Zrosty brzuszne, które tworzą się po operacji, są główną przyczyną bólu, bezpłodności oraz hospitalizacji i reoperacji z powodu niedrożności jelita cienkiego. Nasza chirurgiczna procedura tworzenia zrostów brzusznych u myszy jest niezawodnym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw powstawania zrostów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie zrostów brzusznych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zrosty brzuszne składają się z tkanki zwłóknieniowej, która tworzy się w przestrzeni otrzewnej w odpowiedzi na zniewagę zapalną, zazwyczaj chirurgiczną lub infekcję wewnątrzbrzuszną. Dokładne mechanizmy leżące u podstaw powstawania zrostów są słabo poznane. Wiele związków i barier fizycznych zostało przetestowanych pod kątem ich zdolności do zapobiegania zrostom po operacji z różnym powodzeniem. Mysz i szczur są ważnymi modelami do badania zrostów brzusznych. W literaturze istnieje kilka różnych technik tworzenia zrostów u myszy i szczura. W tym artykule opisano protokół polegający na ścieraniu jelita ślepego papierem ściernym i zakładaniu szwów w prawej ścianie bocznej jamy brzusznej. Mysz jest znieczulana, a brzuch jest przygotowywany. Wykonywana jest laparotomia w linii środkowej i identyfikowane jest jelito ślepe. Papier ścierny służy do delikatnego ścierania powierzchni jelita ślepego. Następnie kilka szwów w kształcie ósemki umieszcza się w otrzewnej prawej ściany bocznej brzucha. Jama brzuszna jest nawadniana, nakłada się niewielką ilość skrobi i zamyka nacięcie. Odkryliśmy, że ta technika daje najbardziej spójne zrosty przy najniższym wskaźniku śmiertelności.
Wprowadzenie
Zrosty brzuszne to forma tkanki bliznowatej, która tworzy się w jamie brzusznej w odpowiedzi na stan zapalny, zazwyczaj po operacji lub infekcji wewnątrzbrzusznej. Zrosty są główną przyczyną przewlekłego bólu brzucha i niepłodności oraz są najczęstszą przyczyną niedrożności jelita cienkiego1. Obecność zrostów utrudnia wykonanie drugiej operacji jamy brzusznej i zwiększa prawdopodobieństwo powikłań2.
Pomimo wielu lat badań, mechanizmy leżące u podstaw powstawania zrostów pozostają słabo poznane. Wiadomo, że początkowe uszkodzenie powierzchni otrzewnej powoduje wysięk płynu bogatego w fibrynę, który następnie tworzy skrzep, który wiąże ze sobą powierzchnie jelita i ścianę brzucha3. Później fibroblasty i inne komórki migrują do przestrzeni adhezyjnej i wydzielają tkankę łączną4. W ciągu miesięcy lub lat zrost dojrzewa, rozwijając naczynia krwionośne i nerwy5.
Istnieje kilka komercyjnych produktów, które mają na celu zmniejszenie powstawania zrostów po operacji brzucha (np. Seprafilm). Wszystkie te produkty działają jak bariery mechaniczne i zatrzymują tworzenie się zrostów, zapobiegając fizycznemu kontaktowi między pętlami jelita a ścianą brzucha6,7. Pomimo dowodów z kontrolowanego badania, że chirurgiczna bariera adhezyjna zmniejsza powstawanie zrostów8, wielu chirurgów anegdotycznie było rozczarowanych skutecznością produktów bariery mechanicznej.
Obecnie nie ma terapii przeciwadhezyjnych opartych na lekach, co świadczy o tym, że dokładne procesy związane z powstawaniem zrostów są słabo poznane. Opracowanie terapii, która jest ukierunkowana na czynniki komórkowe lub molekularne biorące udział w tworzeniu zrostów, będzie wymagało lepszego zrozumienia zdarzeń zaangażowanych w tworzenie zrostu. Kilka grup zidentyfikowało szlaki molekularne, które mogą być ważne dla tworzenia adhezji9-11. Modele zwierzęce stanowią doskonałe środowisko do badania powstawania zrostów. Opublikowano wiele badań opisujących chirurgiczne tworzenie zrostów u kilku zwierząt, w szczególności u szczurów i myszy6,12-14. Biorąc pod uwagę nasze doświadczenie w badaniu zwłóknienia u myszy oraz szeroką dostępność myszy transgenicznych i przeciwciał na bazie myszy, wybraliśmy mysz jako nasz model do badania zrostów. W niniejszym artykule przedstawiamy opracowaną przez nas technikę w celu powtarzalnego i niezawodnego tworzenia zrostów brzusznych u myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Stanforda (IACUC) i jest zgodny ze wszystkimi instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt badawczych.
1. Tworzenie zrostów brzusznych
- Rozpocznij stosowanie diety antybiotykowej na tydzień przed zabiegiem.
- Autoklawuj narzędzia chirurgiczne i wstępnie podgrzej roztwór do irygacji soli fizjologicznej.
- Znieczulij mysz za pomocą 2% wziewnego izofluranu.
- Za pomocą maszynki do strzyżenia włosów, a następnie szybkiej (5 - 10 sekund) aplikacji środka do depilacji, usuń włosy z większości powierzchni brzucha. Dokładnie usuń środek do depilacji, delikatnie przecierając wilgotną gazą i opcjonalnie ostrożnie zanurzając dolną połowę myszy w ciepłej wodzie. Dokładnie osusz zwierzę.
- Umieść pysk zwierzęcia w stożku nosowym ze środkiem znieczulającym. Podczas całej operacji należy uważnie monitorować częstość oddechów zwierzęcia i w razie potrzeby zwiększać szybkość przepływu środka znieczulającego.
- Użyj urządzenia rozgrzewającego, takiego jak poduszka grzewcza lub lampa grzewcza, aby zapobiec hipotermii.
- Przed przygotowaniem brzucha zabezpiecz mysz paskami taśmy umieszczonymi powyżej i poniżej brzucha, aby zapobiec przesuwaniu się myszy podczas operacji. Zdezynfekuj brzuch betadyną, a następnie 70% etanolem. Uwzględnij jak najwięcej miejsca w przygotowaniu, w tym włosy na krawędziach ogolonego obszaru. Umieść sterylną serwetkę na myszy. (Rysunek 1)
- Wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny lub 3 μg w przypadku myszy 30 g.
- Wykonaj nacięcie skóry.
- Zaczynając od dolnej linii środkowej brzucha, chwyć skórę kleszczami i wykonaj płytkie pionowe nacięcie w skórze za pomocą ostrych nożyczek.
- Przenieś cięcie górą do ksyloidy nożyczkami. Uważaj, aby dostać się tylko do skóry.
- Ponieważ mięśnie brzucha są teraz widoczne pokrywające wnętrzności, chwyć linię środkową mięśni kleszczami i bardzo ostrożnie wykonaj w niej małe nacięcie ostrymi nożyczkami. Uważaj, aby przypadkowo nie przeciąć narządu jamy brzusznej.
- Po wejściu do przestrzeni otrzewnej z małym nacięciem i zobaczeniu, jak warstwa mięśniowa odsuwa się od narządów jamy brzusznej, przedłuż cięcie w górę i w dół, wkładając nożyczki do otworu i ostrożnie tnąc w obu kierunkach. Przedłuż nacięcie od ksyloidu wyżej do dołu nad pęcherzem. (Rysunek 2)
- Teraz, gdy jelita są odsłonięte, zlokalizuj jelito ślepe i delikatnie je zewnętrzizuj. Unikaj chwytania jelita ślepego ząbkowanymi lub ostrymi kleszczami. Zamiast tego użyj atraumatycznych kleszczy, takich jak kleszcze ząbkowane Adson.
- Przetrzyj jelito ślepe papierem ściernym.
- Delikatnie przecieraj całą powierzchnię po obu stronach jelita ślepego papierem ściernym o ziarnistości 100 przez 30 - 60 sekund, aż powierzchnia stanie się mniej błyszcząca, a na powierzchni pojawią się wybroczyny. Jeśli chirurg jest praworęczny, pomocne jest zorientowanie jelita ślepego z końcówką skierowaną w prawo i ułożenie jelita ślepego na lewym palcu wskazującym chirurga. (Rysunek 3)
- Szlifowanie należy wykonywać delikatnie, ponieważ łatwo jest przypadkowo spowodować perforację cienkiej ścianki jelita ślepego. Niewielka ziarnistość powinna być wyczuwalna, gdy papier ścierny przesuwa się po powierzchni jelita ślepego. Jeśli papier ścierny jest wielokrotnie wyczuwalny, gdy zaczepia się o jelito ślepe, prawdopodobnie spowoduje to rozdarcie ściany jelita ślepego. Obserwuj uważnie, aby upewnić się, że cząsteczki papieru ściernego nie wypruwają się i nie pozostają w jamie brzusznej, ponieważ może to spowodować nadmierną reakcję ciała obcego.
- Jeśli dojdzie do rozdarcia ściany jelita ślepego, należy przerwać zabieg i poddać zwierzę eutanazji.
- Jeśli naczynie krwionośne kąta zostanie przecięte papierem ściernym i spowoduje krwawienie, utrzymuj ucisk gazą do dwóch minut. Jeśli jednak krwawienie utrzymuje się po tym czasie, umieść szew monofilamentowy 7-0 w kształcie ósemki wokół miejsca krwawienia. To niezawodnie zatrzyma krwawienie w prawie wszystkich przypadkach. Należy uważać, aby nie wprowadzić dużej ilości ściany jelita ślepego do szwu, ponieważ grozi to przyczyną martwicy zaangażowanej części ściany.
- Uszkodzić prawą ścianę boczną brzucha.
- Użyj paska papieru ściernego, aby przetarć otrzewnową powierzchnię mięśnia prawej ściany bocznej brzucha. Szlifowanie w tym miejscu jest bardziej agresywne niż w jelicie ślepym i kontynuuj, aż cała powierzchnia prawej ściany bocznej brzucha będzie wyglądała na szorstką. Unikaj szlifowania tak mocno, aby skóra była widoczna przez otwory w warstwie mięśniowej. (Rysunek 4)
- Za pomocą wkrętaka igłowego Castro-Viejo umieść od dwóch do czterech jedwabnych ściegów w kształcie ósemki 4-0 w warstwie mięśniowej prawej ściany bocznej brzucha. Pozostaw ogony o długości około 5 mm. Uważaj, aby przypadkowo nie zahaczyć ściany jelita o szew. (Rysunek 5)
- Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej podgrzaną solą fizjologiczną kilkakrotnie przepłukać jelita. Skieruj strumień soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby nawodnić również wnętrze. Jeśli powierzchnia pod myszą nasiąknie, przesuń mysz nad powierzchnię lub wymień ją, aby uniknąć hipotermii.
- Użyj sterylnej gazy umieszczonej na nacięciu, aby wchłonąć nadmiar nawadniania.
- Weź szczyptę skrobi i posyp nią powierzchnię prawej ściany bocznej brzucha i po obu stronach jelita ślepego. (Rysunek 6)
- Upewnij się, że nie ma aktywnego krwawienia. Jeśli tak, użyj gąbki z gazy, aby wywrzeć nacisk bezpośrednio na miejsce krwawienia, aż ustanie. Jeśli krwawienie nie ustaje, należy założyć szew hemostatyczny, jak opisano powyżej.
- Za pomocą końca kleszczy i palca delikatnie wepchnij jelita z powrotem do jamy brzusznej. Umieść jelito ślepe obok szwów w prawej ścianie bocznej brzucha, aby zmaksymalizować tworzenie zrostu.
- Zamknij nacięcie brzucha.
- Używając wchłanialnego szwu plecionego 6-0, umieść ścieg biegowy w warstwie mięśniowej w górnej części nacięcia.
- Przesuń szew w dół w kierunku dolnej części nacięcia, łącząc warstwę mięśniową. Przesuń się o około 3 mm i bierz 3 mm gryzienia przy każdym nowym ściegu. Uważaj, aby przypadkowo nie ugryźć jelita podczas zakładania szwów.
- Na dnie nacięcia pozostaw pętlę szwu z poprzedniego ugryzienia i użyj jej do instrumentalnego zawiązania szwu. Przeciąć szew, pozostawiając 5 mm ogony.
- Powtórz powyższe trzy kroki z nylonowym szwem monofilamentowym 6-0, aby zamknąć skórę.
- Podawać podskórnie bolus z solą fizjologiczną o objętości 20 ml/kg (około 0,5 ml w przypadku myszy 30 g).
- Za pomocą suchej gazy dokładnie osusz całe zwierzę, ponieważ sierść grzbietowa ma tendencję do zamoczenia podczas nawadniania.
- Luźno owiń opatrunek samoprzylepny wokół brzucha, aby zakryć nacięcie. Należy uważać, aby opatrunkiem nie krępować nóg zwierzęcia ani mechaniki oddychania.
- Uważnie obserwuj zwierzę, gdy dochodzi do siebie po znieczuleniu. Podawaj buprenorfinę co 12 godzin przez 2-3 dni po zabiegu w celu kontroli bólu.
2. Pobieranie tkanki adhezyjnej
- Po pierwszym zabiegu należy odczekać co najmniej siedem dni. Ponownie autoklaw narzędzi chirurgicznych i znieczulenie myszy izofluranem.
- Wysterylizuj brzuch betadyną, a następnie 70% etanolem. Ogolić i wydepilować dodatkowe włosy z prawej strony brzucha, aby próbka adhezyjna zawierająca skórę nie była pokryta włosami, co utrudnia histologię.
- Użyj lewego nacięcia przyśrodkowego, ponieważ jelito często przykleja się do pierwotnego nacięcia. Zaczynając od dolnego końca brzucha, około 5 mm na lewo od dna pierwotnego nacięcia, chwyć skórę małymi ząbkowanymi kleszczami i wbij się w skórę ostrymi nożyczkami. Rozciągnij to cięcie wyżej do klatki piersiowej. (Rysunek 7)
- Za pomocą nożyczek naciąć warstwę mięśniową i po wejściu w przestrzeń otrzewnej przedłużyć cięcie do góry i dołu nacięcia. Pojawi się tkanka adhezyjna, która spowoduje, że jelito ślepe i jelito cienkie przylegają do prawej ściany bocznej brzucha, a być może także do pierwotnego nacięcia. (Rysunek 8)
- Używając nożyczek i zaczynając od krawędzi nacięcia, powyżej poziomu jelita ślepego, zacznij ciąć ścianę brzucha w kółko wokół obszaru, w którym przylega jelito.
- Na przemian powyżej i poniżej poziomu jelita ślepego, stopniowo przecinaj dookoła zrostu i zakończ okrąg, tworząc "wyspę" skóry i ściany brzucha przylegającą do jelita. (Rysunek 9)
- Ponownie za pomocą nożyczek przetnij jelito i oddziel przylegającą część od reszty jelita, uzyskując kanapkę tkanki, która składa się ze skóry i ściany brzucha z jednej strony, jelita z drugiej strony i tkanki adhezyjnej łączącej te dwie części pomiędzy. (Rysunek 10)
- Opcjonalnie użyj ostrych nożyczek, aby ostro oddzielić skórę od mięśnia ściany brzucha. W przypadku histologii rozważ pozostawienie przyczepionej skóry, ale w celu trawienia i izolacji komórek skórę można usunąć. Jeśli tkanka będzie używana do badania histologicznego, należy usunąć jak najwięcej materiału szwowego, nie naruszając nadmiernie powierzchni adhezyjnej. W celu trawienia i izolacji komórek dopuszczalne jest pozostawienie szwów na miejscu, o ile trawienie tkanek jest filtrowane.
- Po wycięciu tkanki adhezyjnej należy poddać mysz eutanazji przy użyciu humanitarnej metody zatwierdzonej przez instytucjonalną komisję ds. wykorzystania zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Siedem dni po operacji ślepa kiszka i ewentualnie okrężnica wstępująca, wątroba oraz pętle jelita cienkiego powinny przylegać do prawej ściany brzusznej. (Rysunek 8) Wycięta tkanka może zostać zatopiona w blokach i pocięta, co pozwoli na uzyskanie doskonałych preparatów histologicznych. (Rysunek 11, 12)
Przy prawidłowym wykonaniu procedury u 100% myszy po siedmiu dniach powinny wystąpić znaczne ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytycznymi etapami tej procedury są: dokładne ścieranie jelita ślepego bez powodowania perforacji, założenie szwów w bocznej ścianie brzucha i nałożenie odpowiedniej ilości skrobi. Papier ścierny należy nakładać tylko na jelito ślepe lub na niewielką określoną część jelita. Szerokie stosowanie papieru ściernego na duże ilości jelita cienkiego ma tendencję do powodowania znacznej niedrożności jelit. Uważaj, aby ścierać jelito ślepe z wystarczającą siłą, aby powierzchnia stała się szorstka, ale nie na tyle, aby ściana się...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
C.D.M. był wspierany przez American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. był wspierany przez California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L. i M.T.L. byli wspierani przez American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. był wspierany przez grant NIH R01 GM087609 oraz prezent od Ingrid Lai i Billa Shu na cześć Anthony'ego Shu. H.P.L. i M.T.L. byli wspierani przez Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine i The Oak Foundation. M.T.L. był wspierany przez Gunn/Olivier Fund.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podkładki chłonne Fisherbrand, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Polylined Sterylne pole, 18" x 24" | Busse Hospital Disonces | 696 | Wytnij prostokątny otwór o odpowiednim rozmiarze |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | ||
| Fisherbrand Sterylna bawełniana gazika, 4 "x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Maść okulistyczna Puralube petrolatum, tubka 1/8 uncji | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Krem do depilacji Nair | Church & Dwight Co. | 22339-05 | |
| Buprenex buprenorfina 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-5 | |
| Strzykawka insulinowa o pojemności 1 cm³, 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Povidone Jodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Waciki nasączone alkoholem Webcol | Covidien | 6818 | |
| Taśma do etykietowania labarotoryków ogólnego przeznaczenia | Rękawice chirurgiczne VWR | 89097-912 | |
| BioGel PI | Mö lnlycke Opieka zdrowotna | ALA42675Z | |
| Mikro kleszcze z zębami | Roboz | RS-5150 | |
| Cienkie nożyczki - ostre | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Kleszcze proste ząbkowane | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Sterownik igłowy Castro-Viejo | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Papier ścierny o ziarnistości 100 i grubości 1/4 arkusza | ACE Okucia | 1010446 | Pocięte w paski |
| 4-0 szew jedwabny, 30", igła SH | Ethicon | K831 | |
| 7-0 PDS II wchłanialny szew monofilamentowy, 30", igła BV-1 | Ethicon | Z135 | Zwykle występuje dwuramiennie. Przetnij szew w połowie drogi, aby wygenerować dwa użyteczne szwy. |
| Skrobia ryżowa | MP Biomedicals | 102955 | |
| 0,9% Chlorek sodu do nawadniania | Baxter | BHL2F7121 | Ciepły do 37 & deg; C przed użyciem |
| 10 ml strzykawka | Becton Dickinson | 309604 | |
| 6-0 Vicryl wchłanialny szew pleciony, 18", igła stożkowa RB-1 | Ethicon | J212H | |
| 6-0 Ethilon nylonowa monofilament szew, 18", igła P-3, | Ethicon | 1698G | |
| Tegaderm Przezroczysta ramka do opatrunku filmowego, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Przecięta na pół wzdłuż |
Bibliografia
- Ellis, H., et al. Adhesion-related hospital readmissions after abdominal and pelvic surgery: a retrospective cohort study. Lancet. 353 (9163), 1476-1480 (1999).
- Brochhausen, C., et al. Current strategies and future perspectives for intraperitoneal adhesion prevention. J Gastrointest Surg. 16 (6), 1256-1274 (2012).
- diZerega, G. S., Campeau, J. D. Peritoneal repair and post-surgical adhesion formation. Hum Reprod Update. 7 (6), 547-555 (2001).
- Hellebrekers, B. W., Kooistra, T. Pathogenesis of postoperative adhesion formation. Br J Surg. 98 (11), 1503-1516 (2011).
- Herrick, S. E., et al. Human peritoneal adhesions are highly cellular, innervated, and vascularized. J Pathol. 192 (1), 67-72 (2000).
- Beyene, R. T., Kavalukas, S. L., Barbul, A. Intra-abdominal adhesions: Anatomy, physiology, pathophysiology, and treatment. Curr Probl Surg. 52 (7), 271-319 (2015).
- ten Broek, R. P., et al. Benefits and harms of adhesion barriers for abdominal surgery: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 383 (9911), 48-59 (2014).
- Becker, J. M., et al. Prevention of postoperative abdominal adhesions by a sodium hyaluronate-based bioresorbable membrane: a prospective, randomized, double-blind multicenter study. J Am Coll Surg. 183 (4), 297-306 (1996).
- Cassidy, M. R., Sherburne, A. C., Heydrick, S. J., Stucchi, A. F. Combined intraoperative administration of a histone deacetylase inhibitor and a neurokinin-1 receptor antagonist synergistically reduces intra-abdominal adhesion formation in a rat model. Surgery. 157 (3), 581-589 (2015).
- Thaler, K., et al. Coincidence of connective tissue growth factor expression with fibrosis and angiogenesis in postoperative peritoneal adhesion formation. Eur Surg Res. 37 (4), 235-241 (2005).
- Hong, G. S., et al. Effects of macrophage-dependent peroxisome proliferator-activated receptor gamma signalling on adhesion formation after abdominal surgery in an experimental model. Br J Surg. 102 (12), 1506-1516 (2015).
- Whang, S. H., et al. In search of the best peritoneal adhesion model: comparison of different techniques in a rat model. J Surg Res. 167 (2), 245-250 (2011).
- Buckenmaier, C. C. 3rd, Pusateri, A. E., Harris, R. A., Hetz, S. P. Comparison of antiadhesive treatments using an objective rat model. Am Surg. 65 (3), 274-282 (1999).
- Rajab, T. K., et al. An improved model for the induction of experimental adhesions. J Invest Surg. 23 (1), 35-39 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
