Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54397

⸱

13 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

W tym artykule

Podsumowanie

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Streszczenie

Urządzenia mikroprzepływowe są w stanie stworzyć precyzyjne i kontrolowane mikrośrodowisko komórkowe o pH, temperaturze, stężeniu soli i innych fizycznych lub chemicznych bodźcach. Są one powszechnie stosowane do badań komórkowych in vitro, zapewniając otoczenie podobne do in vivo. Zwłaszcza sposób, w jaki komórki reagują na gradienty chemiczne, pola elektryczne i naprężenia ścinające, przyciągnął wiele zainteresowań, ponieważ zjawiska te są ważne dla zrozumienia właściwości i funkcji komórek. Te chipy mikroprzepływowe mogą być wykonane z podłoży szklanych, wafli krzemowych, polimerów polidimetylosiloksanu (PDMS), podłoży z polimetakrylanu metylu (PMMA) lub podłoży z polietylenu eteroftalanu (PET). Spośród tych materiałów podłoża PMMA są tanie i można je łatwo obrabiać za pomocą ablacji laserowej i pisania. Chociaż kilka urządzeń mikroprzepływowych zostało zaprojektowanych i wyprodukowanych do generowania wielu, współistniejących bodźców chemicznych i elektrycznych, żadne z nich nie zostało uznane za wystarczająco skuteczne w zmniejszaniu liczby powtórzeń eksperymentalnych, szczególnie do celów przesiewowych. W tym raporcie opisujemy nasz projekt i produkcję dwóch mikroprzepływowych chipów na bazie PMMA do badania odpowiedzi komórkowych w produkcji reaktywnych form tlenu i migracji pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających. Pierwszy chip generuje pięć względnych stężeń 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1 w regionach hodowli, wraz z gradientem naprężeń ścinających wytwarzanym w każdym z tych obszarów. Drugi chip generuje te same względne stężenia, ale z pięcioma różnymi natężeniami pola elektrycznego wytworzonego w każdym obszarze hodowli. Urządzenia te nie tylko zapewniają komórkom precyzyjne, kontrolowane mikrośrodowisko, ale także znacznie zwiększają przepustowość eksperymentalną.

Wprowadzenie

Komórki in vivo są otoczone przez różne biomolekuły, w tym macierz zewnątrzkomórkową (ECM), węglowodany, lipidy i inne komórki. Funkcjonalizują się, reagując na bodźce mikrośrodowiskowe, takie jak interakcje z ECM i reakcje na gradienty chemiczne różnych czynników wzrostu. Tradycyjnie, badania komórkowe in vitro przeprowadza się w szalkach do hodowli komórkowych, gdzie zużycie komórek i odczynników jest duże, a komórki rosną w statycznym (niekrążącym) środowisku. Ostatnio mikrofabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami płynnymi zapewniły alternatywną platformę do badań nad komórkami w bardziej kontrolowany sposób. Takie urządzenia są w stanie stworzyć precyzyjne mikrośrodowisko bodźców chemicznych i fizycznych, jednocześnie minimalizując zużycie komórek i odczynników. Te chipy mikroprzepływowe mogą być wykonane z podłoży szklanych, wafli krzemowych, polimerów polidimetylosiloksanu (PDMS), podłoży z polimetakrylanu metylu (PMMA) lub podłoży z politylenetereftalanu etylenu (PET) 1-3. Urządzenia oparte na PDMS są przezroczyste, biokompatybilne i przepuszczalne dla gazów, dzięki czemu nadają się do długotrwałych hodowli komórkowych i badań. Podłoża PMMA i PET są tanie i łatwe w obróbce za pomocą ablacji laserowej i pisania.

Urządzenia mikroprzepływowe powinny zapewnić komórkom stabilne i kontrolowane mikrośrodowisko, w którym komórki są poddawane różnym bodźcom chemicznym i fizycznym. Na przykład chipy mikroprzepływowe są używane do badania chemotaksji komórek. Zamiast tradycyjnych metod, które wykorzystują komorę Boydena i kapilarnę 4,5, te zminiaturyzowane urządzenia fluidalne mogą generować precyzyjne gradienty chemiczne do badania zachowań komórek 1,6,7. Innym przykładem jest badanie kierunkowej migracji komórek pod wpływem pól elektrycznych (EF), zjawisko zwane elektrotaksją. Stwierdzono, że zachowania elektrotaktyczne komórek są związane z regeneracją nerwów8, rozwojem embrionalnym 9 i gojeniem się ran 10,11. Przeprowadzono wiele badań w celu zbadania elektrotaksji różnych typów komórek, w tym komórek rakowych 12,13, limfocytów 14,15, komórek białaczkowych 11 i komórek macierzystych 16. Tradycyjnie szalki Petriego i szkła nakrywkowe są używane do konstruowania komór elektrotaktycznych do generowania EFs 17. Takie proste układy stwarzają problemy związane z parowaniem medium i nieprecyzyjnymi EF, ale mogą być one przezwyciężone przez urządzenia mikroprzepływowe z zamkniętymi, dobrze zdefiniowanymi kanałami fluidycznymi 12,18,19.

Aby systematycznie badać reakcje komórkowe pod wpływem precyzyjnych, kontrolowanych bodźców chemicznych i elektrycznych, byłoby bardzo przydatne opracowanie urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do dostarczania komórkom wielu bodźców jednocześnie. Na przykład Li i wsp. opisano urządzenie mikroprzepływowe oparte na PDMS do tworzenia pojedynczych lub współistniejących gradientów chemicznych i EF 20. Kao i wsp. opracowano podobny chip mikroprzepływowy do modulowania chemotaksji komórek raka płuc za pomocą EFs 6. Ponadto, aby zwiększyć przepustowość, Hou i wsp. zaprojektował i wyprodukował wielokanałowy chip o podwójnym polu elektrycznym na bazie PMMA, aby zapewnić komórkom 8 różnych połączonych bodźców, tj. (2 siły EF x 4 stężenia chemiczne)21. Aby jeszcze bardziej zwiększyć przenikanie i dodać bodziec naprężeń ścinających, opracowaliśmy dwa urządzenia mikroprzepływowe na bazie PMMA do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Zgłoszone przez Lo et al. 22,23, urządzenia te zawierają pięć niezależnych kanałów hodowli komórkowych podlegających ciągłemu przepływowi płynów, naśladując układ krążenia in vivo. W pierwszym chipie (chipie naprężeń ścinających chemicznie lub chipie CSS) w regionach hodowli generowanych jest pięć stężeń względnych 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1, a w każdym z pięciu obszarów kultury wytwarzany jest gradient naprężeń ścinających. W drugim chipie (chipie chemiczno-elektrycznym lub chipie CEF), przy użyciu jednego zestawu elektrod i 2 pomp strzykawkowych, generowanych jest pięć mocy EF oprócz pięciu różnych stężeń chemicznych w tych obszarach hodowli. Obliczenia numeryczne i symulacje są wykonywane w celu lepszego zaprojektowania i obsługi tych chipów, a komórki raka płuc hodowane w tych urządzeniach są poddawane pojedynczym lub współistniejącym bodźcom w celu obserwacji ich reakcji w odniesieniu do produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), szybkości migracji i kierunku migracji. Wykazano, że chipy te są oszczędzającymi czas, wysokowydajnymi i niezawodnymi urządzeniami do badania, jak komórki reagują na różne bodźce mikrośrodowiskowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie i wykonanie chipa

  1. Zaprojektuj wzory do ablacji na podłożach z PMMA i taśmach dwustronnych, korzystając z komercyjnego oprogramowania 24.
    1. Aby zbadać wpływ stężeń substancji chemicznych i naprężeń ścinających, narysuj wzór w kształcie „choinki” o zmiennej szerokości na jego końcu w każdym z pięciu obszarów hodowli (Rysunek 1A i 1B).
    2. Aby zbadać wpływ stężeń substancji chemicznych i pól elektrycznych, narysuj wzór w kształcie „choinki” z dwoma dodatkowymi kanałami fluidycznymi dla mostków solnych (Rysunek 2A i 2B).
  2. Wytraw pojedynczy wzór na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej, ładując odpowiedni plik do laserowego grawera CO2.
    1. Włącz grawer laserowy i sprawdź jego połączenie z komputerem. Otwórz wzór do ablacji za pomocą komercyjnego oprogramowania.
    2. Umieść arkusz PMMA lub taśmę dwustronną na stole grawera. W razie potrzeby wyreguluj ogniskową lasera CO2, korzystając z pręta kalibracyjnego i widocznego lasera He-Ne.
    3. Załaduj wzór do grawera w celu przeprowadzenia ablacji na arkuszu PMMA lub taśmie.
    4. Pobierz arkusz lub taśmę z naniesionym wzorem, usuń niepotrzebne fragmenty i oczyść powierzchnię za pomocą strumienia azotu.
      UWAGA: Grubość arkusza PMMA wynosi 1 mm, a grubość taśmy dwustronnej 0,07 mm lub 0,2 mm.

2. Montaż chipa

  1. Za pomocą superkleju przymocuj adaptery akrylowe (długość x szerokość x wysokość = 10 mm x 10 mm x 5 mm, z gwintami w środku) do najwyższej warstwy chipa, dopasowując gwinty do otworów w najwyższej warstwie. Adaptery te służą jako wloty/wyloty medium oraz złącza mostków solnych.
  2. Złóż chip mikroprzepływowy wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
  3. Złóż mikroprzepływowy chip do badania naprężeń chemiczno-ścinających (chip CSS).
    1. Połącz 3 arkusze naciętego PMMA za pomocą 2 kawałków naciętej taśmy dwustronnej (Rysunek 1A i 1B).
    2. Do spodu chipa dodaj kolejny kawałek taśmy dwustronnej o grubości 0,07 mm i przymocuj chip do szalki Petriego o średnicy 10 cm.
    3. Umieść tak złożony chip w komorze próżniowej na całą noc.
  4. Aby złożyć chip do badania chemiczno-elektrycznego pola (chip CEF), przymocuj arkusz PMMA do taśmy dwustronnej o grubości 0,22 mm (Rysunek 2A i 2B).
    1. Przymocuj nacięty arkusz PMMA i taśmę dwustronną do szalki Petriego o średnicy 10 cm, używając tego samego kawałka taśmy.
  5. Pozostaw złożony chip w komorze i naświetlaj go promieniowaniem UV przez 30 min w celu sterylizacji.
  6. Podłącz wloty do dwóch strzykawek o pojemności 3 ml za pomocą rurek plastikowych i nakrętek dokręcanych palcami. Podłącz wylot do rurki odpływowej za pomocą rurki plastikowej i nakrętki dokręcanej palcami.
    UWAGA: Przed użyciem wysterylizuj wszystkie rurki i nakrętki w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min.
  7. Powoli naciskaj tłok strzykawki, aby wypełnić kanały płynowe PBS. Przesuwaj tłoki strzykawek w przód i w tył, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  8. Umieść chipy w inkubatorze na noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
    UWAGA: Te dwa kroki mają na celu przemycie chipa i usunięcie wszelkich pozostałych w nim pęcherzyków powietrza.
  9. Wyjmij chip z inkubatora.
  10. Przygotuj agarowe mostki solne do generowania pól elektrycznych w chipie CEF.
    1. Rozpuść 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w buforze PBS (1x phosphate buffered saline) za pomocą mikrofalówki.
    2. Wstrzyknij płynną agarozę do kanału mostka solnego i wprowadź elektrody przed zastygnięciem roztworu.
    3. Umieść elektrody srebrno-chlorkowe w nakrętkach rurkowych.
  11. Podłącz strzykawki do pomp strzykawkowych i przez 10 min nieprzerwanie wprowadzaj pożywkę hodowlaną (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium, DMEM) do kanału płynowego z przepływem 20 μl/min, aby zastąpić PBS.

3. Przygotowanie komórek i konfiguracja eksperymentu

UWAGA: Przed użyciem należy podgrzać 1x PBS, pożywkę hodowlaną (DMEM z dodatkiem FBS) oraz trypsynę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.

  1. Wysiać 2 x 105 komórek raka płuca CL1-525,26 do szalki Petriego o średnicy 10 cm z medium DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować komórki w inkubatorze w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C do osiągnięcia 90% konfluencji.
  2. Odssać medium i raz opłukać komórki podgrzanym do temperatury roboczej 1x PBS. Dodać do komórek 2 ml 0,05% buforu trypsynowego i odczekać od 2 do 3 min w 37 °C do odklejenia się komórek.
  3. Przenieść komórki do sterylnej probówki do wirowania o objętości 15 ml i dodać 6 ml medium hodowlanego. Delikatnie odwrócić probówkę w celu zmieszania, a następnie pobrać 5 µl medium z zawiesiną komórkową do policzenia komórek za pomocą hemocytometru.
  4. Wirować probówkę przy 300 x g przez 5 min. Zawiesić 106 komórek w 1 ml medium hodowlanego i przelać zawiesinę do strzykawki o objętości 1 ml.
  5. Wprowadzić zawiesinę komórkową do chipa mikrofluidycznego przez wylot, upewniając się, że roztwór rozprowadził się we wszystkich pięciu obszarach hodowli. Inkubować chip w inkubatorze w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 h. 

4. Układ eksperymentalny

  1. Wyjmij chip z inkubatora i umieść go na przezroczystym grzejniku szklanym z tlenkiem indu i cyny (ITO).
    UWAGA: Szkło ITO jest połączone z regulatorem proporcjonalno-całkująco-różniczkującym (PID) w celu utrzymania temperatury 37 ± 0,5 °C poprzez sprzężenie zwrotne z termoparą ściśle zamocowaną pomiędzy grzejnikiem ITO a chipem.
  2. Umieść zespół chip-grzejnik na zmotoryzowanym stoliku XY mikroskopu odwróconego w celu śledzenia migracji komórek lub na stałym stoliku XY odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w celu pomiaru produkcji ROS.
  3. Aby uzyskać różne stężenia substancji chemicznych, napełnij dwie strzykawki po 5 ml roztworów chemicznych o stężeniach względnych 0 i 1 (rozpuszczonych w pożywce hodowlanej) i wpompuj je do chipa z żądaną prędkością przepływu: w chipie CSS z prędkością przepływu 0,3 ml/min przez 1 hr; w chipie CEF z prędkością przepływu 20 µl/min przez pierwsze 20 min i prędkością przepływu 20 µl/hr przez kolejne 120 min (całkowity czas = 2 hr).
  4. W chipie CEF, w celu śledzenia migracji komórek, zaprogramuj stolik XY mikroskopu tak, aby powtarzał wykonywanie zdjęć za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej (DSLR) określonych pól widzenia (FOV) w obszarach hodowli co 15 min przez 2 hr.
  5. Do pomiaru produkcji ROS należy użyć wskaźnika fluorescencyjnego 2′-7′-dichlorodihydrofluoresce diacetate (2′-7′-DCFDA).
    1. Przygotuj roztwór zapasowy 2′-7′-DCFDA o stężeniu 10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO) klasy biologii molekularnej. Rozcieńcz DCFDA w samym DMEM bez surowicy (5 µM w DMEM). Potencjalna aktywność deacetylazy mogłaby zwiększyć sygnały tła i zmniejszyć sygnały w komórkach.
    2. Po 1 hr stymulacji naprężeniem ścinającym w chipie CSS lub po 2 hr stymulacji EF w chipie CEF, wpompuj 2′-7′-DCFDA (5 µM w DMEM) do chipa z prędkością przepływu 20 µl/min przez pierwsze 20 min i prędkością przepływu 20 µl/hr przez kolejne 20 min. W celu przemycia wpompuj DMEM do chipa z prędkością przepływu 20 µl/hr przez 20 min.
    3. Wykonaj zdjęcia za pomocą kamery z urządzeniem sprzężonym ładunkowo (CCD) określonych obszarów FOV w strefach hodowli w celu analizy intensywności fluorescencji.

5. Obliczenia stężeń chemicznych, naprężeń ścinających i pól elektrycznych

  1. W obu chipach, CSS i CEF, oblicz stężenia substancji chemicznych w pięciu obszarach hodowli. Na przykład poprzez wstrzyknięcie H2O2 o stężeniach 0 i 200 µM z dwóch wlotów wprowadza się stężenia 0, 25, 10, 175 i 200 µM są generowane.
    UWAGA: Przy założeniu, że wszystkie ciecze przepływają gładko i równomiernie przez rozwidlenie, względne stężenia w pięciu obszarach hodowli wynoszą odpowiednio 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1.
  2. W chipie CSS oblicz naprężenie ścinające (τ) w obrębie każdego z obszarów hodowli przy użyciu τ=12(Qη/h²w), wzór na opór przepływu płynu, równanie naukowe. 27, gdzie Q jest objętościowym natężeniem przepływu, η czy lepkość płynu, h jest wysokością kanału, a W jest szerokością kanału.
    UWAGA: Poprzez ustawienie Q = 0,3 ml/min w każdym wlocie (Q = 0,12 ml/min w każdym obszarze hodowlanym), η = 0,08 Pa·s dla pożywki hodowlanej, h = 1 mm i w = 1 ~ 4 mm, obliczone naprężenie ścinające mieści się w zakresie od 0,048 Pa (region o szerokości 4 mm) do 0,0192 Pa (region o szerokości 1 mm).
  3. W chipie CEF oblicz natężenie pola elektrycznego (EF) w każdym z obszarów hodowli, korzystając z E = I/(σAeff) (prawo Ohma), gdzie I prąd elektryczny przepływa przez kanał fluidyczny, σ jest przewodność elektryczna pożywki hodowlanej oraz Awydajność jest efektywnym polem przekroju poprzecznego kanału.
    UWAGA: Stosowanie σ = 1.38 Ω-1m-1 do pożywki hodowlanej i Aeff = 0,2 mm2 (szerokość = 1 mm i wysokość = 0,2 mm), natężenie pola elektrycznego (EF) oblicza się jako E (mV/mm) = I (A) × 3,3 × 106.
    1. Jak pokazano w Rycina 2Dtraktuj obwód zastępczy jako pięć obwodów sekcji C z czterema segmentami (8 + 35 + 8) oraz jednym segmentem (5 + 35 + 5).
      UWAGA: Analizując ten obwód równoległy zgodnie z prawem Kirchhoffa dla napięć oraz prawem Ohma, prądy płynące przez pięć obszarów hodowlanych, I1 poprzez I5 od dołu do góry obliczono, że wynoszą około 0,49I (obszar 1), 0,25I (obszar 2), 0,13I (obszar 3), 0,08I (obszar 4) oraz 0,05I (obszar 5), odpowiednio, gdzie I jest całkowity prąd stały (DC). Przy przyłożonym prądzie stałym o natężeniu 0,157 mA w pięciu obszarach hodowli generowane są pola elektryczne (EF) o wartościach odpowiednio 254, 130, 67, 41 i 26 mV/mm.
      UWAGA: W celu uproszczonej analizy elektrycznej sieci mikrofluidycznej wszystkie segmenty płynowe traktuje się jako rezystory o oporności proporcjonalnej do ich długości.

6. Analiza danych

Uwaga: Analiza danych jest przeprowadzana przy użyciu oprogramowania ImageJ.

  1. Analiza produkcji ROS.
    1. Uruchom program ImageJ. Przejdź do opcji „File” (Plik) → Open (Otwórz), aby wczytać obraz fluorescencyjny przeznaczony do analizy.
    2. Wybierz „Image” $\rightarrow$ „Type” $\rightarrow$ „16-bit”, aby zmienić obraz na skalę szarości.
    3. Narysuj wielokąt, aby obrysować komórkę. Przejdź do sekcji „Analyze” $\rightarrow$ „Measure”, aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji komórki.
    4. Powtórz krok 6.1.3, aby zebrać intensywności z co najmniej 50 komórek z trzech niezależnych eksperymentów, a następnie oblicz średnią intensywność wraz z błędem standardowym średniej (SEM).
    5. Powtórz kroki 6.1.1–6.1.4 dla każdego warunku doświadczalnego.
  2. Analiza migracji komórek.
    1. Uruchom oprogramowanie ImageJ. Przejdź do „File” → „Open”, aby wczytać obraz pobrany dla czasu t = 0, który zostanie poddany analizie.
    2. Narysuj wielokąt, aby obrysować komórkę. Przejdź do sekcji „Analyze” → „Measure”, aby zmierzyć środek masy komórki jako (Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.1, y1).
    3. Powtórz kroki 6.2.1–6.2.2, aby zmierzyć środek masy tej samej komórki, co w (Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.2, y2) z innego obrazu wykonanego w czasie = t.
    4. Oblicz szybkość migracji (w µm/hr) tej komórki jako Równanie wzoru na odległość; pojęcie matematyczne; wzór do obliczania odległości między punktami w 2D..
    5. Powtórz etapy 6.2.1–6.2.4, aby zebrać dane dotyczące szybkości migracji z co najmniej 50 komórek w trzech niezależnych eksperymentach, a następnie oblicz średnią szybkość migracji wraz ze standardowym błędem średniej (SEM).
    6. Na podstawie wartości z punktów 6.2.2 i 6.2.3 oblicz kierunkowość migracji tej komórki jako cosinus. θ lub Wzór na odległość w równaniu fizycznym, analiza obliczeń prędkości lub wektora prędkości, wyrażenie matematyczne., gdzie θ kąt między wektorem przyłożonego pola elektrycznego (od bieguna dodatniego do ujemnego) a wektorem prowadzącym od pozycji początkowej do końcowej komórki (Rycina 2G).
    7. Powtórz krok 6.2.6, aby zebrać dane dotyczące kierunkowości migracji od co najmniej 50 komórek z trzech niezależnych eksperymentów, a następnie obliczyć średnią kierunkowość migracji wraz z błędem standardowym średniej (SEM).
    8. Oblicz średnią szybkość migracji wraz z SEM oraz średnią kierunkowość migracji wraz z SEM dla każdego warunku eksperymentalnego.
      UWAGA: Wartość kierunkowości +1 oznacza, że wszystkie komórki migrują w stronę katody, natomiast wartość -1 oznacza, że wszystkie komórki migrują w stronę anody. Kierunkowość grupy komórek poruszających się w sposób losowy jest bliska 0.
  3. Analiza orientacji komórek.
    1. Uruchom oprogramowanie ImageJ. Przejdź do menu „File” → „Open”, aby wczytać obraz do analizy.
    2. Przyjmij, że komórka ma kształt elipsy, i narysuj linię wyznaczającą jej oś długą. Przejdź do „Analyze” → „Measure”, aby zmierzyć kąt. β między linią a poziomym kierunkiem pola elektrycznego (EF).
    3. Powtórz krok 6.3.2 w celu zebrania β z co najmniej 50 komórek z trzech niezależnych eksperymentów i obliczyć średni cosinus β z błędem standardowym średniej (SEM).
    4. Powtórzyć kroki 6.3.1-6.3.3 dla każdego warunku eksperymentalnego.
      UWAGA: A cosβ Wartość +1 oznacza, że wszystkie komórki ustawiają się równolegle do przyłożonego EF, natomiast wartość 0 oznacza, że wszystkie komórki ustawiają się prostopadle do przyłożonego EF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Chip do generowania chemicznego naprężenia ścinającego (CSS)

Chip CSS składa się z trzech arkuszy PMMA o grubości 1 mm każdy, połączonych za pomocą dwóch dwustronnych taśm klejących o grubości 0,07 mm każda (Rysunek 1A i 1B). Struktura w kształcie „choinki” generuje pięć względnych stężeń: 0, 1/8, 1/2, 7/8 i 1 w pięciu obszarach hodowli. Dzięki zaprojektowaniu obszaru hodowli w kształcie trójkąt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chipy na bazie PMMA są wytwarzane przy użyciu ablacji laserowej i pisania, które są tańszymi i łatwiejszymi metodami w porównaniu z chipami opartymi na PDMS, które wymagają bardziej skomplikowanej miękkiej litografii. Po zaprojektowaniu chipa mikroprzepływowego, produkcja i montaż mogą zostać wykonane w ciągu zaledwie 5 minut. Istnieje kilka krytycznych kroków, na które należy zwrócić uwagę podczas przeprowadzania eksperymentu. Pierwszą z nich jest kwestia "montażu". Adaptery powinny być odpowiednio przyklejone do najwyż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu na podstawie Kontraktu Nr. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), nr MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun) oraz Projekt Rozwoju Kariery Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego (103R7888) (K. Y. Lo). Autorzy dziękują również Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, za korzystanie z pomieszczenia do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM)Gibco11965-092Pożywka do hodowli komórkowych
TrypsynaGibco25300-054odłącz komórkę od naczynia
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10082147Pożywka do hodowli komórkowych
10 cm Szalka Petriego do hodowli komórkowychNunc150350Hodowla komórkowa
Bright-Line  HemacytometrSigmaZ359629Sprzęt do liczenia komórek
PMMADostosowanyDostosowanydo chipów mikroprzepływowych
IndywidualnyIndywidualny chip mikroprzepływowy
Taśma dwustronna 0,07 / 0,22 mm 3M8018/9088Układ mikroprzepływowy
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaSigmaA9414Mostek solny
Dioctan 2'-7'-dichlorodihydrofluorescencjiSigmaD6883Wewnątrzkomórkowy pomiar ROS
Szkło z tlenku indu i cyny (ITO)Merck300739Heater
Sterownik proporcjonalno-całkująco-pochodny JETEC Electronics Sp. z o.o.TTM-J4-R-ABRegulator temperatury
Łącznik termicznyTECPELTPK-02ARegulator temperatury
Rysik laserowy CO2Narzędzia laserowe i Technika Corp.ILS2Produkcja chipów mikroprzepływowych
Pompy strzykawkoweNew EraNE-300Pompowanie medium i chemikaliów do chipa
ZasilanieGłówna nauka MP-300VDostarczanie prądu stałego
Mikroskop odwróconyOlympusCKX41Monitorowanie migracji komórek
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyNikonTS-100Monitorowanie migaracji komórek i sygnałów fluorescencyjnych
Lustrzanka cyfrowaCanon60DNagrywanie obrazów w jasnym polu 
Kamera CCDNikonDS-Qi1Nagrywanie obrazów fluorescencyjnych 
super klej3M Scotch7004Mocowanie adapterów do podłoży PMMA
AutoCAD AutodeskInc.Projektowanie układów mikroprzepływowych
DMSOSigmaD8418Rozpuszczanie DCFDA
ImageJNational Institutes of HealthKwantyfikacja intensywności fluorescencji i migracji komórek
adapter

Bibliografia

  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107(2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117(2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007(2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15(2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108(2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

podłoża z PMMAablacja laserowagradienty chemicznepola elektrycznereaktywne formy tlenumigracja komórekprzepustowość eksperymentalna
Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.