Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Summary

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Abstract

Rosnące zainteresowanie zastosowaniem technik biologii syntetycznej do programowania pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV) prowadzi do bardzo interesujących i unikalnych zastosowań dla OMV, gdzie tradycyjne nanocząstki okazują się zbyt trudne do syntezy. Do tej pory wykazano, że wszystkie bakterie Gram-ujemne wytwarzają OMV, co świadczy o pakowaniu różnych ładunków, które obejmują małe cząsteczki, peptydy, białka i materiał genetyczny. Ze względu na ich zróżnicowany ładunek, OMV są zaangażowane w wiele procesów biologicznych, od komunikacji komórka-komórka po transfer genów i dostarczanie czynników wirulencji, w zależności od tego, które bakterie wytwarzają OMV. Dopiero niedawno bakteryjne OMV stały się dostępne do stosowania w szerokim zakresie zastosowań dzięki opracowaniu technik kontroli i bezpośredniego pakowania rekombinowanych białek do OMV. Protokół ten opisuje metodę produkcji, oczyszczania i stosowania OMV pakowanego w enzymy, zapewniającą poprawę ogólnej produkcji rekombinowanego enzymu, zwiększenie pęcherzyków i zwiększoną stabilność enzymu. Pomyślne wykorzystanie tego protokołu spowoduje stworzenie szczepu bakteryjnego, który jednocześnie wytwarza rekombinowane białko i kieruje je do enkapsulacji OMV poprzez stworzenie syntetycznego połączenia między rekombinowanym białkiem a białkiem kotwiczącym błonę zewnętrzną. Protokół ten zawiera również szczegółowe informacje na temat metod izolowania OMV z kultur bakteryjnych, a także właściwych technik obchodzenia się z nim oraz kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas dostosowywania tego protokołu do innych unikalnych zastosowań, takich jak: dostarczanie leków farmaceutycznych, diagnostyka medyczna i remediacja środowiska.

Introduction

Przedstawiona tutaj jest metoda projektowania, produkcji i oczyszczania pęcherzyków zewnętrznej błony bakteryjnej (OMV) naładowanych enzymami. OMV to małe, głównie jednowarstwowe proteoliposomy o wielkości od 30 do 200 nm^1,2. Wszystkie bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, które zostały do tej pory przebadane, wykazały uwalnianie OMV lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) ze swojej powierzchni^3,4. Dokładny mechanizm, za pomocą którego wytwarzane są OMV, nie został jeszcze w pełni wyjaśniony ze względu na zróżnicowane populacje bakterii, które je wydzielają, a także różne funkcje, które pełnią. Wykazano, że OMV transportuje szeroki zakres ładunk....

Protocol

1. Przygotowanie plazmidów

1. Przygotuj plazmid (np. pET22) zawierający białko kotwiczące (OmpA) połączone z domeną wiązania biortologicznego (określaną w niniejszym protokole jako kotwica ST), znacznik epitopowy (taki jak znaczniki 6xHis, myc lub FLAG do oczyszczania i identyfikacji), znacznik lokalizacji peryplazmatycznej, oporność na antybiotyki i odpowiednie pochodzenie replikacji w oparciu o wybrany szczep bakteryjny⁷.
   1. Ekstrahować plazmidowe DNA z nocnych hodowli przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA zgodnie z protokołem producenta.
2. Przygotować plazmid (np. pACYC184) zawie....

Results

Jednoczesna ekspresja dwóch rekombinowanych białek, wymagana dla strategii pakowania OMV opisanej w tym protokole, może być osiągnięta na wiele różnych sposobów. W tym przypadku wykorzystano system dwóch wektorów o kompatybilnych początkach replikacji i oddzielnych kasetach z genami indukowalnymi. W celu ekspresji konstruktu PTE-SC zaprojektowano komercyjny szkielet plazmidowy (pACY184) w taki sposób, aby zawierał kasetę genu indukowanego arabinozą i sekwencję lidera lokalizacji peryplazm.......

Discussion

Protokół ten ma na celu zademonstrowanie reprezentatywnej techniki ukierunkowanego pakowania, w której enzym będący przedmiotem zainteresowania jest wytwarzany i pakowany w OMV przez E. coli. Podobnie jak w przypadku wielu złożonych technik, istnieje wiele obszarów, w których protokół może być modyfikowany w celu dostosowania do użycia w różnych unikalnych aplikacjach, z których niektóre zostały szczegółowo opisane poniżej. Chociaż mechanizm pakowania OMV i enkapsulacji enzymów można dostosować do konkretnych po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG	Dowolny		Zawsze przygotuj świeże lub porcje i zamroź.
L-arabinoza	Dowolna		Może być przygotowana z wyprzedzeniem i przechowywana w temperaturze 4 & st. C.
Ampicylina	Dowolny		dodatek bezpośrednio przed użyciem po wystarczającym ochłodzeniu podłoża po autoklawowaniu.
Chloramfenikol	Dowolny		dodatek bezpośrednio przed użyciem po wystarczającym ochłodzeniu pożywki po autoklawowaniu.
Pożywki hodowlane TB/LB	Wszelkie		inne podłoża wzrostowe prawdopodobnie będą działać podobnie.
Triton X-100	Każdy		z wielu potencjalnie odpowiednich środków powierzchniowo czynnych.
Przegrody w kolbach hodowlanych	Dowolne		Przegrody sprzyjają wyższemu poziomowi napowietrzania.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optymalny bufor stosowany do degredacji paraoksonów (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Bardzo toksyczna substancja, z którą należy obchodzić się ostrożnie i odpowiednio zutylizować.
Filtr strzykawkowy 0,45 i mikro;	m Thermo Scientific	60183-221 (30 mm)	Średnica filtra zależy od objętości próbki. Błona o niskim poziomie wiązania z białkami ma kluczowe znaczenie.
Inkubator z wytrząsarką	New Brunswick	Excella E24	Precyzyjna temperatura i mieszanie są niezbędne do powtarzalnego wzrostu bakterii.
Wirówka do hodowli Sorvall	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Wirówka hodowlana o dużej pojemności (500 ml) o pojemności 7 000 g.
Ultrawirówka Sorvall	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Zdolne do działania sił odśrodkowych ≥ 150 000 x g.
Wirnik ultrawirówki	Thermo Scientific	AH-629	Upewnij się, że używany jest właściwy wirnik i rurki oraz że wszystko jest odpowiednio wyważone.
Ultraprzezroczyste ultrarurki wirówkowe (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Przed użyciem upewnij się, że nie ma pęknięć naprężeniowych i że probówki są odpowiednio wyważone.
Spektrofotometr	Tecan	Infinite M1000	Niezbędny do testów kinetycznych enzymów.
DLS/śledzenie cząstek	NanoSight	LM10	Niezbędny do rozkładu wielkości OMV i oznaczania stężenia.
BL21(DE3)	NEB		Odpowiedni szczep ekspresji bakteryjnej.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Zamiast nich można użyć innych plazmidów.
pACYC184	NEB		Zamiast nich można zastosować inne plazmidy.
Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen	28704	Przykładowy zestaw.