Artykuł metodologiczny

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

DOI:

10.3791/54488

⸱

28 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnorodność małych niekodujących RNA (sRNA) szybko się powiększa i wyłania się ich rola w procesach biologicznych, w tym w regulacji genów. Co najciekawsze, sRNA znajdują się również na zewnątrz komórek i są stabilnie obecne we wszystkich płynach biologicznych. W związku z tym zewnątrzkomórkowe sRNA reprezentują nową klasę biomarkerów choroby i prawdopodobnie biorą udział w sygnalizacji komórkowej i sieciach komunikacji międzykomórkowej. Aby ocenić ich potencjał jako biomarkerów, sRNA można określić ilościowo w osoczu, moczu i innych płynach. Niemniej jednak, aby w pełni zrozumieć wpływ zewnątrzkomórkowych sRNA jako sygnałów endokrynologicznych, ważne jest określenie, którzy nośniki transportują je i chronią w płynach biologicznych (np. Osoczu), które komórki i tkanki przyczyniają się do zewnątrzkomórkowych pul sRNA oraz komórki i tkanki zdolne do przyjmowania i wykorzystywania zewnątrzkomórkowego sRNA. Aby osiągnąć te cele, konieczne jest wyizolowanie wysoce czystych populacji nośników zewnątrzkomórkowych w celu profilowania i kwantyfikacji sRNA. Wcześniej wykazaliśmy, że lipoproteiny, szczególnie lipoproteiny o dużej gęstości (HDL), transportują funkcjonalne mikroRNA (miRNA) między komórkami, a HDL-miRNA są znacząco zmienione w chorobie. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nowy protokół, który wykorzystuje tandemową izolację HDL z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości (DGUC) i szybką chromatografią białkowo-cieczową (FPLC) w celu uzyskania wysoce czystego HDL do dalszego profilowania i kwantyfikacji wszystkich sRNA, w tym miRNA, przy użyciu zarówno sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, jak i podejść PCR w czasie rzeczywistym. Protokół ten będzie cennym źródłem do badania sRNA na HDL.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zewnątrzkomórkowe, niekodujące małe RNA (sRNA) reprezentują nową klasę biomarkerów choroby i potencjalnych celów terapeutycznych i prawdopodobnie ułatwiają komunikację między komórkami1. Najszerzej badanym typem sRNA są mikroRNA (miRNA), które mają około 22 nt długości i są przetwarzane z dłuższych form prekursorowych i pierwotnych transkryptów2. Wykazano, że miRNA regulują ekspresję genów po transkrypcji poprzez supresję translacji białek i indukcję degradacji mRNA2. Niemniej jednak miRNA to tylko jeden z wielu rodzajów sRNA; ponieważ sRNA mogą być rozszczepiane od macierzystych tRNA (sRNA pochodzących z tRNA, tDR), małych jądrowych RNA (sRNA pochodzących z sRNA, sndRNA), małych jąderkowych RNA (sRNA pochodzących z snoRNA, snRNA), rybosomalnych RNA (sRNA pochodzących z rRNA, rDR), Y RNA (yDR) i innych różnych RNA1. Doniesiono, że kilka przykładów tych nowych sRNA działa podobnie do miRNA; jednak funkcje biologiczne wielu z tych sRNA pozostają do ustalenia, chociaż role w regulacji genów są prawdopodobnie3-6. Co najciekawsze, miRNA i inne sRNA są stabilnie obecne w płynach zewnątrzkomórkowych, w tym w ślinie, osoczu, moczu i żółci. Zewnątrzkomórkowe sRNA są prawdopodobnie chronione przed RNazami poprzez ich powiązanie z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV), lipoproteinami i / lub zewnątrzkomórkowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi.

Poprzednio informowaliśmy, że lipoproteiny, czyli lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL), transportują miRNA w osoczu7. W tym badaniu HDL wyizolowano przy użyciu sekwencyjnej metody ultrawirowania w gradiencie gęstości (DGUC), szybkiej chromatografii cieczowej białek (filtracja żelowa chromatografia z wykluczeniem wielkości, FPLC) i chromatografii powinowactwa (immunoprecypitacja anty-apolipoproteiny A-I (apoA-I)7. Korzystając zarówno z macierzy o niskiej gęstości opartych na PCR w czasie rzeczywistym, jak i indywidualnych testów miRNA, określono ilościowo poziomy miRNA na HDL wyizolowanym od osób zdrowych i z hipercholesterolemią7. Korzystając z tego podejścia, byliśmy w stanie profilować miRNA i określić ilościowo określone miRNA w wysoce czystych preparatach HDL. Od 2011 roku ustaliliśmy, że chociaż chromatografia powinowactwa zwiększa czystość HDL, nasycenie przeciwciałami znacznie ogranicza wydajność i może być zbyt kosztowne. Obecnie nasz protokół zaleca dwuetapową sekwencyjną metodę tandemową DGUC, po której następuje FPLC, która wytwarza również wysokiej jakości próbki HDL do dalszej izolacji RNA i kwantyfikacji sRNA. Ze względu na ostatnie postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu sRNA (sRNAseq), np. miRNA, oraz zwiększoną świadomość innych klas sRNA innych niż miRNA, sRNAseq jest aktualnym stanem wiedzy w profilowaniu miRNA i sRNA. W związku z tym nasz protokół zaleca ilościowe oznaczanie miRNA i innych sRNA na próbkach HDL przy użyciu sRNAseq. Niemniej jednak całkowite RNA wyizolowane z HDL można również wykorzystać do ilościowego oznaczania pojedynczych miRNA i innych sRNA lub walidacji wyników sRNAseq przy użyciu metod PCR w czasie rzeczywistym. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół zbierania, oczyszczania, kwantyfikacji, analizy danych i walidacji HDL-sRNA o wysokiej czystości.

Ogólnym celem tego artykułu jest pokazanie wykonalności i procesu kwantyfikacji sRNA w wysoce czystym HDL wyizolowanym z ludzkiego osocza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanie HDL (~ 5,5 dnia)

  1. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (DGUC, ~ 5 dni)
    1. Dodaj 90 μl 100x przeciwutleniaczy do 9 ml osocza wyizolowanego ze świeżej krwi żylnej.
    2. Dostosuj gęstość osocza za pomocą KBr z 1,006 g/ml do 1,025 g/ml, dodając 0,251 g KBr do 9 ml osocza z kroku 1.1.1 (0,0278 g/ml KBr osocza). Ubijaj plazmę, aż cała sól rozpuści się w temperaturze pokojowej i przenieś do probówek ultrawirówek i upewnij się, że wszystkie pęcherzyki unoszą się do góry.
    3. Zegnij końcówkę igły 18-G pod kątem 90° 1 cm od końcówki, skośną stroną do góry. Za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze 18 ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #1 na osocza (Tabela 1).
      UWAGA: Wygięta igła zapewnia, że wszystkie VLDL/IDL, LDL i HDL zostaną usunięte bez mieszania z nakładką.
    4. Usuń większość pęcherzyków u góry, pozostawiając 2 - 3 mm odstępu od łąkotki do górnej części rurki i ostrożnie umieść rurki w wiaderkach SW-40Ti.
    5. Zważ każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważ z przeciwległym wiadrem (wiadro + nakrętka): #1 do #4, #2 do #5 i #3 do #6.
      UWAGA: Te wiadra muszą być zawsze wyważone i dopasowane.
    6. Umieść wirnik w ultrawirówce (lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z hamulcem pośrednim #4.
    7. Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.
    8. Ostrożnie usunąć 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Będzie to frakcja VLDL/IDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C.
    9. Po usunięciu frakcji VLDL/IDL należy zebrać pozostałe 7 ml próbki (osocza) i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość próbki do 9 ml za pomocą roztworu nakładającego #2 (Tabela 1).
    10. Dostosuj gęstość próbki z 1,025 g/ml do 1,080 g/ml za pomocą KBr, używając około 0,746 g KBr w próbce 9 ml lub 0,0828 g/ml KBr próbki. Delikatnie kołysz próbką, aż cała KBr się rozpuści (około 20 min) i przenieś do probówki ultrawirówkowej, upewniając się, że pęcherzyki unoszą się do góry.
    11. Za pomocą strzykawki i igły ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #3 na próbkę (Tabela 1). Pozostaw 2-3 mm odstępu od łąkotki do górnej części rurki.
    12. Usuń większość pozostałych pęcherzyków z górnej części probówki i ostrożnie umieść napełnione probówki ultrawirówki w wiadrach SW-40Ti.
    13. Zważyć każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważyć przeciwległym wiadrem + nakrętką, jak w ppkt 1.1.5.
    14. Umieść wirnik w ultrawirówce (patrz lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z hamulcem pośrednim #4.
    15. Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.
    16. Ostrożnie usunąć 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Będzie to frakcja LDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C.
    17. Po usunięciu frakcji LDL należy zebrać pozostałe około 7 ml próbki (osocza) i umieścić ją w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość próbki (osocza) do 9 ml za pomocą 1,080 g/ml roztworu #4 (Tabela 1).
    18. Dostosuj gęstość próbki z 1,080 g/ml do 1,30 g/ml za pomocą KBr, używając 3,33 g KBr w próbce 9 ml (osocze) lub 0,37 g KBr na każdy ml próbki. Rozdrabniaj lub lekko mieszaj próbkę, aż cała KBr (sól) zostanie rozpuszczona i przenieś do probówki ultrawirówkowej.
    19. Za pomocą strzykawki i igły ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #5 na próbkę (Tabela 1).
    20. Usuń większość pozostałych pęcherzyków w górnej części probówki, pozostawiając 2-3 mm odstępu od menisku do górnej części probówki i ostrożnie umieść napełnione probówki ultrawirówki w wiadrach SW-40Ti.
    21. Zważyć każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważyć przeciwległym wiadrem + nakrętką, jak w ppkt 1.1.5.
    22. Umieść wirnik w ultrawirówce (patrz lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 48 godzin w temperaturze 4 °C z hamulcem #4.
    23. Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.
    24. Ostrożnie usunąć około 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Jest to frakcja HDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C.
      UWAGA: Zgodnie z DGUC HDL można dializować w celu usunięcia roztworów o wysokiej zawartości soli.
    25. Aby przeprowadzić dializę, należy umieścić pobraną frakcję HDL w szczelnie zamkniętym rękawie dializacyjnym (odcięcie 10 000 m) i dializować przez noc w 1 l 1x PBS. Zmień bufor dializacyjny (1x PBS) 3 razy w ciągu 24 godzin. Delikatne zakłócenie PBS za pomocą mieszadła magnetycznego poprawi dializę.
    26. Oznaczyć stężenie białka w DGUC-HDL przy użyciu metody BCA8.
  2. Szybka chromatografia cieczowa białkowa (FPLC) lub chromatografia wykluczania wielkości (~ 6 h)
    1. Przefiltrować 1,2 mg DGUC-HDL (białko całkowite) w 500 μl przez mikrofiltr odśrodkowy 0,22 μm (patrz Wykaz materiałów), bezpośrednio przed wstrzyknięciem.
      UWAGA: W przypadku niektórych próbek może być wymagane dodatkowe filtrowanie próbki DGUC-HDL przez mikrofiltr odśrodkowy 0,45 μm przed filtrem 0,22 μm.
    2. Pobrać przefiltrowaną próbkę DGUC-HDL, załadować strzykawkę do wstrzykiwań FPLC (napełnić) i upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza przed wstrzyknięciem do FPLC.
    3. Ustaw natężenie przepływu FPLC na 0.3 ml/min z limitem ciśnienia 2.6 MPa. Zrównoważyć kolumny z objętością 0,2 kolumny (około 15 ml) buforu przed wstrzyknięciem próbki. Wstrzyknąć próbkę z 3 ml buforu do przyrządu FPLC (pętla iniekcyjna) i rozpocząć przebieg. Zbierz 1,5 ml frakcji, co daje w sumie 72 frakcje.

2. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie małego RNA (sRNAseq, ~ 9 dni)

  1. Izolacja RNA (~ 1 dzień)
    1. Zidentyfikuj frakcje FPLC odpowiadające DGUC-HDL, określając poziom cholesterolu całkowitego za pomocą zestawu kolorymetrycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając z tej konfiguracji FPLC, spodziewaj się, że znajdziesz 6 - 7 frakcji FPLC zawierających DGUC-HDL.
    2. Zebrać całą objętość (około 8 -1 0 ml puli 1,45 ml frakcji o objętości 1,45 ml) z frakcji DGUC-HDL FPLC i zagęścić za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących 10 kDa m.w. przy 4 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy koncentrat HDL osiągnie około 100 μl.
    3. Zebrać koncentrat HDL i określić ilościowo całkowite stężenie białka HDL przy użyciu metody BCA8.
    4. Oznaczyć najwyższe stężenie białka całkowitego HDL, do 1 mg, które można podać z każdej próbki w zestawie. Na przykład wyizoluj RNA z tej samej ilości białka całkowitego HDL dla każdej próbki.
    5. Wykonaj izolację RNA przy użyciu zmodyfikowanego protokołu (patrz Lista materiałów).
      1. Dodać 10x objętość odczynnika do lizy fenoli (patrz wykaz materiałów) i wirować przez 1 min.
      2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      3. Dodać chloroform (20% objętości odczynnika do lizy fenolu użytego w kroku 2.1.5.1) i energicznie wstrząsać przez 15 s.
      4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 minuty.
      5. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem.
      6. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki, unikając interfazy.
      7. Dodaj 1,5x objętość 100% etanolu do fazy wodnej i wiruj przez 1 min.
      8. Próbki należy przechowywać przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc w temperaturze -80 °C.
      9. Kontynuuj korzystanie z protokołu izolacji RNA, korzystając z dostarczonych mini kolumn.
      10. Eluować za pomocą 30 μl H2O wolnego od RNaz. Najpierw dodać 15 μLH2Obezpośrednio do fryty, wirować z małą prędkością (2 000 x g) przez 2 min, a następnie wirować z dużą prędkością (max) przez 1 min. Powtórzyć ten krok z dodatkowymi 15 μlH2O.
    6. Natychmiast przystąp do generowania biblioteki sRNA lub przechowywania w temperaturze -80 °C.
  2. Generowanie biblioteki (~ 6 h)
    1. Przygotuj biblioteki cDNA sRNA przy użyciu protokołu zestawu do generowania biblioteki sRNA, zgodnie z instrukcjami producenta z jedną modyfikacją amplifikacji PCR, jak opisano poniżej.
      1. Przygotować mastermix do PCR na lodzie zawierającym 0,5 μl H2O bez DNaz/RNaz, 15 μl mieszanki PCR (PML) i 1 μL RNA PCR Primer (RP1) na próbkę (dodać dodatkowe 10% w przypadku błędu pipetowania).
      2. Dodać 16,5 μl mieszaniny PCR do każdej próbki (cDNA).
      3. Przypisz numer indeksu/kodu kreskowego do każdej próbki w celu multipleksowania i dodaj 1 μl wskaźnika startera PCR (do odpowiedniej liczby) do próbki.
      4. Wykonaj szybkie wirowanie za pomocą microfuge.
        UWAGA: Całkowita objętość powinna teraz wynosić 30 μl na próbkę.
      5. Wykonać warunki cykliczne dla amplifikacji PCR, jak wyszczególniono w tabelach 2 i 3.
  3. Rozmiar Wybierz bibliotekę sRNA, aby usunąć adapter:Adaptery (~ 1,5 h)
    1. Dokonaj wyboru rozmiaru biblioteki za pomocą automatycznego selektora rozmiaru DNA zgodnie z instrukcjami producenta z następującymi parametrami rozmiaru: Cel: 156 pz, Początek: 135 pz, Koniec: 177 pz, Flaga zakresu: Szeroki.
  4. Oczyszczanie DNA (~0,5 h)
    1. Oczyść cDNA sRNA o wybranej wielkości zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Elute czyste i skoncentrowane cDNA sRNA za pomocą 2 x 7 μLH2O-wolnychod DNaz/RNaz.
  5. Określ ilościowo i oceń wydajność i jakość biblioteki cDNA sRNA (~ 1 h)
    1. Oceń jakość i rozmiar biblioteki cDNA sRNA za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze (Lista materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Określ ilościowo poszczególne stężenia w bibliotece cDNA sRNA za pomocą testu DNA o wysokiej czułości (lista materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie próbki o różnych indeksach były prowadzone na tym samym torze komory przepływowej, jeśli to możliwe. Jeżeli wymagany jest więcej niż jeden tor, należy odpowiednio wymieszać próbki skrzynkowe i kontrolne.
  6. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie sRNA (~ 7 dni)
    1. Puluj indywidualne indeksowane biblioteki sRNA na podstawie stężeń równomolowych.
    2. Przesiewaj połączone biblioteki sRNA pod kątem jakości za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze i określ stężenie DNA w bibliotece, jak w 2.5.1 - 2.5.2.
    3. Wykonaj ilościowy PCR (qPCR) zawartości adaptera, aby zapewnić odpowiednią głębokość sekwencjonowania, korzystając z zestawu do kwantyfikacji qPCR z biblioteki sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta (Lista materiałów).
    4. Wykonaj sekwencjonowanie przy użyciu pojedynczego odczytu protokołu 50 bp, aby osiągnąć głębokość około 20 - 25 mln odczytów na próbkę, zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Analiza danych (~ 1 dzień)

  1. Użyj bcl2fastq2, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika, aby wstępnie przetworzyć surowe pliki fastq z demultipleksowanymi próbkami (Lista materiałów).
  2. Użyj Cutadapt, aby przyciąć adaptery9 i usunąć odczyty < długości 16 nukleotydów (nts), zgodnie z instrukcjami instrukcji obsługi (Lista materiałów).
  3. Usuń sekwencje zanieczyszczeń obecne w bibliotekach sRNA, w tym sekwencję roztworu zatrzymującego (STP: CCACGTTCCCGTGG) i przeniesienie adaptera (CTACAGTCCGACGATC) za pomocą funkcji removeSequenceInFastq w ramach NGSPERL, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów).
  4. Wykonuj wskaźniki kontroli jakości przez FastQC przy użyciu narzędzi Centrum Nauk Ilościowych (CQS), zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów).
  5. Wygeneruj nienadmiarową listę "identycznych" odczytów (zwiń nadmiarowe odczyty) i zapisz numery kopii za pomocą CQSTools, zgodnie z instrukcjami przewodnika użytkownika (Lista materiałów).
  6. Dopasuj odczyty do ludzkiego genomu za pomocą Bowtie1.1.2 pozwalającego na 1 niezgodność (opcje: -a -m 100 --best --strata -v 1), zgodnie z instrukcjami instrukcji użytkownika (Lista materiałów).
  7. Wykonuj zadania wyrównywania, zliczania i podsumowywania wyników odczytu za pomocą NGSPERL, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika.
  8. Konwertuj wyeksportowaną tabelę zliczania na plik arkusza kalkulacyjnego.
  9. Normalizuj odczyty określonej klasy (np. miRNA) do całkowitej liczby odczytów dla tej klasy (np. całkowitej liczby odczytów miRNA) i zgłaszaj sygnały jako odczyty na zmapowane miRNA (RPMM). (np. RPMM =(miR-X/Całkowita liczba odczytów # miRNA)*1 000 000).
  10. Wprowadź znormalizowaną tabelę zliczania jako ogólną technologię jednokolorową do oprogramowania do analiz różnicowych niskiego i wysokiego poziomu zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów).
    UWAGA: Obecnie nie ma dobrze scharakteryzowanych genów/sRNA dla HDL-sRNA. Można zastosować kontrolę skokową, ale może to być problematyczne. Zaleca się normalizację do całkowitego dopływu lub objętości białka HDL. Co najważniejsze, zaleca się walidację wyników sekwencjonowania za pomocą jednej z różnych strategii ilościowego oznaczania miRNA i sRNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowego PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół to seria sprawdzonych metod połączonych ze sobą, aby umożliwić kwantyfikację sRNA na HDL o wysokiej czystości za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub PCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 1). Aby zademonstrować wykonalność i wpływ tego protokołu, HDL oczyszczono z ludzkiego osocza metodą tandemową DGUC i FPLC. Pobrane frakcje FPLC odpowiadające HDL (według rozkładu cholesterolu) zagęszczono, a całkowite RNA wyizolowano z 1 mg HDL (białka całkowi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ma na celu ilościowe określanie miRNA i innych sRNA poprzez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości lub PCR w czasie rzeczywistym na HDL o wysokiej czystości. Podobnie jak w przypadku każdego podejścia, należy zwrócić szczególną uwagę na każdy etap procesu oczyszczania HDL i RNA, a następnie ilościowego określania sRNA. Protokół ten jest przeznaczony dla projektów rozpoczynających się od ≥ 2 ml osocza. Niemniej jednak, wysokiej jakości analizy RNA można z powodzeniem przeprowadzić za pomocą HDL oczyszczon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez nagrody od National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute dla K.C.V. HL128996, HL113039 i HL116263. Praca ta została również wsparta nagrodami American Heart Association dla K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 i R.M.A. POST25710170.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ultrawirówka Redlica BeckmanA99839Optima XPN-80
Ultrawirówka RotorRedlica Beckman331362SW-41Ti AKTA
Pure FPLC SystemGE Healthcare29018224
3x FPLC Superdex 200 Kolumny zwiększające LinioweGE Healthcare2899094410/300 gl
SynergyMxBioTek Instruments7191000
Blat wirówkaThermo Scientific75004525Sorvall ST40R
Wirówka z chłodzeniemEppendorf226298675417R (zakupiona przez USA Scientific)
Mikrofuge USA Scientific2631-0006
Bioanalizator PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 AgilentG2938B
Test DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Zestaw do kwantyfikacji qPCRIlluminaSY-930-1010
Termocykler ProFlexApplied Biosystems4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion RobotEppendorf9600001115070
Ultra-przezroczyste probówki wirówkoweBeckman Coulter344059
Bromek potasuFisher ChemicalsP205-500
Rurka stożkowa 15 mlThermo Scientific339650
Filtry mikroodśrodkowe 0,45 i mikro; mMilliporeUFC30HV00
Filtry mikroodśrodkowe 0,22 i mikro; mMilliporeUFC30GV00
miRNAEasy Total RNA IsolationQiagen217004
Total Cholesterol zestaw kolorymetrycznyCliniqa (Raichem)R80035
10 000 mW filtr wirujący z odcięciemAmiconUFC801024zakupiony za pośrednictwem
probówek paskowychAxygenPCR-0208-Czakupiony za pośrednictwem firmy Fisher
Zestaw microRNA RTLife Technologies4366597Na 1000 reakcji
PCR master mixLife Technologies4440041butelka 50 ml
Pierce BCA Zestaw ThermoScientific23225
Clean and Concentrator Rurki do dializyZymoD4014
SpectrumLabs132118zakupione za pośrednictwem firmy Fisher
bcl2fastq2Illuminan/aSoftware
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aSoftware
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aSoftware
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aSoftware
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netn/aOprogramowanie
GeneSpringGX13.1.1Agilentn/aOprogramowanie
Biblioteka sekwencjonowania Kit Millipore PCR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  3. Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
  4. Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
  5. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
  6. Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
  7. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  8. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8(2014).
  10. Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
  12. Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164(2015).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  14. Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
  15. Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
  16. Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
  17. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
  18. Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
  19. McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
  20. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
  21. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
  22. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145(2011).
  23. Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
  24. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360(2008).
  25. Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
  26. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  27. Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
  28. Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
  29. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ma e niekoduj ce RNAultracentryfugacja w gradiencie g sto ciszybka chromatografia cieczowa bia ekizolacja HDLprofilowanie lipoproteinfrakcjonowanie osoczapomiar cholesterolutest bia kowy BCA

Powiązane artykuły