Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Streszczenie

Wykorzystanie polimerów jako biomateriałów przyniosło znaczące korzyści w zastosowaniach terapeutycznych. W szczególności możliwość modyfikacji i funkcjonalizacji łańcuchów polimerowych związkami, które są w stanie poprawić biokompatybilność, właściwości mechaniczne lub żywotność komórek, pozwala na projektowanie nowych materiałów, aby sprostać nowym wyzwaniom w dziedzinie biomedycyny. Dzięki strategiom funkcjonalizacji polimerów, chemia kliknięć jest potężnym narzędziem do poprawy kompatybilności komórek i właściwości dostarczania leków przez urządzenia polimerowe. Podobnie, fundamentalna potrzeba stosowania sterylnych narzędzi w biomedycynie w celu uniknięcia potencjalnych niepożądanych skutków ubocznych, takich jak toksyczność lub zanieczyszczenie środowiska biologicznego, powoduje rosnące zainteresowanie strategią wspomaganą mikrofalami.

Połączenie chemii kliknięć i metody wspomaganej mikrofalami jest odpowiednie do produkcji biokompatybilnych hydrożeli o pożądanych funkcjach i ulepszonych parametrach w zastosowaniach biomedycznych. Praca ta ma na celu syntezę hydrożeli funkcjonalizowanych RGD. RGD (kwas arginyloglicylasparaginowy) to tripeptyd, który może naśladować białka adhezyjne komórek i wiązać się z receptorami na powierzchni komórki, tworząc przyjazne mikrośrodowisko dla komórek w sieci polimerowej 3D hydrożeli. Funkcjonalizacja RGD zachodzi poprzez cykloaddycję 1,3-dipolarną Huisgena. Niektóre grupy karboksylowe PAA są modyfikowane ugrupowaniem alkinowym, podczas gdy RGD jest funkcjonalizowany kwasem azydologicznym jako końcową resztą sekwencji peptydowej. Wreszcie, oba produkty są stosowane w katalizowanej miedzią reakcji kliknięcia w celu trwałego połączenia peptydu z PAA. Ten zmodyfikowany polimer jest używany z karbomerem, agarozą i glikolem polietylenowym (PEG) do syntezy matrycy hydrożelowej. Struktura 3D powstaje w wyniku reakcji estryfikacji obejmującej grupy karboksylowe z PAA oraz grupy karbomerowe i hydroksylowe z agarozy i PEG poprzez polikondensację wspomaganą mikrofalami. Wydajność mechanizmu żelowania zapewnia wysoki stopień funkcjonalności RGD. Ponadto procedura ładowania związków terapeutycznych lub narzędzi biologicznych w tej sfunkcjonalizowanej sieci jest bardzo prosta i powtarzalna.

Wprowadzenie

Hydrożele to trójwymiarowe sieci tworzone przez hydrofilowe polimery sieciowane, naturalne lub syntetyczne, które charakteryzują się swoistą strukturą trójwymiarową. Urządzenia te stają się coraz bardziej atrakcyjne w biomedycznych obszarach dostarczania leków, inżynierii tkankowej, nośników genów oraz inteligentnych czujników.^1,2Rzeczywiście, ich wysoka zawartość wody, a także właściwości reologiczne i mechaniczne sprawiają, że są one odpowiednimi kandydatami do naśladowania mikrośrodowisk tkanek miękkich i skutecznymi narzędziami do dostarczania rozpuszczalnych w wodzie cytokin lub czynników wzrostu. Jednym z najbardziej obiecujących zastosowań jest wykorzystanie ich jako wstrzykiwalnego biomateriału przenoszącego komórki i związki bioaktywne. Hydrożele mogą poprawiać przeżywalność komórek i kontrolować losy komórek macierzystych poprzez zatrzymywanie i precyzyjne dostarczanie sygnałów regulacyjnych dla komórek macierzystych w sposób fizjologicznie istotny, co zaobserwowano w in vitro oraz w in vivo doświadczenia^3,4Główną zaletą tego rozwiązania jest możliwość utrzymania wstrzykniętych komórek w obrębie strefy inokulacji (in situ), minimalizując liczbę komórek opuszczających ten obszar i przenikających do krwiobiegu, co prowadziłoby do ich migracji po całym organizmie i utraty celu terapeutycznego⁵Stabilność trójwymiarowych sieci hydrożelowych wynika z obecności miejsc sieciowania, tworzonych przez wiązania kowalencyjne lub siły kohezyjne pomiędzy łańcuchami polimerowymi.⁶.

W tym ujęciu ortogonalna chemia selektywna stosowana w odniesieniu do łańcuchów polimerowych jest wszechstronnym narzędziem pozwalającym na poprawę właściwości hydrożeli⁷. W rzeczywistości modyfikacja polimerów odpowiednimi grupami chemicznymi może pomóc w zapewnieniu właściwych cech chemicznych, fizycznych i mechanicznych, co zwiększa żywotność komórek oraz ich wykorzystanie w formowaniu tkanek. Podobnie, wśród technik wprowadzania komórek lub czynników wzrostu do macierzy żelowej, zastosowanie peptydu RGD pozwala na poprawę adhezji i przeżywalności komórek. RGD to tripeptyd składający się z argininy, glicyny i kwasu asparaginowego, który jest zdecydowanie najskuteczniejszym i najczęściej stosowanym tripeptydem ze względu na zdolność do oddziaływania z więcej niż jednym receptorem adhezyjnym komórek oraz jego biologiczny wpływ na zakotwiczenie, zachowanie i przeżywalność komórek^8,9. W niniejszej pracy badana jest synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD w celu zaprojektowania sieci charakteryzujących się wystarczającymi właściwościami biochemicznymi dla zapewnienia sprzyjającego mikrośrodowiska komórkowego.

Zastosowanie promieniowania mikrofalowego w syntezie hydrożeli oferuje prostą procedurę minimalizacji reakcji ubocznych oraz pozwala na uzyskanie wyższych szybkości reakcji i wydajności w krótszym czasie w porównaniu do konwencjonalnych procesów termicznych¹⁰. Metoda ta nie wymaga etapów oczyszczania i pozwala na otrzymanie sterylnych hydrożeli dzięki oddziaływaniom polimerów oraz brakowi rozpuszczalników organicznych w układzie reakcyjnym¹¹. Zapewnia to zatem wysoki procent RGD powiązanych z siecią polimerową, ponieważ nie są wymagane żadne modyfikacje grup chemicznych polimeru uczestniczących w tworzeniu żelu. Grupy karboksylowe, pochodzące z PAA i karbomeru, oraz grupy hydroksylowe, pochodzące z PEG i agarozy, tworzą trójwymiarową strukturę hydrożelu w wyniku reakcji polikondensacji. Wspomniane polimery są wykorzystywane do syntezy hydrożeli w terapiach naprawczych urazów rdzenia kręgowego¹². Urządzenia te, jak opisano w poprzednich pracach^13,14, wykazują wysoką biokompatybilność, a także właściwości mechaniczne i fizykochemiczne zbliżone do wielu tkanek żywych oraz naturę tiksotropową. Ponadto pozostają one zlokalizowane in situ, w miejscu wstrzyknięcia.

W niniejszej pracy grupy karboksylowe PAA zostają zmodyfikowane grupą alkinową (Rysunek 1), a związek RGD-azydowy jest syntetyzowany z wykorzystaniem reaktywności grupy końcowej -NH₂ tripeptydu z przygotowanym związkiem chemicznym o strukturze (CH₂)_n-N₃ (Rysunek 2). Następnie zmodyfikowane PAA reaguje z pochodną RGD-azydową poprzez reakcję klik CuAAC^15-17 (Rysunek 3). Zastosowanie katalizatora miedzi(I) prowadzi do znaczącej poprawy zarówno szybkości reakcji, jak i regioselektywności. Reakcja CuAAC jest powszechnie stosowana w syntezie organicznej oraz w nauce o polimerach. Łączy ona wysoką wydajność i wysoką tolerancję grup funkcyjnych i nie jest wpływana przez zastosowanie rozpuszczalników organicznych. Wysoka selektywność, krótki czas reakcji i prosta procedura oczyszczania pozwalają na otrzymywanie polimerów gwiazd 모양, kopolimerów blokowych lub łańcuchów z przyszczepionymi pożądanymi fragmentami¹⁸. Ta strategia klikowa umożliwia modyfikację polimerów po polimeryzacji w celu dostosowania właściwości fizykochemicznych do końcowego zastosowania biochemicznego. Warunki eksperymentalne CuAAC są łatwo reprodukowalne (reakcja jest niewrażliwa na wodę, natomiast utlenianie miedzi może zachodzić w minimalnym stopniu), a natura powstałego triazolu zapewnia stabilność produktu. Zastosowanie miedzi może być uznane za punkt krytyczny ze względu na jej potencjalny toksyczny wpływ na komórki i biologiczne mikrośrodowisko, jednak jako metoda oczyszczania stosuje się dializę, aby umożliwić całkowite usunięcie pozostałości katalitycznych. Na koniec zmodyfikowane RGD-PAA jest wykorzystywane w syntezie hydrożelu (Rysunek 4), a następnie badane są właściwości fizykochemiczne otrzymanych sieci w celu sprawdzenia potencjalnej funkcjonalności tych systemów jako nośników komórek lub leków.

Rycina 1: Synteza PAA modyfikowanego alkyną. Schemat funkcjonalizacji PAA grupą alkynową; „n” oznacza monomery z grupą karboksylową reagujące z propargylaminą. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Synteza RGD-azydku. Synteza pochodnej RGD-azydkowej. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rycina 3: Reakcja klikalna. Schemat reakcji klikalnej pomiędzy pochodną azydową RGD a PAA-alkinem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Synteza hydrożelu. Procedura syntezy hydrożelu funkcjonalizowanego RGD. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Uwaga: Chemikalia są używane w takiej postaci, w jakiej zostały otrzymane. Kupowany jest liniowy RGD, ale można go wytworzyć za pomocą standardowej syntezy peptydów fazy stałej^{Fmoc 16,19}. Rozpuszczalniki są klasy analitycznej. Dializa wymaga użycia membrany o wartości odcięcia M_w równej 3 500 Da. Zsyntetyzowane związki charakteryzują się widmami ¹H NMR zarejestrowanymi na spektrometrze 400 MHz przy użyciu chloroformu (CDCl₃) lub tlenku deuteru (D₂O) jako rozpuszczalników, a przesunięcia chemiczne są podawane jako wartości δ w częściach na milion. Ponadto hydrożele poddawane są analizie FT-IR przy użyciu techniki granulek KBr, a ich charakterystyka fizyczna obejmuje badania żelowania oceniane przy użyciu odwróconej probówki w temperaturze 37 °C.

1. Synteza chlorku 4-azydobutanoylu 1

1. Rozpuścić 500 mg kwasu 4-azydobutanowego (3,90 mmol) w 10 ml dichlorometanu i 0,5 ml dimetyloformamidu.
2. Schłodzić roztwór w temperaturze 0 °C, używając łaźni lodowej.
3. Dodać 505 μl chlorku szczawilu (5,85 mmol) do 5 ml dichlorometanu i powoli dodawać kroplami do układu reakcyjnego, mieszając.
4. Po 1 godzinie w temperaturze 0 °C przy użyciu łaźni lodowej powrócić do temperatury pokojowej.
5. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
6. Otrzymany produkt scharakteryzować za pomocą ¹spektroskopii H-NMR, rozpuszczając próbkę w CDCl₃¹⁶.

2. Synteza pochodnej RGD-azydku 2

1. Rozpuścić 50 mg RGD (0,145 mmol) w 1 ml 1 M NaOH.
2. Rozpuścić 24 mg z 1 (0,16 mmol) w 2 ml tetrahydrofuranu.
3. Dodać cały roztwór RGD do roztworu 1 kroplami w temperaturze 0 °C za pomocą łaźni lodowej.
4. Wróć do temperatury pokojowej i mieszaj przez noc.
5. Dodać 1 ml 1 M HCl.
6. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
7. Otrzymany produkt scharakteryzować za pomocą spektroskopii ¹H-NMR, rozpuszczając próbkę w D₂O¹⁶.

3. Modyfikacja alkinu PAA 3

1. Rozpuścić 200 mg 35% w/w roztworu PAA (2,8 mmol) w 15 ml wody destylowanej.
2. Dodać 15,4 mg chlorowodorku propargyloaminy (0,20 mmol).
3. Rozpuścić 42,8 mg hydratu 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, 0,28 mmol) w 14 ml roztworu acetonitrylu destylowanego w stosunku 1:1 v/v, ogrzewając go do temperatury 50 °C.
4. Dodać cały roztwór HOBt do roztworu PAA w temperaturze pokojowej.
5. Dodać 53,6 mg etylodimetyloaminopropylokarbodimidu (EDC, 0,28 mmol) do mieszaniny reakcyjnej.
6. Użyj 1 M HCl, aby dostosować pH do 5,5 i mieszać system reakcyjny przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Dializuj roztwór. Rozpuścić 11,2 g chlorku sodu w 2 l wody destylowanej, a następnie dodać 0,2 ml 37% m/w HCl. Roztwór należy dializować za pomocą membrany o wartości odcięcia_{M w} 3,5 kDa.
8. Wykonuj dializy przez trzy dni. Codziennie zmieniaj roztwór dializacyjny na 2 l świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 0,2 ml 37% m/w HCl.
9. Roztwór końcowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Liofilizować go w liofilizatorze zgodnie z protokołami producenta.
10. Scharakteryzować funkcjonalizowany polimer za pomocą spektroskopii ¹H-NMR, rozpuszczając próbkę w D₂O¹⁶.

4. Synteza polimeru PAA-RGD 4

1. Rozpuścić 78 mg modyfikowanego PAA alkinu 3 (1,083 mmol) w 10 ml wody destylowanej.
2. Rozpuścić 25 mg pochodnej azydku RGD 2 (0,0722 mmol) w 5 ml tetrahydrofuranu.
3. Dodaj cały roztwór RGD do roztworu polimerowego.
4. Dodać 2,2 mg jodku miedzi (0,0116 mmol) i 2,2 mg askorbinianu sodu (0,0111 mmol).
5. Otrzymaną mieszaninę należy przepłukać przez noc w temperaturze 60 °C, mieszając.
6. Schłodzić mieszaninę do temperatury 25 °C.
7. Dializuj roztwór. Rozpuścić 11,2 g chlorku sodu w 2 l wody destylowanej, a następnie dodać 0,2 ml 37% m/w HCl. Roztwór należy dializować za pomocą membrany o wartości odcięcia_{M w} 3,5 kDa.
8. Wykonuj dializy przez trzy dni. Codziennie zmieniaj roztwór dializacyjny na 2 l świeżo przygotowanej wody destylowanej zawierającej 0,2 ml 37% m/w HCl.
9. Roztwór końcowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Liofilizować go w liofilizatorze zgodnie z protokołami producenta.
10. Otrzymany produkt scharakteryzować za pomocą spektroskopii ¹H-NMR, rozpuszczając próbkę w D₂O¹⁶.

5. Synteza hydrożelu funkcjonalizowanego RGD

1. Przygotuj PBS. Rozpuścić 645 mg soli PBS w 50 ml wody destylowanej.
2. Zmieszać 40 mg karbomeru i 10 mg funkcjonalizowanego PAA 4 w 9 ml PBS (krok 5.1), w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia (30 min).
3. Dodać 400 mg PEG do roztworu i mieszać przez 45 minut.
4. Przerwij mieszanie i pozwól systemowi osiąść przez 30 minut.
5. Użyj 1 N NaOH, aby dostosować pH do 7,4.
6. Do 5 ml otrzymanej mieszaniny dodać 25 mg proszku agarozy.
7. Naświetlić system promieniowaniem mikrofalowym o mocy 500 W aż do wrzenia, zwykle przez czas od 30 sekund do 1 minuty, a następnie podgrzać elektromagnetycznie do temperatury 80 °C.
8. Pozostawić mieszaninę wystawioną na działanie temperatury pokojowej do momentu, gdy jej temperatura spadnie do 50 °C i dodać 5 ml PBS (krok 5.1) w celu uzyskania roztworu w stosunku objętościowym 1:1.
9. Przygotować 12 płytek wielodołkowych zawierających stalowe cylindry o średnicy 1,1 cm.
10. Pobrać 500 μl podwielokrotności z roztworu i umieścić je w każdym stalowym cylindrze.
11. Pozostawić w spoczynku na 45 minut do całkowitego zżelowania systemu.
12. Usuń butle za pomocą kleszczy ze stali nierdzewnej, aby uzyskać hydrożele.

6. Ładowanie narzędzia terapeutycznego (leku lub komórek)

1. Powtórz kroki 5.1-5.7.
2. Gdy mieszanina (już w stanie zolu) osiągnie temperaturę 37 °C, dodać 5 ml roztworu zawierającego pożądany roztwór leku lub hodowlę komórkową, w celu uzyskania końcowego układu w stosunku objętościowym 1:1.
3. Powtórz kroki 5.9-5.12, aby uzyskać sieci polimerowe z biozwiązkami fizycznie uwięzionymi w żelu.

7. Charakterystyka hydrożelu

1. Analiza FT-IR
   1. Po utworzeniu żelu namocz jeden ze zsyntetyzowanych hydrożeli w 2,5 ml wody destylowanej na 24 godziny.
   2. Usunąć podłoże wodne, w którym zanurzony jest hydrożel i liofilizować płynem_N2.
   3. Próbkę hydrożelu zalaminować zgodnie z techniką granulek KBr.
      1. Dodaj szpatułkę pełną KBr do zaprawy agatowej. Weź niewielką ilość próbki hydrożelu (około 0,1-2% ilości KBr lub tylko tyle, aby pokryć końcówkę szpatułki) i wymieszaj z proszkiem KBr.
      2. Zmiel mieszaninę, aż proszek będzie drobny i jednorodny.
      3. Użyj zestawu granulek KBr, aby uformować pelety IR. Wyciskać proszek za pomocą ręcznej prasy laboratoryjnej: przez 3 minuty przy nacisku równym 5 ton, a następnie przez 3 min przy nacisku 10 ton.
      4. Zwolnij ciśnienie, aby uzyskać końcowy granulat o jednorodnym i przezroczystym wyglądzie. Włóż osad do uchwytu na próbki IR i uruchom widmo¹⁶.
2. Badania żelowania
   1. Napełnić probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml 900 μl PBS i wyrównać do temperatury 37 °C.
   2. Dodać 100 μl przygotowanego roztworu polimeru do uzyskania hydrożelu i inkubować w temperaturze 37 °C.
   3. Odwróć probówkę i obserwuj, czy żel przepływa po 1, 2, 5, 10 i 20 minutach. Zapisz czas, w którym żel nie płynie, jako czas żelowania.

Wyniki

Pochodna alkiniowa PAA jest efektywnie syntetyzowana z kwasu poliakrylowego i propargylaminy, co przedstawiono na Rysunku 1, gdzie n oznacza monomery, których grupy karboksylowe reagują z aminą. Tożsamość produktu potwierdzono za pomocą spektroskopii ¹H-NMR. Rysunek 5 przedstawia widmo ¹H-NMR PAA zmodyfikowanego wiązaniem potrójnym.

Dyskusja

Modyfikacja postpolimeryzacji PAA z ugrupowaniami alkinowymi oraz funkcjonalizacja RGD grupą azydkową gwarantują wytworzenie stabilnego wiązania między polimerem a peptydem. Rzeczywiście, triazol służy jako sztywna jednostka łącząca atomy węgla, przyłączona do 1,4 pozycji pierścienia 1,2,3-triazolowego i nie może być rozszczepiona hydrolitycznie lub w inny sposób. Ponadto triazol jest niezwykle trudny do utlenienia i redukcji, w przeciwieństwie do innych struktur cyklicznych, takich jak benzenoidy i związane z nimi heter...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór poli(kwasu akrylowego) średni Mw ~100 000, 35% wag. w H2O	Sigma Aldrich	523925	CAS 9003-01-4
Poli(glikol etylenowy) 2,000	Sigma Aldrich	84797	CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P	Fagron	1387083
Agaroza	Invitrogen Corp.	16500-500	Peptyd UltraPure Agaroza
RGD	abcam	ab142698
Kwas 4-azydobutanowy	Aurum Pharmatech	Z-2421	CAS 54447-68-6
Chlorek szczawilu	Sigma Aldrich	O8801	CAS 79-37-8
Chlorowodorek propargiloaminy 95%	Sigma Aldrich	P50919	CAS 15430-52-1
Jodek miedzi(I)	Sigma Aldrich	3140	CAS 7681-65-4
Askorbinian sodu	Sigma Aldrich	Y0000039	CAS 134-03-2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma Aldrich	P4417
Laboratoria Widma	Membran Dializy	132725	Spectra/Por 3 Membrana dializacyjna  Standardowe rury RC MWCO: 3,5 kD

, Inc.