanie migracji komórek
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyNikonTS-100Monitorowanie migaracji komórek i sygnałów fluorescencyjnych
Lustrzanka cyfrowaCanon60DNagrywanie obrazów w jasnym polu 
Kamera CCDNikonDS-Qi1Nagrywanie obrazów fluorescencyjnych 
super klej3M Scotch7004Mocowanie adapterów do podłoży PMMA
AutoCAD AutodeskInc.Projektowanie układów mikroprzepływowych
DMSOSigmaD8418Rozpuszczanie DCFDA
ImageJNational Institutes of HealthKwantyfikacja intensywności fluorescencji i migracji komórek
adapter

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107(2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117(2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007(2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15(2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108(2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microfluidic DevicesPMMA SubstratesLaser AblationChemical GradientsElectrical FieldsShear StressCellular ResponsesReactive Oxygen SpeciesCell MigrationExperimental Throughput

Powiązane artykuły