Artykuł metodologiczny

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54456

⸱

4 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Stem Cell Laboratory, Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

W tym artykule

Podsumowanie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Streszczenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) mają zdolność do samoodnawiania się i generowania trzech głównych linii nerwowych - astrocytów, neuronów i oligodendrocytów. NSC i neuronalne komórki progenitorowe (NP) są powszechnie hodowane in vitro jako neurosfery. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób określić częstość występowania NSC w danej populacji komórek w warunkach klonalnych. Protokół rozpoczyna się od wysiewu komórek w gęstości, która pozwala na generowanie neurosfer klonalnych. Neurosfery są następnie przenoszone do komorowych szkiełek nakrywkowych i różnicowane w warunkach klonalnych w kondycjonowanym pożywce, co maksymalizuje potencjał różnicowania neurosfer. Na koniec częstotliwość NSC jest obliczana na podstawie zdolności do tworzenia neurosfery i multipotencji. Narzędzia tego protokołu obejmują ocenę potencjalnych markerów NSC, oczyszczanie NSC oraz możliwość odróżnienia NSC od NP. Wykonanie tej metody zajmuje 13 dni, czyli znacznie krócej niż obecne metody wyliczania częstotliwości NSC.

Wprowadzenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) to komórki ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które mogą się samoodnawiać i są multipotencjalne. NSC są po raz pierwszy określane podczas rozwoju embrionalnego przodomózgowia i nadal utrzymują się w dorosłym mózgu w określonych regionach, takich jak strefa podkomorowa (SVZ) komór bocznych i zakręt zębaty (DG) hipokampa. Wiele linii NSC jest wykorzystywanych w badaniach klinicznych w leczeniu udaru mózgu i innych chorób neurologicznych, takich jak choroba Battena1.

NSC i neuronalne progenitory (NPs) są rozmnażane w kulturze jako pływające 3-wymiarowe struktury sferoidalne zwane neurosferami. System hodowli neurosfery został opracowany przez Reynoldsa i Weissa na początku lat 90., kiedy odkryli, że embrionalne i dorosłe komórki korowe mogą dzielić się w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF)2-4. Neurosfery składają się z niejednorodnej mieszanki komórek składającej się z podklas na różnych etapach rozwoju5. Ze względu na obecność nanocząsteczek trudno jest dokładnie badać NSC z wykorzystaniem danych uzyskanych z neurosfer. Dlatego tak ważne jest wzbogacenie NSC z neurosfer. Obecnie stosuje się cztery główne metody wzbogacania NSC in vitro. Pierwszym z nich jest użycie markerów powierzchni komórek. Lewis-X (LeX) i CD133 (znany również jako Prominin1) są najbardziej widocznymi markerami NSC na powierzchni komórki6-9. Syndecan-1, Notch-1 i Integrin-beta1 to inne białka powierzchniowe, które wzbogacają NSC10. Drugim jest wykluczenie barwnika. Wykazano, że komórki populacji bocznej, które mają unikalną zdolność do wypompowywania fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA Hoechst 33342, są wzbogacone o NSC11. Trzecim jest zastosowanie selekcji morfologicznej. Wykazano, że komórki o zwiększonym rozmiarze i ziarnistości zawierają więcej NSC niż ich odpowiedniki5,12,13. Czwartym jest dodanie czynników przeżycia NSC do pożywki hodowlanej. Wykazano, że dodatek siarczanu chondroityny, proteoglikanu i apolipoproteiny E zwiększa przeżywalność NSC, a tym samym zwiększa częstość NSC14,15. Chociaż wiele markerów, w tym czynniki transkrypcyjne, jest związanych z NSC16,17, żaden z tych markerów nie jest w stanie wzbogacić NSC do czystości. Ze względu na brak ostatecznych markerów NSC wyzwaniem pozostaje ilościowe określenie NSC i odróżnienie ich od NP in vitro.

Początkowe badania używały testu tworzenia neurosfery (NFA) do ilościowego określenia NSC7,11,13. W tym teście zdysocjowane komórki są hodowane w celu utworzenia neurosfer i określa się liczbę neurosfer generowanych na każde 100 posianych komórek. Wartość ta jest określana jako Jednostka Tworzenia Neurosfery (NFU). NFU jest równe częstości NSC, jeśli wszystkie neurosfery powstają z NSC. Wykazano jednak, że NFU przeszacowuje częstotliwość NSC, ponieważ neurosfery są tworzone zarówno przez NSC, jak i wczesne NP5. W związku z tym niedokładne jest wyliczanie NSC wyłącznie na podstawie tworzenia neurosfery. Możliwe jest ilościowe określenie NSC na podstawie ich zdolności do samoodnawiania się, ekstensywnej proliferacji i generowania multipotencjalnych neurosfer.

NSC, które reagują na EGF i bFGF, zwykle przeżywają co najmniej dziesięć przejść, wykazując tym samym dużą zdolność do samoodnawiania się w kulturze4,18-20. NP, które również reagują na EGF i bFGF, mogą również generować neurosfery przez kilka pasaży, ale nie przez dłuższy czas. W związku z tym powszechnie przyjmuje się, że prawdziwe NSC mogą być wyliczone z dość dużą dokładnością w oparciu o formowanie się neurosfery dla co najmniej dziesięciu fragmentów. Jednak w większości badań samoodnawianie się jest zwykle mierzone na podstawie tworzenia się neurosfery drugorzędowej lub trzeciorzędowej ze względu na długi czas eksperymentalny wymagany do dziesięciu pasaży. W związku z tym wtórne NFA mogą być wykorzystane do szerokiego porównania zdolności do samoodnawiania się między populacjami, ale nie mogą być wykorzystane do dokładnego wyliczenia częstości NSC.

NSC mają większą zdolność proliferacyjną w porównaniu do NPs. Ta właściwość NSC została wykorzystana przez Louisa i wsp. opracowanie testu do oznaczania liczby NSC — testu komórek tworzących kolonie nerwowe (NCFCA)21,22. W tym teście pojedyncze komórki są hodowane przez 3 tygodnie w półstałej matrycy zawierającej kolagen. W tych warunkach hodowli wykazano, że komórki tworzące neurosfery o średnicy powyżej 2 mm są tripotencjalne i mogą samoodnawiać się przez długi czas. Komórki te są zdefiniowane jako NSC. W związku z tym NSC są skutecznie odróżniane od NP.

NSC mają zdolność różnicowania się na astrocyty, oligodendrocyty i neurony. W celu różnicowania neurosfer usuwa się czynniki wzrostu i dodaje surowicę do pożywki hodowlanej. Jeśli wszystkie trzy linie nerwowe są obserwowane w neurosferze, to komórka, która zainicjowała tę neurosferę, jest NSC. Test różnicowania ma jednak pewne ograniczenia. Po pierwsze, warunki hodowli stosowane do różnicowania mogą nie być optymalne dla generacji wszystkich trzech linii neuronalnych. W rzeczywistości w pojedynczym procesie różnicowania neurosfery dochodzi do znacznej śmierci komórki i głównie do generowania astrocytów (Tham M i Ahmed S, niepublikowane). Po drugie, pozostaje kwestia klonalności. W celu dokładnego zliczenia NSC, tworzenie i różnicowanie neurosfer musi odbywać się w warunkach klonalnych, w których każda neurosfera powstaje z pojedynczej komórki. W masowych hodowlach zawiesinowych agregacja zachodzi zarówno na poziomie komórkowym, jak i neurosfery23-25. W związku z tym możliwe jest, że każda neurosfera powstaje z wielu komórek lub neurosfer, co komplikuje liczenie neurosfer i ocenę multipotencji. Najnowsze dowody wskazują, że agregacja komórek nie zachodzi przy niskiej gęstości posiewu wynoszącej 0,5 komórki/μl lub mniejszej oraz gdy płytki hodowlane nie są przesuwane podczas tworzenia neurosfery15. Tak więc hodowla komórek o tak niskiej gęstości zapewniłaby klonalność.

Obecnie, NCFCA jest najczęściej używaną metodą do odróżniania NSC od NP i wyliczania częstotliwości NSC. NCFCA wymaga jednak stosunkowo długiego czasu wynoszącego trzy tygodnie. W tym miejscu opisujemy protokół wyliczania częstotliwości NSC w oparciu o zdolność NSC do tworzenia multipotencjalnych neurosfer. Wykonanie tego protokołu zajmuje tylko 13 dni. NCFCA zapewnia klonalność, ponieważ macierz kolagenowa zapobiega ruchowi neurosfer. Warunki hodowli zastosowane w tym protokole pozwalają również na utrzymanie klonalności przez cały czas. Na przykład zastosowanie szkiełek nakrywkowych z 50-dołkową komorą zapewnia, że neurosfery będą się różnicować bez kontaktu ze sobą. Ponadto używamy kondycjonowanego podłoża, które dostarcza czynniki neurotroficzne podczas różnicowania, aby zmaksymalizować potencjał różnicowania neurosfer (ryc. 1).

Protokół

Leczenie zwierząt zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC i NACLAR oraz zatwierdzone przez departament zwierząt ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
UWAGA: Kultury neurosfery przygotowano z przodomózgowia embrionalnych (E14) myszy C57BL/6, jak opisano wcześniej5.

1. Kultura neurosfer klonalnych próbek (Dzień 1)

  1. Przygotować pożywkę wzrostową NSC, łącząc zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium/Nutrient F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco z suplementem B27 (stężenie końcowe: 1x), EGF (stężenie końcowe: 20 ng/ml), bFGF (stężenie końcowe: 10 ng/ml) i penicyliną/streptomycyną (stężenie końcowe: 1x).
  2. Dysocjuj mysie neurosfery E14.5 w 1 ml pożywki wzrostowej NSC i 1 ml 0,05 N wodorotlenku sodu przez 7 minut w RT. Od czasu do czasu pipetuj komórki w górę iw dół, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Dodaj 1 ml 0,05 N kwasu solnego, aby zneutralizować zasadę.
    UWAGA: Komórki neurosfery wysiewa się w ilości 20 000 komórek/ml w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm i hoduje przez 5 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Oczekiwany plon to około 10 milionów komórek na 10 cm talerza. Komórki te są następnie dysocjowane i wysiewane w gęstości klonalnej, jak opisano odpowiednio w krokach 1.2 i 1.3.
    1. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru.
  3. Wysiewaj pojedyncze mysie komórki neurosfery E14,5 o gęstości 50 komórek/ml lub mniejszej w pożywce wzrostowej NSC o pojemności 100 μl w 96-dołkowym naczyniu. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 w, aby wytworzyć neurosfery klonalne.
    UWAGA: Klonalność jest zapewniona podczas tworzenia neurosfery przy tej gęstości, ponieważ komórki nie stykają się ze sobą.

2. Kultura neurosfer dla podłoża kondycjonowanego (Dzień 3)

  1. Oddziel neurony myszy E14.5 zgodnie z opisem w kroku 1.2.
  2. Wysiewaj pojedyncze komórki z mysich neurosfer E14.5 o gęstości 20 000 komórek/ml w 10 ml pożywce wzrostowej NSC w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 dni, aby wytworzyć masowo hodowane neurosfery.

3. Przygotowanie podłoża kondycjonowanego neurosferą (Dzień 8)

  1. Przygotować roztwór powlekający, mieszając 700 μl 0,01% poli-L-lizyny (PLL), 70 μl 1 mg/ml lamininy i 6,230 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Pokryć 10 cm naczynie hodowlane 7 ml roztworu PLL/Lamininy przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przenieś wszystkie neurosfery z hodowlą masową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować neurosfery przy 171 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć supernatant.
  4. Przygotować pożywkę różnicującą NSC, łącząc pożywkę DMEM/F12 z witaminą B27 (stężenie końcowe: 1x) i surowicą bydlęcą płodu (FBS) (stężenie końcowe: 0,5%) Dodać 10 ml pożywki różnicującej NSC do neurosfer. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby ponownie zawiesić neurosfery.
  5. Odessać PLL/Lamininę z naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i przemyć raz 10 ml PBS. Przenieś wszystkie neurosfery do 10-centymetrowej płytki hodowlanej pokrytej PLL/Lamininą. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby neurosfery przylgnęły do naczynia.

4. Oznaczanie NFU neurosfer próbki (Dzień 8)

  1. Policz liczbę neurosfer (wysianych w dniu 1; sekcja 1) utworzonych w każdej studzience pod mikroskopem.
    UWAGA: Określ liczbę neurosfer utworzonych na 100 platerowanych komórek, co daje NFU.

5. Przeniesienie neurosfer próbki do 50-dołkowego szkiełka nakrywkowego (Dzień 8)

  1. Pokryć każde studzienki 50-dołkowego szkiełka nakrywkowego 10 μl roztworu powlekającego PLL/Laminin przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Przygotować roztwór do powlekania zgodnie z opisem w kroku 3.1.
  2. Przygotować 3 stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające po 30 ml PBS każda. Za pomocą sterylnych kleszczyków usuń powlekane szkiełko nakrywkowe z 50-dołkową komorą. Zanurzyć szkiełko nakrywkowe z komorą w pierwszej probówce PBS, a następnie w drugiej, a następnie trzeciej probówce PBS, aby zmyć roztwór powlekający.
  3. Odessać pozostałą ciecz z dołków szkiełka nakrywkowego z komorą.
  4. Delikatnie odpipetować wszystkie podłoża i neurosfery z każdej studzienki 96-dołkowej szalki i przenieść ją do pojedynczej płytki hodowlanej o średnicy 10 cm.
  5. Pod mikroskopem pobrać próbkę neurosfery za pomocą mikropipety P10 wyposażonej w końcówkę do pipety o pojemności 10 μl. Upewnij się, że za każdym razem pobierana jest tylko jedna neurosfera, ustawiając kolumnę pipety na 2 μl. Dla każdej neurosfery należy użyć nowej końcówki do pipety.
  6. Przenieś neurosferę na środek studzienki powlekanego 50-dołkowego szkiełka nakrywkowego.
  7. Powtarzaj kroki 5.5 i 5.6, aż każda studzienka szkiełka nakrywkowego z komorą będzie zawierała neurosferę.
    UWAGA: Neurosfery można pobrać pod mikroskopem umieszczonym w okapie z przepływem laminarnym lub na blacie stołowym.
  8. Dodać 10 μl pożywki różnicującej NSC do każdego dołka szkiełka nakrywkowego w komorze nakrywkowej. Umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm i odpipetować PBS wzdłuż krawędzi naczynia, aby zapobiec wysuszeniu pożywki różnicującej NSC. Umieść do dwóch komorowych szkiełek nakrywkowych w jednym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm. Szkiełko nakrywkowe w komorze (znajdujące się w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm) inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

6. Różnicowanie neurosfer próbki (Dzień 9)

  1. Przenieść pożywkę różnicującą z neurosfer hodowanych luzem (z sekcji 3) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Upewnij się, że 2-3 ml pożywki różnicującej pozostało w naczyniu hodowlanym, aby zapobiec oderwaniu się przylegających komórek. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml przepuść pożywkę różnicującą przez filtr 0,2 μm, aby usunąć wszelkie komórki lub zanieczyszczenia.
  2. Przefiltrowaną pożywkę różnicującą przenieść z powrotem do 10-centymetrowej płytki hodowlanej zawierającej przylegające komórki.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe z komorą na pożywce różnicującej w sposób odwrócony, tak aby neurosfery próbki były skierowane w dół. Inkubować szkiełko nakrywkowe w komorze z pożywką różnicującą przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Neurosfery próbki stykają się z podłożem różnicującym, ale nie stykają się z komórkami różnicującymi się poniżej.

7. Ustalanie zróżnicowanych neurosfer (Dzień 12)

  1. Delikatnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z komorą z naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm za pomocą sterylnych kleszczyków. Delikatnie zanurz szkiełko nakrywkowe w PBS, aby zmyć kondycjonowane podłoże.
  2. Zdejmij silikonową uszczelkę ze szkiełka nakrywkowego. Rób to delikatnie i powoli, aby uniknąć zerwania szkiełka nakrywkowego. Zwróć uwagę na stronę, po której przylegają zróżnicowane neurosfery.
  3. Odpipetować 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) na kawałek folii parafinowej przycięty do rozmiaru szkiełka nakrywkowego. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej tak, aby neurosfery były skierowane w dół w kontakcie z PFA. Napraw neurosfery na 20 minut przy RT.
    Uwaga: PFA jest toksyczny zarówno w postaci cieczy, jak i pary i jest palny. Unikać wdychania oparów oraz kontaktu ze skórą i oczami. Z PFA należy zawsze obchodzić się w wentylowanym dygestorium.
  4. Odpipetować 1 ml PBS na kawałek folii parafinowej. Umyj neurosfery, delikatnie umieszczając szkiełko nakrywkowe z neurosferami skierowanymi w dół w kontakcie z PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórz krok 7.4 jeszcze dwa razy.

8. O4 Barwienie zróżnicowanych neurosfer (Dzień 12)

  1. Przygotować 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Odpipetować 1 ml 3% BSA na kawałek folii parafinowej. Zablokuj neurosfery, delikatnie umieszczając szkiełko nakrywkowe (z neurosferami skierowanymi w dół) w kontakcie z BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odpipetować 1 ml mysiego przeciwciała anty-O4 IgM (rozcieńczenie 1:300 w 3% BSA) na kawałek filmu parafinowego i umieścić szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej z neurosferami skierowanymi w dół w kontakcie z przeciwciałem. Pozostawić barwienie O4 na 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Umyć szkiełko nakrywkowe dwukrotnie za pomocą PBS, jak opisano w kroku 7.4.
  4. Pobrać pipetę 1 ml sprzężonego z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym przeciwciała anty-mysiego IgM (rozcieńczenie 1:500 w 3% BSA) na kawałek folii parafinowej i umieścić szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej z neurosferami skierowanymi w dół w kontakcie z przeciwciałem. Pozostaw na 1 godzinę w RT w ciemności.
    UWAGA: Od tego kroku wykonuj barwienie immunologiczne w ciemnym otoczeniu.
  5. Umyć szkiełko nakrywkowe dwukrotnie za pomocą PBS, jak opisano w kroku 7.4.

9. Tuj1 i barwienie fibrylarnego białka fibrylarnego (GFAP) w zróżnicowanych neurosferach (Dzień 12)

  1. Przygotować roztwór przepuszczalny, dodając Triton-X 100 (stężenie końcowe: 0,5%) do 3% BSA. Odpipetować 1 ml roztworu przepuszczalnego na kawałek folii parafinowej. Umieść szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej z neurosferami skierowanymi w dół w kontakcie z roztworem przepuszczalnym przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Umyć szkiełko nakrywkowe dwukrotnie za pomocą PBS, jak opisano w kroku 7.4.
  3. Odpipetować 1 ml mysiego przeciwciała anty-Tuj1 IgG2a (rozcieńczenie 1:500 w 3% BSA) i króliczego przeciwciała anty-GFAP IgG (rozcieńczenie 1:1,000 w 3% BSA) na kawałek folii parafinowej i umieścić szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej z neurosferami skierowanymi w dół w kontakcie z przeciwciałami. Pozostawić barwienie Tuj1 i GFAP na 2 godziny w RT.
    UWAGA: Oba przeciwciała można przygotować jako pojedynczy roztwór.
  4. Umyć szkiełko nakrywkowe dwukrotnie za pomocą PBS, jak opisano w kroku 7.4.
  5. Odpipetować 1 ml sprzężonych z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym anty-mysim IgG2a (rozcieńczenie 1:500 w 3% BSA) i dalekoczerwonych przeciwciał drugorzędowych anty-króliczych IgG (rozcieńczenie 1:500 w 3% BSA) na kawałku filmu parafinowego i umieścić szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej z neurosferami skierowanymi w dół w kontakcie z przeciwciałami. Pozostaw na 1 godzinę w RT.
    UWAGA: Oba przeciwciała można przygotować jako pojedynczy roztwór.
  6. Umyć szkiełko nakrywkowe dwukrotnie za pomocą PBS, jak opisano w kroku 7.4.
  7. Rozcieńczyć roztwór podstawowy 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do 300 nM w PBS. Odpipetować 1 ml DAPI na kawałek folii parafinowej i umieścić szkiełko nakrywkowe na folii parafinowej z neurosferami skierowanymi w dół w kontakcie z DAPI na 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu barwienia jąder.
  8. Umyj szkiełko nakrywkowe raz PBS i dwa razy wodą dejonizowaną, jak opisano w kroku 7.4. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą odpowiedniego medium montażowego i pozostaw do wyschnięcia O/N w temperaturze RT.

10. Obrazowanie zróżnicowanych neurosfer (Dzień 13)

  1. Obrazuj neurosfery pod mikroskopem konfokalnym za pomocą 40X. Użyj laserów o długości fali 488 nm, 594 nm i 647 nm, aby wykryć odpowiednio oligodendrocyty, neurony i astrocyty.
  2. Określ procent neurosfer unipotencjalnych, bipotencjalnych i tripotencjalnych.
    UWAGA: Potencja jest określana przez zdolność neurosfery do różnicowania się w trzy linie nerwowe - oligodendrocyty, neurony i astrocyty5,14,15,26. Oligodendrocyty identyfikuje się na podstawie dodatniego barwienia na obecność O4 (sekcja 8). Neurony są identyfikowane przez dodatnie barwienie dla Tuj1 (sekcja 9). Astrocyty identyfikuje się na podstawie dodatniego barwienia na obecność GFAP (sekcja 9). Neurosfera unipotentna różnicuje się tylko w jedną z linii i powinna pozytywnie zabarwić się na O4, GFAP lub Tuj1. Bipotentna neurosfera różnicuje się w dowolne dwie linie i powinna pozytywnie zabarwić O4 i GFAP lub O4 i Tuj1 lub GFAP i Tuj1. Neurosfera tripotencjalna różnicuje się we wszystkich trzech liniach i powinna pozytywnie barwić O4, GFAP i Tuj1.
  3. Określ częstość występowania NSC w populacji będącej przedmiotem zainteresowania, używając następującego wzoru:
    Częstość NSC = (NFU x % neurosfer tripotencjalnych) / 100%.

Wyniki

Wykorzystaliśmy ten protokół do oceny zdolności LeX, znanego markera powierzchniowego komórek NSC7, do wzbogacania populacji NSC. Dane z tego badania zostaną wykorzystane do zilustrowania sposobu zliczania NSC za pomocą testów klonalnych opisanych w protokole. Komórki neurosfer mysich z etapu E14.5 inkubowano z przeciwciałem przeciwko LeX. Następnie komórki wykazujące ekspresję LeX (LeX+) oraz komórki niewykazujące ekspresji LeX (LeX-) wysiano w zagęszczeniu 50 cells/mL za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i pozostawiono na 1 wk w celu generowania klonalnych neurosfer. Obrazowanie time-lapse pokazuje, że neurosfery wygenerowane przy zagęszczeniu 50 cells/mL są klonalne (Rysunek 2). Wyznaczono NFU dla komórek LeX+ i LeX-. Wykazano, że komórki LeX+ mają istotnie wyższą zdolność do tworzenia neurosfer w porównaniu z komórkami LeX- (Rysunek 3g). Wygenerowane neurosfery poddano następnie różnicowaniu w warunkach klonalnych, a następnie barwieniu immunocytochemicznemu i obrazowaniu (Rysunek 3a-e). Komórki LeX+ generują istotnie więcej neurosfer tripotencjalnych niż komórki LeX- (Rysunek 3f). Częstotliwość NSC obliczono następnie na podstawie NFU oraz % neurosfer tripotencjalnych (Rysunek 3g). Selekcja oparta na LeX zwiększa częstotliwość NSC ponad 14-krotnie, co potwierdza rolę LeX jako markera NSC. Wyznaczyliśmy również częstotliwość NSC w neurosferach mysich E14.5 przy użyciu tego protokołu27 oraz metody NCFCA28. Obie metody wskazują na porównywalną częstotliwość NSC wynoszącą około 2% w neurosferach mysich E14.5.

Schemat różnicowania klonalnych neurosfer; szkiełko podstawowe, filtracja medium, przyleganie neurosfer.
Rycina 1. Protokół różnicowania neurosfer w warunkach klonalnych. Próbki neurosfer hodowanych w warunkach klonalnych są umieszczane pojedynczo w każdym dołku szkiełka podstawowego z 50 komorami pokrytym PLL/Lamininą i pozostawione do przylegania przez noc (O/N). Tego samego dnia neurosfery z hodowli masowej są wysiewane w medium do różnicowania na 10 cm szalce pokrytej PLL/Lamininą i pozostawione do przylegania przez noc. Następnego dnia medium warunkujące z hodowli masowych neurosfer jest filtrowane i wlewane z powrotem do 10 cm szalki. Następnie próbki neurosfer są odwrócone na medium warunkujące i pozostawione do różnicowania przez 3-4 dni28. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Sekwencja wzrostu kolonii, obrazy mikroskopowe, agregacja komórek w czasie; pasek skali 100 µm.
Rysunek 2. Wzrost klonalnej neurosfery. Komórki pochodzące z neurosfer E14.5 zostały rozdzielone i wysiane w zagęszczeniu 50 cells/mL w płytce 96-dołkowej. Pojedyncze komórki śledzono przez 6 d za pomocą obrazowania time-lapse. Przedstawiono obrazy jednej takiej komórki rozwijającej się w neurosferę. Należy zauważyć, że neurosfera zachowuje klonalność. (a) 0 dni; (b) 1.19.45; (c) 2.95.37; (d) 3.32.76; (e) 4.46.53; (f) 5.61.44; gdzie pierwsza liczba odnosi się do dnia, druga liczba do ułamka dnia, a trzecia liczba do ułamka h. Powiększenie 10X. Pasek skali, 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Różnicowanie neurosfer, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wykres słupkowy procentowej zawartości neuroprogenitorów.
Rysunek 3. Różnicowanie klonalnych neurosfer i wyznaczanie częstotliwości występowania NSC. Pojedyncze neurosfery zostały wybrane i różnicowane w 50-dołkowej komorze na szkiełkach podstawkowych przez 3 d. Reprezentacyjny obraz tripotentnej neurosfery barwionej (a) DAPI oraz poddanej immunobarwieniu na (b) GFAP, (c) Tuj1 i (d) O4. (e) Przedstawia nałożenie obrazów (a) - (d). Pasek skali, 65 µm. (f) Procent unipotentnych, bipotentnych i tripotentnych neurosfer wygenerowanych przez komórki LeX+ i LeX- (średnia ±SEM; n = 3). (g) Częstotliwość NSC w komórkach LeX+ i LeX- obliczona jako iloczyn NFU i procenta tripotentnych neurosfer. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisujemy wyliczanie NSC w warunkach klonalnych. Krytyczne kroki obejmują użycie świeżej pożywki do wzrostu i różnicowania NSC, a także użycie świeżo przygotowanego roztworu PLL/Laminin do pokrycia komorowych szkiełek nakrywkowych, a także szalek hodowlanych. Zapewnia to optymalne warunki wzrostu i różnicowania neurosfer. Kluczowe znaczenie ma stosowanie dobrej jakości przeciwciał w celu skutecznego wykrywania neuronów i komórek glejowych, a także selektywne wybieranie neurosfer klonalnych, które nie mają kontaktu z innymi neurosferami. Ponadto ważne jest, aby upewnić się, że wybrane neurosfery nie wysychają. Zaleca się dodanie 10 μl pożywki różnicującej do każdego dołka po pobraniu co 10 neurosfer. Ważne jest, aby używać jednego komorowego szkiełka nakrywkowego w jednym naczyniu o średnicy 10 cm na próbkę, aby uniknąć przesłuchów między neurosferami z różnych próbek. Jeśli dwa szkiełka nakrywkowe (każde zawierające neurosfery z różnych próbek) zostaną umieszczone w tym samym 10-centymetrowym naczyniu, neurosfery z jednego szkiełka nakrywkowego mogą uwalniać czynniki, które mogą zmienić skłonność neurosfer w drugim szkiełku nakrywkowym do różnicowania się w określone linie. Dwa szkiełka nakrywkowe w tym samym naczyniu o średnicy 10 cm mogą również powodować pomieszanie między próbkami.

W przypadku, gdy częstotliwość NFU lub NSC jest niższa niż oczekiwano, należy upewnić się, że używane są neurosfery o niskiej liczbie pasaży. Ważne jest również, że zdrowe neurosfery o niskim pasażu są wykorzystywane do generowania kondycjonowanego podłoża. Następnie, jeśli neurosfery są hodowane w studzienkach o małej średnicy, takich jak w naczyniu 96-dołkowym, trudno będzie manewrować i wybierać neurosfery za pomocą mikropipety. W takim przypadku przenieś neurosfery do większego naczynia hodowlanego, takiego jak naczynie 6-dołkowe, przed pobraniem. Niektóre z pobranych neurosfer mogą oderwać się od komorowego szkiełka nakrywkowego podczas hodowli i barwienia immunologicznego. Zminimalizowanie ruchu komorowego szkiełka nakrywkowego podczas hodowli i mniej intensywne mycie podczas barwienia immunologicznego pomogłoby uniknąć oderwania neurosfer.

Wstępne badania określiły ilościowo NSC przy użyciu wyłącznie NFA7,11,13. Jednak NFA przeszacowuje częstotliwość NSC, ponieważ zarówno NSC, jak i wczesne NP generują neurosfery5. Louis i in. opracowali inną metodę ilościowego oznaczania NSC, znaną jako NCFCA21,22. NCFCA polega na hodowli pojedynczych komórek w macierzy opartej na kolagenie w celu zapewnienia klonalności i wykazano, że neurosfery o średnicy powyżej 2 mm są tworzone tylko przez NSC. Podobnie jak w przypadku NCFCA, klonalność jest zapewniona w całym tym protokole. Osiąga się to poprzez generowanie neurosfer o gęstości klonalnej i różnicowanie neurosfer w komorowych szkiełkach nakrywkowych. Stosowanie szkiełek nakrywkowych z komorą ma wiele zalet. Szkiełko nakrywkowe z komorą umożliwia różnicowanie się neurosfery każdej próbki bez fizycznego kontaktu z innymi neurosferami próbki, zapewniając w ten sposób klonalność podczas różnicowania. Szkiełko nakrywkowe z komorą można zawiesić na podłożu różnicującym, aby umożliwić ciągłe kondycjonowanie neurosfer próbki i zapewnić maksymalne różnicowanie. W przypadku braku kondycjonowanej pożywki i surowicy podczas różnicowania, przeżywalność neurosfer zmniejsza się, a neurosfery generują głównie astrocyty (Tham M i Ahmed S, niepublikowane). Ponadto neurosfery wybarwione immunologicznie mogą być wygodnie przechowywane przez długi okres czasu, a szkiełka nakrywkowe z komorą można montować bezpośrednio na szkiełkach mikroskopowych. Dodatkowo, obrazowanie neurosfer wybarwionych immunologicznie jest łatwe, ponieważ można szybko zlokalizować neurosferę w małej studzience, uchwycić obraz i przejść do następnej studzienki.

Określiliśmy częstość NSC w hodowli neurosfery myszy E14.5 przy użyciu zarówno protokołu opisanego w tym manuskrypcie27 , jak i NCFCA28. Częstość NSC w mysich neurosferach E14,5 wyznaczona obiema metodami jest porównywalna. NCFCA wymienia NSC, które są multipotencjalne i mają długoterminową zdolność do samoodnawiania się. Ponieważ częstotliwość NSC z naszej metody jest porównywalna z częstotliwością z NCFCA, odczyt z naszego protokołu nie wydaje się przeszacowywać częstotliwości NSC. NCFCA wymaga trzech tygodni na ukończenie i obejmuje głównie posiewanie komórek i uzupełnianie pożywki. Opisany tutaj protokół wymaga 13 dni na wykonanie i obejmuje inną serię kroków, np. wybieranie neurosfery i barwienie immunologiczne. Protokół ten może służyć jako alternatywna metoda wyliczania NSC. Naukowcy mogą używać zarówno NCFCA, jak i tego protokołu do weryfikacji częstości występowania NSC w swoich próbkach.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że w dniu 8 należy wykonać szereg ważnych kroków. Przygotowanie kondycjonowanej pożywki, oznaczenie NFU neurosfer próbki i przeniesienie neurosfer próbki do 50-dołkowego szkiełka nakrywkowego z komorą musi zostać przeprowadzone w 8 dniu. Wykonanie tych kroków może zająć trochę czasu. Ponadto wymaga praktyki, aby wykonać te kroki w skuteczny sposób.

Neurosfery są szeroko stosowane do badania funkcji i zachowania NSC. Jednak neurosfery składają się zarówno z NSC, jak i NPs. Dlatego ważne jest, aby wzbogacić NSC z neurosfer w celu badania biologii NSC. Obecnie markery powierzchni komórek, właściwości wykluczania barwnika, a także wielkość i ziarnistość komórek są wykorzystywane do wzbogacania NSC6,7,9-13,29,30. Protokół ten mógłby zostać wykorzystany do ilościowego określenia wzbogacenia NSC o potencjalne markery NSC oraz do ułatwienia poszukiwania ostatecznego markera NSC. W czterech ostatnich badaniach wykorzystano ten protokół do wyliczenia częstości NSC5,14,15,26.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań (A*STAR) w Singapurze za sfinansowanie tych badań.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml Stożkowe probówki wirówkowe BD
50 ml BD352070
Sterylna strzykawka 20 ml   
50 ml BD300144
Płodowa surowica bydlęca (FBS) BiowestS1810
Mysie przeciwciało anty-Tuj1 IgG2aCovanceMMS-435P-100
Królicze przeciwciało anty-GFAP IgGDakoZ033401
Hemocytometr Mikroskop Hausser Scientific3100
zamontowany na okapie z przepływem laminarnym Szkiełka LeicaMZ6
Marienfeld-superior1000200
Mysie przeciwciało anty-O4 IgM Merck MilliporeMAB345
HydromountNational DiagnosticsHS-106
MikroskopNikon EclipseTS100-F
Kaptur z przepływem laminarnymNuAireNU-543
96-dołkowe naczynia hodowlaneNUNC167008
10-centymetrowe naczynia hodowlane NUNC150350
Folia parafinowaParafilmPM999
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) PeprotechAF-100-15
Rekombinowany ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) Peprotech100-18B
0,2 &mikro; Filtr M Sartorius Stedim16534-K
0,45 &mikro; m filtrSartorius Stedim16555-K
1,0 N Wodorotlenek sodu (NaOH) Sigma-AldrichS2770
1,0 N Kwas solny (HCl) Sigma-AldrichH9892
Błękit trypanowy Sigma-AldrichT8154
Poli-L-Lizyna (PLL) Sigma-AldrichP8920
Proszek paraformaldehydu (PFA) Sigma-AldrichP6148Toksyczna
albumina surowicy bydlęcej (BSA) w proszku Sigma-AldrichA7906
Szkiełka nakrywkowe 50-dołkowe Sigma-AldrichC7735
Płytka mieszająca z funkcją podgrzewania StuartUC152
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320-033
B27 suplementThermo Fisher Scientific17504044
Penicylina-Streptomycyna Thermo Fisher Scientific15140-122
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgMThermo Fisher ScientificA21042
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-mysie IgG2aThermo Fisher ScientificA21135
Alexa Fluor 647 kozie przeciwciało anty-królicze IgGThermo Fisher ScientificA31573
dichlorowodorek 4',6'-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) Thermo Fisher ScientificD3571
Wirówka do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific  Pipety Pasteura RT1 75002383
Termo Fisher Scientific10006021
Inkubator
Wentylowany dygestoria
Aspirator
Mikroskop
Mikropipety
Końcówki
Pipety plastikowe Pipety
wielokanałowe
Szklana zlewka
Sterylne kleszcze
pH-metr
352096 Sterylna strzykawka BD 300141 COkonfokalnydo mikropipet

Bibliografia

  1. Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
  2. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
  3. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
  5. Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
  6. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
  7. Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
  8. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
  9. Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
  10. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
  11. Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
  12. Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
  13. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  14. Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341(2010).
  15. Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
  16. Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
  17. Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
  18. Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  19. Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
  20. Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
  21. Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639(2011).
  22. Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
  23. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
  24. Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
  25. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
  26. Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
  27. Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
  28. Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
  29. Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540(2011).
  30. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie neurosfercz stotliwo NSCr nicowanie neurosferliczenie kom reklaminki z komoramimedium kondycjonowaneocena multipotencjimarker LeX
Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.