Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54458

⸱

16 listopada 2016

 ,  , 
1Center for Bio/Molecular Science & Engineering, Naval Research Laboratory, 2Department of Emergency Medicine, Indiana University of School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Streszczenie

Rosnące zainteresowanie zastosowaniem technik biologii syntetycznej do programowania pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV) prowadzi do bardzo interesujących i unikalnych zastosowań dla OMV, gdzie tradycyjne nanocząstki okazują się zbyt trudne do syntezy. Do tej pory wykazano, że wszystkie bakterie Gram-ujemne wytwarzają OMV, co świadczy o pakowaniu różnych ładunków, które obejmują małe cząsteczki, peptydy, białka i materiał genetyczny. Ze względu na ich zróżnicowany ładunek, OMV są zaangażowane w wiele procesów biologicznych, od komunikacji komórka-komórka po transfer genów i dostarczanie czynników wirulencji, w zależności od tego, które bakterie wytwarzają OMV. Dopiero niedawno bakteryjne OMV stały się dostępne do stosowania w szerokim zakresie zastosowań dzięki opracowaniu technik kontroli i bezpośredniego pakowania rekombinowanych białek do OMV. Protokół ten opisuje metodę produkcji, oczyszczania i stosowania OMV pakowanego w enzymy, zapewniającą poprawę ogólnej produkcji rekombinowanego enzymu, zwiększenie pęcherzyków i zwiększoną stabilność enzymu. Pomyślne wykorzystanie tego protokołu spowoduje stworzenie szczepu bakteryjnego, który jednocześnie wytwarza rekombinowane białko i kieruje je do enkapsulacji OMV poprzez stworzenie syntetycznego połączenia między rekombinowanym białkiem a białkiem kotwiczącym błonę zewnętrzną. Protokół ten zawiera również szczegółowe informacje na temat metod izolowania OMV z kultur bakteryjnych, a także właściwych technik obchodzenia się z nim oraz kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas dostosowywania tego protokołu do innych unikalnych zastosowań, takich jak: dostarczanie leków farmaceutycznych, diagnostyka medyczna i remediacja środowiska.

Wprowadzenie

Przedstawiona tutaj jest metoda projektowania, produkcji i oczyszczania pęcherzyków zewnętrznej błony bakteryjnej (OMV) naładowanych enzymami. OMV to małe, głównie jednowarstwowe proteoliposomy o wielkości od 30 do 200 nm1,2. Wszystkie bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, które zostały do tej pory przebadane, wykazały uwalnianie OMV lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) ze swojej powierzchni3,4. Dokładny mechanizm, za pomocą którego wytwarzane są OMV, nie został jeszcze w pełni wyjaśniony ze względu na zróżnicowane populacje bakterii, które je wydzielają, a także różne funkcje, które pełnią. Wykazano, że OMV transportuje szeroki zakres ładunków, od małych cząsteczek, peptydów i białek do materiału genetycznego służącego różnorodnym złożonym funkcjom sygnalizacji, translokacji genów i wirulencji5,6.

Dokładne mechanizmy biogenezy OMV nie są dobrze opisane i wydają się różnić między gatunkami bakterii. Mimo to opracowaliśmy metodę zwiększania wydajności pakowania rekombinowanego białka w OMV poprzez stworzenie syntetycznego połączenia między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a bardzo obfitym białkiem endogennym dla zewnętrznej błony bakteryjnej, a następnie OMV. W przypadku braku syntetycznego wiązania lub sztucznie wbudowanego powinowactwa między białkiem o ekspresji rekombinowanej a OMV obserwowana wydajność pakowania jest bardzo niska7. Wyniku tego należy się spodziewać, ponieważ włączenie białek do OMV następuje albo poprzez losową przypadkową enkapsulację w dokładnym momencie tworzenia się OMV na powierzchni bakterii, albo poprzez ukierunkowane pakowanie przez mechanizmy, które nie są dobrze poznane. Zaobserwowano pewien sukces w pakowaniu białek po prostu poprzez nadmierną ekspresję w przestrzeni peryplazmatycznej, która opiera się na przypadkowej enkapsulacji, ale skuteczne pakowanie jest wysoce zależne od białka, przy czym niektóre białka pakują się z wysoką wydajnością w porównaniu z innymi, które w ogóle nie pakująsię 8-10. Wykorzystując powszechne techniki biologii syntetycznej, staraliśmy się zmodyfikować Escherichia coli (E. coli) w taki sposób, aby jednocześnie produkowała, pakowała i wydzielała do OMV aktywny enzym, który omija obecne ograniczenia wiedzy na temat tego, jak powstają OMV i jak bakterie wybierają ładunek do pakowania.

Na potrzeby tej aplikacji wybrano system biokoniugacji z rozszczepionymi białkami jako syntetyczne połączenie, aby ułatwić kierunkowe pakowanie do OMV. Jak sama nazwa wskazuje, system biokoniugacji podzielonych białek składa się z dwóch uzupełniających się domen podjednostek, które oddziałują ze sobą. Podzielone domeny białkowe wybrane do celów tego protokołu są określane jako domena SpyCatcher (SC) i SpyTag (ST) i pochodzą z białka wiążącego fibronektynę Streptococcus pyogenes (FbaB)11. Ten podzielony system białkowy jest niezwykły, ponieważ gdy dwie podjednostki znajdują się w pobliżu, spontanicznie tworzy się wiązanie izopeptydowe między proksymalnym kwasem asparaginowym a resztą aminokwasów lizyny, tworząc wiązanie kowalencyjne. Tworzenie wiązań izopeptydowych nie wymaga dodawania białek opiekuńczych, enzymów katalitycznych ani kofaktorów i może łatwo wystąpić w temperaturze pokojowej (RT) i w szerokim zakresie fizjologicznie istotnych warunków12.

Jako dowód słuszności koncepcji, wybrano fosfotriesterazy (PTE) (EC 3.1.8.1) z Brevundimonas diminuta do pakowania w OMV13 pochodzącej z E. coli. PTE zawiera dwujądrzaste miejsce aktywne Zn / Zn i ma zdolność rozkładania organofosforanów w reakcji hydrolizy, przekształcając arylodialkilofosforany w dialkilofosforany i alkohole arylowe14. Narażenie na fosforoorganiczne upośledza prawidłową funkcję neuroprzekaźników poprzez hamowanie hydrolizy acetylocholiny przez acetylocholinoesterazy w połączeniach nerwowo-mięśniowych, co sprawia, że związki pochodne fosforoorganiczne są niezwykle niebezpieczne15. Długotrwałe lub znaczne narażenie na fosforoorganiczne często powoduje niekontrolowane drgawki i zwykle powoduje śmierć przez uduszenie. Podczas gdy PTE wykazuje najwyższą aktywność katalityczną w stosunku do paraoksonu, bardzo silnego środka owadobójczego, jest również zdolny do hydrolizy szerokiej gamy innych pestycydów i chemicznych środków paralityczno-drgawkowych typu V/G16. Aby ułatwić pakowanie OMV, zaprojektowano plazmid bakteryjny, który koduje konstrukt genu zawierający indukowalny promotor, peryplazmatyczną sekwencję lokalizacyjną i krótkie miejsce wielokrotnego klonowania przed sekwencją genu SC. Wprowadzenie genu PTE między sekwencję lidera a sekwencję SC pozwoliło na stworzenie przełącznika genetycznego, który kieruje białko fuzyjne PTE-SC do przestrzeni peryplazmatycznej w celu upakowania OMV. Podczas gdy opisane tutaj wysiłki koncentrują się na PTE, gen enzymu jest wymienny i można go łatwo zastąpić inną sekwencją genu, aby ułatwić pakowanie alternatywnego enzymu lub białka.

Jako druga część syntetycznego połączenia, obfite białko błony zewnętrznej (OmpA) jest wybierane do prezentacji sekwencji peptydowej ST. Chociaż wybór białka kotwiczącego może się różnić, ważne jest, aby białko miało domenę permisywną, która występuje w przestrzeni peryplazmatycznej, toleruje konstrukt fuzyjny bez wywoływania cytotoksyczności, jest znane z obecności w OMV i nie agreguje się, gdy jest wytwarzane rekombinacyjnie. OmpA jest transbłonowym białkiem poryny o masie 37,2 kDa, o którym wiadomo, że ulega silnej ekspresji w zewnętrznej błonie bakteryjnej, a następnie w OMV17. Bierze udział w transporcie małych cząsteczek o wielkości <2 nm przez błonę bakteryjną18. Natywny OmpA ma dwie strukturalnie unikalne domeny, transbłonowy motyw beczki beta i peryplazmatycznie rozpuszczalną część C-końcową, o której wiadomo, że oddziałuje z peptydoglikanem19. W zaprojektowanej tutaj zmutowanej fuzji OmpA-ST C-końcowa część OmpA została usunięta, a ST została połączona z peryplazmatycznie skierowanymi końcami N lub C. Usunięcie peryplazmatycznej części OmpA zmniejsza liczbę interakcji między błoną zewnętrzną a peptydoglikanem, powodując destabilizację błony prowadzącą do hiperpęcherzyków7. Genomowy OmpA został utrzymany jako dodatek do rekombinacyjnie eksprymowanego konstruktu OmpA-ST w celu złagodzenia dużej destabilizacji błony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie plazmidów

  1. Przygotuj plazmid (np. pET22) zawierający białko kotwiczące (OmpA) połączone z domeną wiązania biortologicznego (określaną w niniejszym protokole jako kotwica ST), znacznik epitopowy (taki jak znaczniki 6xHis, myc lub FLAG do oczyszczania i identyfikacji), znacznik lokalizacji peryplazmatycznej, oporność na antybiotyki i odpowiednie pochodzenie replikacji w oparciu o wybrany szczep bakteryjny7.
    1. Ekstrahować plazmidowe DNA z nocnych hodowli przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA zgodnie z protokołem producenta.
  2. Przygotować plazmid (np. pACYC184) zawierający enzym/białko (PTE), który ma być upakowany w OMV połączony z komplementarną domeną wiązania bioortogonalnego do domeny białka kotwiczącego (określanej w niniejszym protokole jako enzym-SC), znacznika epitopu, znacznika lokalizacji peryplazmatycznej, oporności na antybiotyki innej niż plazmid białka kotwiczącego oraz odpowiedniego początku replikacji w oparciu o wybrany szczep bakteryjny7.
    1. Ekstrahować plazmidowe DNA z nocnych hodowli przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do izolacji DNA zgodnie z protokołemproducenta 7.

2. Generacja opakowania OMV Kultura E. coli

  1. Izolacja plazmidu
    1. Oczyść plazmidy kodujące konstrukt enzymu-SC i konstrukty kotwicy-ST z oddzielnych linii komórkowych za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji plazmidów zgodnie z protokołemproducenta 7. Oznaczyć stężenie i czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm.
  2. Wspólna transformacja
    1. Wybierz szczep E. coli, który jest dostępny na rynku, aby ułatwić ekspresję białka.
      UWAGA: Wykorzystano tutaj ogniwa BL21(DE3). Lizogen T7 jest wymagany do ekspresji konstruktu kotwicznego ST, który opiera się na promotorze T7 i polimerazie RNA T7 do ekspresji białka. Stosowanie innych szczepów bakteryjnych wymaga albo obecności genu lizogenu T7, albo użycia plazmidu innego niż pET227.
    2. Rozcieńczyć oczyszczony plazmidowy DNA do równoważnych stężeń molowych, a następnie przekształcić je w kompetentne komórki bakteryjne poprzez transformację szoku cieplnego lub elektroporację zgodnie z protokołem producenta dla wybranych kompetentnych komórek.
    3. Transformacja komórek na płytce na płytkach agarowych Luria-Bertani (LB) zawierających antybiotyk zarówno ampicylinę (pET22), jak i chloramfenikol (pACYC184); oba obecne w końcowych stężeniach 25 μg/ml.
    4. Umieścić naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C na noc, aby wyizolować tylko klony zawierające oba plazmidy.
      UWAGA: Kolonie, które przetrwają selekcję antybiotyków, zostaną wykorzystane we wszystkich przyszłych preparatach OMV. Antybiotyki (ampicylina i chloramfenikol) zostaną dodane do wszystkich płynnych kultur w celu utrzymania selektywnego ciśnienia i zapewnienia obecności obu plazmidów.

3. Produkcja OMV

  1. Rozbudowa kolonii
    1. Zaszczepić 5 ml pożywki hodowlanej (zazwyczaj Terrific Bulov (TB) lub LB) zawierającej antybiotyki w wyżej wymienionych stężeniach (krok 2.2.3) pojedynczą kolonią z płytek selekcyjnych opisanych w ppkt 2.2.4.
    2. Przeprowadzić rozcieńczenie 1:100-krotne nocnej kultury starterowej do kolb hodowlanych z przegrodami.
      UWAGA: Użyj objętości podłoża między 250-500 ml.
    3. Utrzymywać kulturę w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min, aby zapewnić osiągnięcie wystarczającego napowietrzenia kultury.
  2. Indukcja każdego plazmidu
    1. Pozwolić, aby kultura bakteryjna urosła do OD600 0,6-0,8, około 3 godziny wzrostu po zaszczepieniu pierwotnej kolby wzrostowej.
    2. Aby poprawić końcową wydajność pęcherzyków obciążonych PTE-SC, należy odwirować całą kulturę przy 7 000 x g przez 15 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy we wstępnie podgrzanej, świeżej pożywce hodowlanej.
      UWAGA: Ten opcjonalny krok pomaga usunąć wszelkie puste OMV, które są obecne w pożywce hodowlanej przed indukcją PTE-SC.
    3. Przygotować 20% roztwór podstawowy L-arabinozy w wodzie i sterylnym filtrze, używając filtra 0,22 μm. Roztwór L-arabinozy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-4 tygodnie.
    4. Dodać roztwór L-arabinozy do kolby hodowlanej do końcowego stężenia 0,2%, aby rozpocząć produkcję PTE-SC.
      UWAGA: Pomaga to wstępnie obciążyć przestrzeń peryplazmatyczną PTE-SC przed promowaniem zwiększonej pęcherzyków poprzez indukcję zmutowanego OmpA-ST.
    5. Przygotować 1 M roztwór izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w wodzie i sterylnym filtrze, używając filtra 0,22 μm.
      UWAGA: IPTG należy zużyć natychmiast po nawodnieniu. Podwielokrotności IPTG mogą być przechowywane w stanie zamrożonym przez 3-6 miesięcy i mogą być rozmrożone bezpośrednio przed użyciem.
    6. Dodać IPTG po dodatkowym 3-godzinnym okresie inkubacji do końcowego stężenia 0,5 mM, aby rozpocząć produkcję OmpA-ST.
    7. Pozwól kulturze rosnąć przez dodatkowe 8-14 godzin w temperaturze 37 °C, wstrząsając.

4. Oczyszczanie OMV

  1. Usuwanie nienaruszonych bakterii
    1. Odwirować pożywkę do hodowli bakterii przez 15 minut w temperaturze 7 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia nienaruszonych bakterii.
    2. Zdekantuj i zapisz media z górnej części osadu komórkowego po odwirowaniu, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
    3. Powtórzyć kroki 4.1.1 i 4.1.2 dla jednego dodatkowego cyklu wirowania, aby upewnić się, że wszystkie nienaruszone bakterie zostały usunięte z pożywki hodowlanej, mając pewność, że pożywka została zdekantowana i zapisana.
  2. Usuwanie agregatów białkowych
    1. Dalsze oczyszczanie pożywki bakteryjnej za pomocą filtra membranowego 0,45 μm w celu usunięcia pozostałości bakterii i niepożądanego dużego materiału komórkowego.
      UWAGA: W celu uzyskania wyższego odzysku i niższej adsorpcji białek należy użyć biologicznie kompatybilnego materiału membranowego, takiego jak octan celulozy (CA) lub polifluorek winylidenu (PVDF). Pojemność filtra strzykawkowego mniejsza niż 100 ml i pojemność filtra próżniowego większa niż 100 ml.
      1. Aby przefiltrować strzykawkę, pobrać pożywkę hodowlaną do sterylnej strzykawki o pojemności 10-50 ml. Podłączyć filtr 0,45 μm do końcówki Luer strzykawki. Wciśnij tłok i zbierz przepływ w nowym naczyniu.
      2. Aby przefiltrować próżniowo, przenieś pożywkę hodowlaną do sterylnego aparatu filtracyjnego. Podłącz urządzenie do pompy próżniowej lub aspiratora zlewu, aby wytworzyć ssanie. Przefiltrowane podłoże przenieść do nowego naczynia.
  3. Izolacja OMV za pomocą ultrawirowania
    1. Dodaj przefiltrowaną pożywkę hodowlaną do probówek wirówkowych, uważając, aby zrównoważyć przeciwległe probówki w wirówce.
    2. Granulat o stężeniu ~150 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C w ultrawirówce przy użyciu odpowiedniego wirnika pasującego zarówno do używanego instrumentu, jak i probówek.
    3. Zdekantować pożywkę hodowlaną zubożoną w OMV z osadu OMV, uważając, aby nie naruszyć osadu OMV, natychmiast po zakończeniu wirowania, ponieważ pozostawienie osadu OMV w pożywce zmiękczy osad, zmniejszając odzysk OMV.
      UWAGA: Ta pastylka będzie lekko brązowa i w zależności od początkowej ilości kultury bakteryjnej może, ale nie musi, być widoczna gołym okiem. Zasysanie pożywki bezpośrednio z górnej części probówki wirówkowej jest również opcją, mając na uwadze, że im więcej pożywki usunięto z granulatu OMV, tym czystsza będzie końcowa próbka OMV.
    4. Zachowaj odwirowany supernatant do późniejszych testów dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w celu sprawdzenia, czy cząstki OMV zostały całkowicie zubożone z pożywki.
    5. Dodać 0,5-1 ml sterylnego, przefiltrowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4 lub 100 mM buforu kwasu N-cykloheksylo-2-aminoetanosulfonowego (CHES) o pH 8,0 do osadu OMV, pozwalając mu inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że osad nie wyschnie.
      UWAGA: Ekstremalne siły jonowej roztworu, pH i temperatury mogą powodować zmniejszoną rozpuszczalność OMV i sprzyjać agregacji.
    6. Ostrożnie odpipetować oczyszczony roztwór OMV z probówki wirówkowej, delikatnie mieszając, aby upewnić się, że cała osadka została rozpuszczona.

5. Charakterystyka OMV

  1. Użyj dowolnego dostępnego na rynku oprogramowania DLS lub śledzenia nanocząstek, postępując zgodnie z dostarczonymi protokołami producenta, unikalnymi dla każdego urządzenia, aby określić rozkład wielkości OMV i stężenie cząstek.
    UWAGA: W tym przypadku rozkład wielkości i stężenie OMV określono za pomocą oprogramowania NanoSight LM10 Nanoparticle Tracking i NTA 2.3 Analysis.
    1. Otwórz oprogramowanie.
    2. Włącz mikroskop i wyczyść wszystkie powierzchnie mikroskopu i jednostki śledzącej nanocząstki.
    3. Dodaj ~0,5 ml próbki OMV bezpośrednio do viewokienko urządzenia śledzącego cząstki przez złączkę Luer ze sterylną strzykawką o pojemności 1 ml, upewniając się, że zakrywasz całe okienko podglądu bez wstrzykiwania jakichkolwiek pęcherzyków powietrza do systemu.
    4. Umieść jednostkę śledzącą nanocząstki na stoliku mikroskopu i włącz laser.
    5. Kliknij "Przechwyć" w oprogramowaniu.
    6. Dostosuj ostrość mikroskopu i stolik, aby zwizualizować cząstki na ekranie podglądu znajdującym się w oknie oprogramowania.
    7. Dostosuj "Migawkę aparatu" i "Wzmocnienie kamery", aż jasne cząsteczki będą wyraźnie widoczne na ciemnym tle.
    8. Dostosuj czas przechwytywania do 60 sekund.
    9. Kliknij "Nagraj".
    10. Po wyświetleniu monitu wprowadź temperaturę próbki/urządzenia, oznacz próbkę i zapisz dane wideo po zakończeniu każdego uruchomienia w folderze wyznaczonym przez użytkownika.
    11. Pozostaw wszystkie parametry analizy (próg wykrywania, rozmycie, minimalna długość ścieżki, minimalna oczekiwana wielkość cząstek) w trybie automatycznego wykrywania i kliknij "Sekwencja procesu"
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją, aby dowiedzieć się, w jaki sposób można niezależnie dostosować każdy parametr w celu precyzyjnego dostrojenia wyników analizy.
    12. Zapisz rozkład wielkości cząstek i stężenie cząstek/ml zgodnie z ustaleniami oprogramowania.
      UWAGA: Typowy zakres rozmiarów hydrodynamicznych OMV wynosi od 30 do 200 nm przy stężeniu cząstek/ml ~10 x 108.
  2. Oznaczanie zawartości białka OMV
    1. Użyj standardowych protokołów SDS-PAGE i Western blot, aby ocenić czystość OMV, produkcję enzymów i skuteczność sieciowania SC-ST7.
      UWAGA: Skuteczność sieciowania nie będzie wynosić 100%7.

6. Weryfikacja opakowania enzymatycznego

  1. Test aktywności PTE
    1. Wszystkie testy enzymatyczne należy wykonać w odpowiednim buforze, takim jak 100 mM bufor CHES (pH 8) w temperaturze 25 °C w kuwecie lub multipleksie na płytce 96/384 dołkowej.
    2. Dodać 5 μl rozcieńczenia paraoksonu w buforze CHES w stosunku 1:1 000 do 90 μl CHES i 5 μl oczyszczonego OMV (~36-krotnie stężonego w porównaniu ze stężeniem OMV obecnym w pożywce hodowlanej).
      Uwaga: Paraoxon jest toksycznym pestycydem i należy się z nim obchodzić zgodnie z wytycznymi producenta i instytucji.
    3. Wykonuj odczyty absorbancji w regularnych odstępach czasu (co 20 sekund przez ~ 2 godziny całkowitego czasu reakcji) przy 405 nm (ε = 18,1 mM-1 cm-1) i przy 348 nm (punkt izobestowy ε = 5,4 mM-1 cm-1) w celu monitorowania postępu reakcji chromogennego produktu rozpadu paraoksonu, p-nitrofenolu.
      UWAGA: Przy wartościach pH powyżej 8 obecna jest dominująca zdeprotonowana forma p-nitrofenolu, co pozwala na dokładne monitorowanie przy 405 nm. We wszystkich innych złożonych roztworach o niższym pH konieczne jest wykorzystanie punktu izobestowego 348 nm, ponieważ będzie obecnych wiele form p-nitrofenolu.
    4. Obliczyć początkowe prędkości reakcji, określając nachylenie części liniowej krzywych postępu z kroku 6.1.3, aby porównać względną ilość PTE w każdej próbce, wydajność pakowania i całkowitą produkcję PTE.
    5. Wykonaj standardowe protokoły testów enzymatycznych w celu określenia KM, V, max i kcat dla PTE.
      w kapsułkach OMV UWAGA: Analiza Lineweavera-Burka może być wykorzystana do wyznaczenia tych parametrów kinetycznych, gdzie punkt przecięcia z osią y =maksimum 1/V i nachylenie = KM/Vmax20.
  2. Dyfuzja substratu transbłonowego/produktu.
    1. Przeprowadzić tę samą analizę kinetyczną, jak opisano w kroku 6.1, wykorzystując rosnące stężenia Triton X-100 w buforze CHES od 0-3% objętości.
      UWAGA: Dodanie Triton X-100 do rozpuszczonego OMV działa w celu rozerwania dwuwarstwy lipidowej, umożliwiając swobodny dostęp zawartości OMV do roztworu reakcyjnego.
    2. Obliczyć i porównać prędkości początkowe na każdym poziomie Triton X-100 w celu sprawdzenia przejścia przezbłonowego substratu/produktu, na które wskazuje minimalna zmiana aktywności enzymu (prędkości początkowe) w porównaniu z aktywnością enzymu pod nieobecność Triton X-100. Jeśli w obecności Triton X-100 obserwuje się znaczny wzrost aktywności enzymu, jest prawdopodobne, że substrat nie dyfunduje swobodnie do OMV.
    3. Oznaczenie aktywności enzymatycznej wolnej od enzymu (jak opisano powyżej w sekcji 6.1) w obecności Triton X-100 w celu sprawdzenia, czy aktywność enzymu nie jest hamowana przez sam środek powierzchniowo czynny.
      UWAGA: Jeśli Triton X-100 ma duży wpływ na aktywność, alternatywne dodatki, takie jak saponiny lub różne polisorbaty/środki powierzchniowo czynne mogą być bardziej odpowiednie do rozerwania membrany OMV.

7. Pamięć OMV

  1. mrożenie
    1. Umieść ~100 μl podwielokrotności oczyszczonego OMV bezpośrednio w ciekłym azocie, aby zatrzasnąć podwielokrotności, uważając, aby nie zanurzyć całkowicie fiolek ani nie zetknąć się z ciekłym azotem z samą próbką.
      UWAGA: Oczyszczony OMV można zamrozić bezpośrednio w buforze, który został wybrany do rozpuszczania osadu OMV podczas procesu oczyszczania, bez konieczności stosowania dodatkowych krioprotektorantów7.
    2. Przechowywać zamrożone porcje w temperaturze -80 °C.
    3. Rozmrozić zamrożone podwielokrotności z kroku 7.1.1, umieszczając je w temperaturze pokojowej wody, upewniając się, że próbki nie są podgrzewane.
    4. Przed przygotowaniem wszystkich próbek do przechowywania w ten sposób należy przeprowadzić test enzymatyczny opisany w kroku 6.1, porównując prędkości początkowe przed i po zamrożeniu, aby sprawdzić, czy nie ma znaczącej utraty aktywności enzymu po zamrożeniu i rozmrożeniu.
      UWAGA: Oczyszczony OMV należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli obserwuje się zmniejszenie aktywności enzymu w wyniku zamrażania.
  2. Liofilizacja
    1. Liofilizuj zatrzaskowo zamrożone, oczyszczone podwielokrotności OMV przy użyciu dostępnego na rynku sprzętu do liofilizacji21.
    2. Liofilizowane podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez wiele tygodni lub w temperaturze -80 °C.
    3. Do liofilizowanego OMV dodać taką samą objętość oczyszczonej wody, jak przed liofilizacją i odstawić w temperaturze pokojowej na 30 minut w celu ponownego uwodnienia próbki. W razie potrzeby delikatnie wymieszać, uważając, aby nie wywołać wiru ani sonikacji OMV.
    4. Dodaj liofilizowany proszek OMV bezpośrednio do punktu opieki nad pacjentem do zastosowań, w których wcześniejsze rozcieńczanie/rozpuszczanie nie jest konieczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jednoczesna ekspresja dwóch białek rekombinowanych, wymagana dla strategii pakowania OMV opisanej w niniejszym protokole, może zostać osiągnięta na kilka różnych sposobów. W tym przypadku zastosowano system dwuwektorowy z kompatybilnymi miejscami początku replikacji oraz oddzielnymi indukowalnymi kasetami genowymi. Dla ekspresji konstruktu PTE-SC zmodyfikowano komercyjny szkielet plazmidowy (pACY184) tak, aby zawierał indukowalną arabinozą kasetę genową oraz sekwencję sygnałową lokalizacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten ma na celu zademonstrowanie reprezentatywnej techniki ukierunkowanego pakowania, w której enzym będący przedmiotem zainteresowania jest wytwarzany i pakowany w OMV przez E. coli. Podobnie jak w przypadku wielu złożonych technik, istnieje wiele obszarów, w których protokół może być modyfikowany w celu dostosowania do użycia w różnych unikalnych aplikacjach, z których niektóre zostały szczegółowo opisane poniżej. Chociaż mechanizm pakowania OMV i enkapsulacji enzymów można dostosować do konkretnych po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Badań Marynarki Wojennej poprzez fundusze podstawowe przekazane Laboratorium Badawczemu Marynarki Wojennej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IPTGDowolnyZawsze przygotuj świeże lub porcje i zamroź.
L-arabinozaDowolnaMoże być przygotowana z wyprzedzeniem i przechowywana w temperaturze 4 & st. C.
AmpicylinaDowolnydodatek bezpośrednio przed użyciem po wystarczającym ochłodzeniu podłoża po autoklawowaniu.   
Chloramfenikol Dowolnydodatek bezpośrednio przed użyciem po wystarczającym ochłodzeniu pożywki po autoklawowaniu.   
Pożywki hodowlane TB/LBWszelkieinne podłoża wzrostowe prawdopodobnie będą działać podobnie.
Triton X-100Każdyz wielu potencjalnie odpowiednich środków powierzchniowo czynnych.   
Przegrody w kolbach hodowlanychDowolnePrzegrody sprzyjają wyższemu poziomowi napowietrzania.   
CHESFisher BioreagentsBP318-100Optymalny bufor stosowany do degredacji paraoksonów (pH > 8).
ParaoxonChem ServiceN-12816Bardzo toksyczna substancja, z którą należy obchodzić się ostrożnie i odpowiednio zutylizować.  
Filtr strzykawkowy 0,45 i mikro; m Thermo Scientific60183-221 (30 mm)Średnica filtra zależy od objętości próbki. Błona o niskim poziomie wiązania z białkami ma kluczowe znaczenie.
Inkubator z wytrząsarkąNew BrunswickExcella E24Precyzyjna temperatura i mieszanie są niezbędne do powtarzalnego wzrostu bakterii. 
Wirówka do hodowli SorvallThermo ScientificRC 5B PLUSWirówka hodowlana o dużej pojemności (500 ml) o pojemności 7 000 g.
Ultrawirówka Sorvall Thermo ScientificWX Ultra 90Zdolne do działania sił odśrodkowych ≥ 150 000 x g.
Wirnik ultrawirówkiThermo ScientificAH-629Upewnij się, że używany jest właściwy wirnik i rurki oraz że wszystko jest odpowiednio wyważone.
Ultraprzezroczyste ultrarurki wirówkowe (25 x 89 mm)Beckman Coulter344058Przed użyciem upewnij się, że nie ma pęknięć naprężeniowych i że probówki są odpowiednio wyważone.
Spektrofotometr TecanInfinite M1000Niezbędny do testów kinetycznych enzymów.
DLS/śledzenie cząstekNanoSight LM10Niezbędny do rozkładu wielkości OMV i oznaczania stężenia.   
BL21(DE3)NEBOdpowiedni szczep ekspresji bakteryjnej.
pET22EMD Millipore69744-3Zamiast nich można użyć innych plazmidów.   
pACYC184NEBZamiast nich można zastosować inne plazmidy.   
Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704Przykładowy zestaw.

Bibliografia

  1. Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
  3. Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
  4. Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
  5. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
  6. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
  7. Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
  8. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
  9. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
  10. Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
  11. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
  12. Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
  13. Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
  14. Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
  15. Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
  16. Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
  17. Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
  18. Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
  19. Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
  20. Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
  21. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
  22. Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
  23. Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
  24. Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
  25. Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
  26. De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
  27. Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
  28. Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
  29. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866(2016).
  30. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie OMVpakowanie enzymówultrawirowaniedetekcja białekśledzenie cząsteczekpomiar aktywności enzymatycznejhodowla bakteryjnabiologia syntetycznacharakterystyka pęcherzyków
Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.