Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Streszczenie

Wykorzystanie polimerów jako biomateriałów przyniosło znaczące korzyści w zastosowaniach terapeutycznych. W szczególności możliwość modyfikacji i funkcjonalizacji łańcuchów polimerowych związkami, które są w stanie poprawić biokompatybilność, właściwości mechaniczne lub żywotność komórek, pozwala na projektowanie nowych materiałów, aby sprostać nowym wyzwaniom w dziedzinie biomedycyny. Dzięki strategiom funkcjonalizacji polimerów, chemia kliknięć jest potężnym narzędziem do poprawy kompatybilności komórek i właściwości dostarczania leków przez urządzenia polimerowe. Podobnie, fundamentalna potrzeba stosowania sterylnych narzędzi w biomedycynie w celu uniknięcia potencjalnych niepożądanych skutków ubocznych, takich jak toksyczność lub zanieczyszczenie środowiska biologicznego, powoduje rosnące zainteresowanie strategią wspomaganą mikrofalami.

Połączenie chemii kliknięć i metody wspomaganej mikrofalami jest odpowiednie do produkcji biokompatybilnych hydrożeli o pożądanych funkcjach i ulepszonych parametrach w zastosowaniach biomedycznych. Praca ta ma na celu syntezę hydrożeli funkcjonalizowanych RGD. RGD (kwas arginyloglicylasparaginowy) to tripeptyd, który może naśladować białka adhezyjne komórek i wiązać się z receptorami na powierzchni komórki, tworząc przyjazne mikrośrodowisko dla komórek w sieci polimerowej 3D hydrożeli. Funkcjonalizacja RGD zachodzi poprzez cykloaddycję 1,3-dipolarną Huisgena. Niektóre grupy karboksylowe PAA są modyfikowane ugrupowaniem alkinowym, podczas gdy RGD jest funkcjonalizowany kwasem azydologicznym jako końcową resztą sekwencji peptydowej. Wreszcie, oba produkty są stosowane w katalizowanej miedzią reakcji kliknięcia w celu trwałego połączenia peptydu z PAA. Ten zmodyfikowany polimer jest używany z karbomerem, agarozą i glikolem polietylenowym (PEG) do syntezy matrycy hydrożelowej. Struktura 3D powstaje w wyniku reakcji estryfikacji obejmującej grupy karboksylowe z PAA oraz grupy karbomerowe i hydroksylowe z agarozy i PEG poprzez polikondensację wspomaganą mikrofalami. Wydajność mechanizmu żelowania zapewnia wysoki stopień funkcjonalności RGD. Ponadto procedura ładowania związków terapeutycznych lub narzędzi biologicznych w tej sfunkcjonalizowanej sieci jest bardzo prosta i powtarzalna.

Wprowadzenie

Hydrożele to trójwymiarowe sieci tworzone przez hydrofilowe polimery sieciowane, naturalne lub syntetyczne, które charakteryzują się swoistą strukturą trójwymiarową. Urządzenia te stają się coraz bardziej atrakcyjne w biomedycznych obszarach dostarczania leków, inżynierii tkankowej, nośników genów oraz inteligentnych czujników.^1,2Rzeczywiście, ich wysoka zawartość wody, a także właściwości reologiczne i mechaniczne sprawiają, że są one odpowiednimi kandydatami do naśladowania mikrośrodowisk tkanek miękkich i skutecznymi narzędziami do dostarczania rozpuszczalnych w wodzie cytokin lub czynników wzrostu. Jednym z najbardziej obiecujących zastosowań jest wykor....

Protokół

Uwaga: Chemikalia są używane w takiej postaci, w jakiej zostały otrzymane. Kupowany jest liniowy RGD, ale można go wytworzyć za pomocą standardowej syntezy peptydów fazy stałej^{Fmoc 16,19}. Rozpuszczalniki są klasy analitycznej. Dializa wymaga użycia membrany o wartości odcięcia M_w równej 3 500 Da. Zsyntetyzowane związki charakteryzują się widmami ¹H NMR zarejestrowanymi na spektrometrze 400 MHz przy użyciu chloroformu (CDCl₃) lub tlenku deuteru (D₂O) jako rozpuszczalników, a przesunięcia chemiczne są podawane jako wartości δ w częściach na milion. Ponadto hydrożele poddawane są analizie FT-IR przy użyciu techniki g....

Wyniki

Pochodna alkini PAA jest efektywnie syntetyzowana z kwasu poliakrylowego i propargylaminy, jak pokazano na Rysunku 1, gdzie n oznacza monomery, których grupy karboksylowe reagują z aminą. Tożsamość produktu potwierdzono za pomocą spektroskopii ¹H-NMR. Rysunek 5 przedstawia widmo ¹H-NMR PAA zmodyfikowanego wiązaniem potrójnym.

Dyskusja

Modyfikacja postpolimeryzacji PAA z ugrupowaniami alkinowymi oraz funkcjonalizacja RGD grupą azydkową gwarantują wytworzenie stabilnego wiązania między polimerem a peptydem. Rzeczywiście, triazol służy jako sztywna jednostka łącząca atomy węgla, przyłączona do 1,4 pozycji pierścienia 1,2,3-triazolowego i nie może być rozszczepiona hydrolitycznie lub w inny sposób. Ponadto triazol jest niezwykle trudny do utlenienia i redukcji, w przeciwieństwie do innych struktur cyklicznych, takich jak benzenoidy i związane z nimi heter.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór poli(kwasu akrylowego) średni Mw ~100 000, 35% wag. w H2O	Sigma Aldrich	523925	CAS 9003-01-4
Poli(glikol etylenowy) 2,000	Sigma Aldrich	84797	CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P	Fagron	1387083
Agaroza	Invitrogen Corp.	16500-500	Peptyd UltraPure Agaroza
RGD	abcam	ab142698
Kwas 4-azydobutanowy	Aurum Pharmatech	Z-2421	CAS 54447-68-6
Chlorek szczawilu	Sigma Aldrich	O8801	CAS 79-37-8
Chlorowodorek propargiloaminy 95%	Sigma Aldrich	P50919	CAS 15430-52-1
Jodek miedzi(I)	Sigma Aldrich	3140	CAS 7681-65-4
Askorbinian sodu	Sigma Aldrich	Y0000039	CAS 134-03-2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma Aldrich	P4417
Laboratoria Widma	Membran Dializy	132725	Spectra/Por 3 Membrana dializacyjna  Standardowe rury RC MWCO: 3,5 kD

, Inc.