Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

15.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54502

⸱

16 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, McMaster University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Streszczenie

Chociaż różne inteligentne materiały były badane do różnych zastosowań biomedycznych (np. dostarczanie leków, inżynieria tkankowa, bioobrazowanie, itp.), ich ostateczne zastosowanie kliniczne zostało utrudnione przez brak biologicznie istotnej degradacji obserwowanej dla większości inteligentnych materiałów. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku hydrożeli reagujących na temperaturę, które są prawie jednolicie oparte na polimerach, które są funkcjonalnie nieulegające degradacji (np. poli(N-izopropyloakrylamid) (PNIPAM) lub metakrylan poli(oligoetylenoglikolu) (POEGMA)). W związku z tym, aby skutecznie przełożyć potencjał termoczułych hydrożeli na wyzwania związane ze zdalnie sterowanym lub regulowanym metabolizmem dostarczaniem leków, rusztowań komórkowych z przestrajalnymi interakcjami komórka-materiał, materiałów teranotycznych o potencjale zarówno do obrazowania, jak i dostarczania leków oraz innych podobnych zastosowań, wymagana jest metoda uczynienia hydrożeli (jeśli nie w pełni degradowalnymi) przynajmniej zdolnymi do klirensu nerkowego po wymaganym okresie eksploatacji materiału. W tym celu protokół ten opisuje przygotowanie hydrolitycznie degradowalnych hydrożeli usieciowanych hydrazonem w wielu skalach długości w oparciu o reakcję między hydrazydem a funkcjonalizowanymi aldehydem oligomerami PNIPAM lub POEGMA o masie cząsteczkowej poniżej granicy filtracji nerkowej. W szczególności opisano metody wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli luzem (przy użyciu techniki strzykawki dwulufowej), cząstek hydrożelu (zarówno w skali mikro dzięki zastosowaniu platformy mikroprzepływowej ułatwiającej jednoczesne mieszanie i emulgowanie polimerów prekursorowych, jak i w nanoskali dzięki zastosowaniu metody samoorganizacji i sieciowania napędzanego termicznie) oraz nanowłókien hydrożelowych (przy użyciu strategii reaktywnego elektroprzędzenia). W każdym przypadku można uzyskać hydrożele o właściwościach reagujących na temperaturę, podobnych do tych osiąganych w konwencjonalnych procesach sieciowania wolnych rodników, ale sieć usieciowana hydrazonem może z czasem ulec degradacji w celu ponownego uformowania oligomerycznych polimerów prekursorowych i umożliwienia klirensu. W związku z tym przewidujemy, że te metody (które mogą być ogólnie stosowane do dowolnego syntetycznego polimeru rozpuszczalnego w wodzie, a nie tylko do materiałów inteligentnych) umożliwią łatwiejsze zastosowanie syntetycznych materiałów inteligentnych do zastosowań klinicznych.

Wprowadzenie

Materiały inteligentne przyciągnęły znaczną uwagę ze względu na ich potencjał do odwracalnych reakcji „na żądanie” w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne i/lub środowiskowe. Materiały responsywne na temperaturę wzbudziły szczególne zainteresowanie ze względu na ich zachowanie związane z dolną krytyczną temperaturą rozpuszczalności (LCST), co prowadzi do wytrącania sterowanego temperaturą w temperaturach T>LCST1,2. W przypadku hydrożeli termoreaktywnych zachowanie to objawia się odwracalnymi procesami pęcznienia i kurczenia, co skutkuje możliwością regulacji rozmiaru objętościowego (większego przy T3, wielkości porów (większych przy T4 oraz właściwości międzyfazowych (bardziej hydrofilnych przy T5 za pomocą temperatury. Przejścia te znajdują szerokie zastosowanie w dostarczaniu leków (w celu uwalniania leków wyzwalanego zewnętrznie lub środowiskowo4,6,7), inżynierii tkankowej i hodowlach komórkowych (w celu termoodwracalnej adhezji/delaminacji komórek8,9,10), procesach rozdziału (w celu uzyskania przełączalnej porowatości i przepuszczalności membran lub termicznie recyklowalnych podłoży diagnostycznych11,12,13), procesach mikrofluidycznych (w celu zastosowania zaworów włącz/wyłącz regulujących przepływ14,15) oraz jako modyfikatory reologiczne (w celu uzyskania lepkości regulowanej temperaturą16). Najczęściej badane hydrożele termoreaktywne opierają się na poli(N-izopropyloakrylamidzie) (PNIPAM)17, choć znaczące (i rosnące) prace prowadzono również nad poli(metakrylanem oligoetylenoglikolu) (POEGMA)2,18 oraz poli(winylokaprolaktamem) (PVCL)19,20. POEGMA wzbudził w ostatnim czasie szczególne zainteresowanie ze względu na przewidywaną lepszą biokompatybilność21,22 oraz łatwo regulowalne zachowanie LCST, w którym liniowo przewidywalne mieszaniny monomerów o różnej liczbie jednostek powtarzalnych tlenku etylenu w łańcuchach bocznych pozwalają na zmianę LCST z ~20 °C do >90 °C2,23. Jednakże każdy z tych polimerów jest otrzymywany poprzez polimeryzację rodnikową i tym samym posiada szkielet węglowo-węglowy, co znacznie ogranicza potencjalną użyteczność i możliwość wdrożenia takich polimerów w zastosowaniach biomedycznych, w których degradacja (lub przynajmniej zdolność do usuwania poprzez filtrację nerkową) jest zazwyczaj wymagana.

W odpowiedzi na to ograniczenie, niedawno szczegółowo opisaliśmy zastosowanie chemii hydrazonowej (tj. reakcji między hydrazydem a prepolimerami funkcjonalizowanymi aldehydem) do przygotowania degradowalnych analogów hydrożeli termoreakcyjnych24,25,26,27,28,29. Szybka i odwracalna reakcja między grupami hydrazydowymi i aldehydowymi po zmieszaniu funkcjonalizowanych polimerów prekursorowych30 umożliwia zarówno żelowanie in situ (co pozwala na łatwą iniekcję tych materiałów bez konieczności implantacji chirurgicznej czy stosowania zewnętrznego bodźca polimeryzacyjnego, takiego jak naświetlanie UV lub inicjacja chemiczna), jak i degradację hydrolityczną sieci z szybkością kontrolowaną przez chemię i gęstość miejsc sieciowania. Ponadto, dzięki utrzymaniu masy cząsteczkowej prepolimerów użytych do przygotowania hydrożeli poniżej granicy filtracji nerkowej, hydrożele wytworzone tą metodą degradują z powrotem do oligomerycznych polimerów prekursorowych, które mogą zostać usunięte z organizmu25,27,28. W połączeniu z niską cytotoksycznością i słabą odpowiedzią zapalną tkanką indukowaną przez te materiały25,26,27, podejście to oferuje potencjalnie możliwą do wdrożenia metodę wykorzystania inteligentnych hydrożeli termoreakcyjnych w medycynie, szczególnie jeśli uda się wytworzyć dobrze kontrolowane degradowalne analogi takich hydrożeli w każdej skali długości (makro, mikro i nano).

W niniejszym protokole opisujemy metody syntezy termoreaktywnych prepolimerów funkcjonalizowanych kontrolowaną liczbą grup hydrazydowych i aldehydowych, a także metody zastosowania tych polimerów w celu tworzenia hydrożeli o ściśle określonych wymiarach w różnych skalach długości. W szczególności niniejszy artykuł opisuje cztery odrębne podejścia, które opracowaliśmy w celu kontrolowania mieszania reaktywnych prepolimerów funkcjonalizowanych grupami hydrazydowymi i aldehydowymi, co pozwala na tworzenie termoreaktywnych sieci hydrożelowych o ściśle określonej geometrii i morfologii:

W celu wytworzenia degradowalnych hydrożeli objętościowych o określonych rozmiarach opisano strategię szablonowania, w której reaktywne prepolimery są wprowadzane do oddzielnych cylindrów strzykawki dwucylindrycznej wyposażonej na wylocie w mieszalniku statycznym, a następnie współekstruowane do silikonowej formy o pożądanym kształcie i wymiarach hydrożelu21,27 (Rysunek 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat tworzenia hydrożelu masowego. Roztwory polimerów funkcjonalizowanych hydrazydami i aldehydami (w wodzie lub buforze wodnym) wprowadza się do oddzielnych cylindrów strzykawki dwuosiowej, a następnie współwytłacza poprzez mieszalnik statyczny do cylindrycznej formy silikonowej. Szybka żelacja  in situ po zmieszaniu prowadzi do powstania hydrożelu sieciowanego wiązaniami hydrazonowymi, który staje się samodzielnie utrzymującym się ciałem (po wyjęciu z formy) w ciągu od kilku sekund do kilku minut, w zależności od stężenia i gęstości grup funkcyjnych polimerów prekursorowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W celu wytworzenia biodegradowalnych cząsteczek żelu w skali mikronowej opisano reaktywną metodę mikrofluidyczną, w której roztwory polimerów prekursorowych są jednocześnie mieszane i emulgowane przy użyciu układu mikrofluidycznego zaprojektowanego w technologii miękkiej litografii, co umożliwia tworzenie mieszanych kropli reaktywnych polimerów, które następnie żelują in situ, tworząc mikrocząsteczki żelu o rozmiarach zdefiniowanych przez emulsję (Rycina 2)31,32.

figure-introduction-2
Rycina 2: Schemat tworzenia mikrocząstek żelowych za pomocą reaktywnej mikrofluidyki. (A,B) Roztwory polimerów funkcjonalizowanych hydrazydem i aldehydem (w wodzie lub buforze wodnym) są podawane za pomocą pompy strzykawkowej do oddzielnych zbiorników, które są połączone w dalszej części układu poprzez zygzakowatą serię kanałów zaprojektowanych w celu stworzenia gradientu ciśnienia zapobiegającego cofaniu się przepływu. Polimery są następnie mieszane tuż przed poddaniem ich ścinaniu przez olej parafinowy przepływający z obu stron (również tłoczony pompą strzykawkową) i wymuszeniem przepływu przez dyszę, co prowadzi do produkcji kropli wodnych (roztworu polimeru) w ciągłej fazie oleju parafinowego metodą skupiania przepływu (flow-focusing) (patrz (B) w celu uzyskania ilustracji obszaru dyszy i procesu tworzenia kropli). Dwa dodatkowe wloty oleju parafinowego znajdują się za dyszą, aby dodatkowo odseparować krople w kanale zbierającym, co umożliwia pełną żelatynację przed usunięciem cząstek z przepływu laminarnego, po czym powstałe mikrocząsteczki żelu są zbierane w zlewce z mieszadłem magnetycznym; (C) Zdjęcie procesu generowania kropli przy dyszy (polimer hydrazydowy oznaczono kolorem niebieskim, aby zilustrować mieszanie) 

W celu stworzenia biodegradowalnych cząstek żelu w nanoskali opisano metodę reaktywnego samoorganizowania napędzanego termicznie, w której roztwór jednego z reaktywnych polimerów prekursorowych (polimeru „zarodkowego”) jest podgrzewany powyżej jego LCST w celu utworzenia stabilnego nanoagregatu, który następnie jest sieciowany poprzez dodanie komplementarnego reaktywnego polimeru prekursorowego (polimeru „sieciującego”); otrzymany nanożel sieciowany wiązaniami hydrazonowymi ma rozmiar bezpośrednio szablonowany przez nanoagregat (Rysunek 3)28.

figure-introduction-3
Rycina 3: Schemat tworzenia nanogelu poprzez reaktywną samoorganizację napędzaną termicznie. Wodny roztwór zawierający (termoresponsywny) polimer funkcjonalizowany hydrazydem jest podgrzewany powyżej jego dolnej krytycznej temperatury rozpuszczalności (LCST) w celu utworzenia stabilnego, niesieciowanego nanoagregatu. Następnie dodawany jest polimer funkcjonalizowany aldehydem, aby usieciować nanoagregat poprzez tworzenie wiązań hydrazonowych, co stabilizuje cząsteczkę nanogelu po ochłodzeniu poniżej LCST. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W celu wytworzenia biodegradowalnych nanowłókien opisano technikę reaktywnego elektroprzędzenia, w której strzykawka dwukanałowa wyposażona w mieszalnik statyczny na wylocie (stosowana do otrzymywania hydrożeli masowych) jest podłączona do standardowej platformy do elektroprzędzenia (Rycina 4)33.

figure-introduction-4
Rycina 4: Schemat tworzenia nanowłókien hydrożelu za pomocą reaktywnego elektroprzędzenia. Strzykawka dwukanałowa z mieszaczem statycznym (napełniona zgodnie z opisem dla hydrożeli masowych, lecz zawierająca również frakcję wysokocząsteczkowego poli(tlenku etylenu) jako wspomagacza elektroprzędzenia) jest zamontowana na pompie strzykawkowej, a igła na końcu strzykawki jest podłączona do zasilacza wysokiego napięcia. Sieciowanie hydrazonowe zachodzi podczas procesu przędzenia włókien, dzięki czemu w momencie uderzenia strumienia o kolektor (folię aluminiową lub obracający się dysk aluminiowy) zachowana zostaje morfologia nanowłóknista. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zastosowanie takich metod do tworzenia degradowalnych inteligentnych sieci hydrożelowych zostało zademonstrowane w niniejszym protokole z wykorzystaniem PNIPAM lub POEGMA jako polimeru docelowego; jednak opisane podstawowe podejścia można przenieść na dowolny polimer rozpuszczalny w wodzie, przy czym konieczne mogą być odpowiednie korekty lepkości oraz (w przypadku metody wytwarzania nanożeli poprzez samoorganizację) stabilności prepolimeru podczas tworzenia zarodkowego nanoagregatu.

Protokół

1. Synteza polimerów funkcjonalizowanych hydrazydami

Uwaga: Następująca konkretna receptura jest podana dla termoresponsywnego polimeru prekursorowego POEGMA (PO10) z funkcjonalizacją hydrazydu o stężeniu 30% molowym. Polimery prekursorowe PNIPAM i POEGMA o różnych temperaturach przemiany fazowej można wytworzyć przy użyciu tej samej ogólnej metody, ale modyfikując rodzaj i stosunek zastosowanych monomerów rdzeniowych (patrz sekcja 1.2 w celu zapoznania się z modyfikacjami dla różnych polimerów POEGMA)21,25,27.

  1. Odważyć 37 mg 2,2'-azobis(2-metylopropionianu) (AIBMe, inicjator), 3,1 g metakrylanu glikolu dietylenowego (M(EO)2MA), 0,9 g metakrylanu glikolu oligoetylenowego (OEGMA475, 475 g/mol n=7-8 powtarzających się jednostek tlenku etylenu), 523 μl kwasu akrylowego (AA, komonomer) i 7,5 μl kwasu tioglikolowego (TGA, środek przenoszący łańcuch) do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml.
  2. Dla PO0 (temperatura przejścia w temperaturze pokojowej POEGMA) należy użyć 4,0 g M(EO)2MA (nr OEGMA475). W przypadku PO100 (bez temperatury przejścia POEGMA) należy użyć 4,0 g OEGMA475 (bez M(EO)2MA).
    Uwaga: Pośrednie temperatury przemiany fazowej można osiągnąć w oparciu o zastosowanie mieszanin pośrednich M(EO)2MA i OEGMA475, według Lutza i wsp.23
  3. Rozpuścić wszystkie odczynniki w dioksanach (5 ml/g całkowitego monomeru) w kolbie okrągłodennej z jedną lub kilkoma szyjkami.
  4. Oczyszczać reakcję przepływem azotu (klasy UHP) przez 30 minut.
  5. Po oczyszczeniu kolbę umieścić w wstępnie podgrzanej łaźni olejowej utrzymywanej w temperaturze 75 °C przez 4 godziny pod wpływem azotu i mieszając magnetycznie 400 obr./min.
  6. Po 4 godzinach usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej ustawionej na 50 °C i 200 obr./min.
  7. Powstały produkt polimerowy rozpuścić w 150 ml wody dejonizowanej.
  8. Dodać dihydrycyd kwasu adypinowego (ADH) w pięciokrotnym nadmiarze molowym do liczby reszt AA włączonych do polimeru (w tym przykładzie AA zawiera 29% molowych jednostek monomeru w wytworzonych polimerach, zgodnie z miareczkowaniem konduktometrycznym).
  9. Doprowadzić pH roztworu do pH 4,75 za pomocą 0,1 M HCl.
  10. Po ustabilizowaniu pH dodać N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimid (EDC) przy 5-krotnym nadmiarze molowym do liczby obecnych reszt AA).
  11. Utrzymać pH reakcji na poziomie 4,75 z kroplowym dodawaniem 0,1 M HCl przez 4 godziny.
  12. Pozostaw reakcję do wymieszania na noc.
  13. Wlej roztwór produktu do trzech probówek dializacyjnych o długości ~30 cm (odcięcie masy cząsteczkowej 3500 Da, grubość 1 cal), używając lejka, aby zminimalizować rozlanie. Użyj zacisku zaciskowego, aby zamknąć dno rurki przed napełnieniem, składając mały (~ 2 cm) segment rurki, aby poprawić integralność zacisku; Powtórz od góry (naciskając, aby usunąć pęcherzyki powietrza) po zakończeniu napełniania. Umieść probówki w 100-krotnie nadmiarze wody dejonizowanej i pozostaw na co najmniej 6 godzin, całkowicie wymieniając wodę w ciągu sześciu cykli dializy, aby osiągnąć pożądaną czystość.
  14. Liofilizować dializowaną próbkę w celu uzyskania końcowego wysuszonego produktu polimerowego.

2. Synteza polimerów funkcjonalizowanych aldehydami

  1. Synteza monomeru prekursora aldehydu N-(2,2-dimetoksyetylo)metakrylanu (DMEMA)
    1. Umieścić 200 ml 20% w/v roztworu NaOH w 500 ml kolby okrągłodennej z 3 szyjkami.
    2. Schłodzić roztwór w łaźni lodowej i utrzymać temperaturę 0 °C z lodem podczas reakcji.
    3. Dodać 50 ml aminoacetyloaldehydu dimetyloacetalu do schłodzonego roztworu NaOH.
    4. Dodać 0,1 g TEMPO ((2,2,6,6-tetrametylopipryrydyno-1-ylo)oksylu) i mieszać z prędkością 400 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego, aż do całkowitego rozpuszczenia TEMPO.
    5. Dodawać 48 ml chlorku metakryloylu kroplami za pomocą biurety przez 2 godziny.
    6. Po 2 godzinach przykryj naczynie reakcyjne folią aluminiową i pozostaw na noc do wymieszania.
    7. Ekstrahować produkt, dodając produkt reakcji do 75 ml eteru naftowego w lejku separacyjnym o pojemności 1 l, wstrząsając, odgazowując i odrzucając wierzchnią warstwę.
    8. Powtórzyć krok 2.1.7 trzy razy, dodając produkt dolnej warstwy z każdego etapu ekstrakcji jako produkt surowy do następnego cyklu ekstrakcji.
    9. Usuń ostatnią dolną warstwę produktu i przenieś do zlewki o pojemności 100 ml.
    10. Dodać ~5 g siarczanu magnezu (Mg2SO4) do zlewki z monomerem, aż do zaobserwowania efektu "śnieżnej kuli".
    11. Przefiltrować przez lejek Buchnera o pojemności 100 ml, aby usunąć Mg2SO4.
    12. Przepłukać zlewkę dwukrotnie ~75 ml eteru metylowego tert-butylu, za każdym razem przelewając roztwór płuczący przez lejek.
    13. Przenieść produkt do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml i odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze pokojowej 200 obr./min w celu zebrania produktu końcowego.
  2. Synteza polimerów funkcjonalizowanych aldehydami
    Uwaga: Dla polimeru prekursorowego POEGMA (PO 10) o 30% mol. funkcjonalizacji aldehydowej podano następującą szczegółową recepturę dla mimetycznego polimeru POEGMA (PO10). Polimery prekursorowe PNIPAM i POEGMA o różnych temperaturach przemiany fazowej można wytwarzać przy użyciu tej samej ogólnej metody, ale modyfikując rodzaj i stosunek zastosowanych monomerów rdzeniowych (patrz sekcja 1.2 w celu zapoznania się z modyfikacjami dla różnych polimerów POEGMA)21,25,27.
    1. Odważyć 37 mg 2,2'-azobis(2-metylopropionianu) (AIBMe), 3,10 g metakrylanu glikolu dietylenowego M(EO)2MA, 0,1 g metakrylanu oligo glikolu etylenowego (OEGMA475, 475 g/mol, n=7-8 powtórzeń tlenku etylenu), 1,30 g N-(2,2-dimetoksyetylo)akrylamidu (DMEMA) i 7,5 μl kwasu tioglikolowego (TGA) do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml.
    2. Dla PO0 (temperatura przejścia w temperaturze pokojowej POEGMA) należy użyć 4,0 g M(EO)2MA (nr OEGMA475). W przypadku PO100 (bez temperatury przejścia POEGMA) należy użyć 4,0 g OEGMA475 (bez M(EO)2MA).
      Uwaga: Pośrednie temperatury przemiany fazowej można osiągnąć w oparciu o zastosowanie mieszanin pośrednich M(EO)2MA i OEGMA475, według Lutza i wsp. 23
    3. Rozpuścić wszystkie odczynniki w dioksanach (5 ml/g całkowitego monomeru) w kolbie okrągłodennej z jedną lub kilkoma szyjkami.
    4. Oczyszczać reakcję przepływem azotu (klasy UHP) przez 30 minut.
    5. Po oczyszczeniu kolbę umieścić w wstępnie podgrzanej łaźni olejowej utrzymywanej w temperaturze 75 °C przez 4 godziny pod wpływem azotu i mieszając magnetycznie 400 obr./min.
    6. Po 4 godzinach usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej ustawionej na 50 °C i 200 obr./min.
    7. Powstały produkt polimerowy rozpuścić w 100 ml dejonizowanegoH2O.
    8. Dodać 50 ml 1 M HCl do rozpuszczonego roztworu i mieszać pod mieszaniem magnetycznym (400 obr./min) przez 24 godziny, aby w pełni zhydrolizować funkcje acetalu w DMEMA.
    9. Po zakończeniu reakcji przenieść roztwór polimeru do rurki dializy, zgodnie z krokiem 1.13.
    10. Liofilizować dializowaną próbkę w celu uzyskania końcowego wysuszonego produktu polimerowego.

3. Wytwarzanie hydrożeli luzem usieciowanych hydrazonem

  1. Rozpuść polimery funkcjonalizowane hydrazydami i aldehydami oddzielnie w 10 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub dowolnym pożądanym buforze wodnym, aby uzyskać roztwory o pożądanych stężeniach.
    Uwaga: Zazwyczaj stosuje się stężenia masowe w zakresie 5-40% wag., przy czym żelowanie w niższych stężeniach jest możliwe, jeśli na polimerach obecne są frakcje wyższych grup funkcyjnych.
  2. Używając strzykawki z pojedynczą lufą do przenoszenia roztworów, załaduj każdy roztwór prekursora (~1 ml każdy) do oddzielnych beczek strzykawki dwucylindrowej (strzykawka o objętości 2,5 ml i proporcjach 1:1) podłączonej do mieszalnika statycznego (długość 1,5") i (opcjonalnie) strzykawki (zwykle 18 G, długość 1,5 cala do badań in vitro) i (opcjonalnie) strzykawki (zwykle 18 G, Długość 1,5 cala do badań in vitro).
  3. Przygotuj formy o pożądanej grubości, kształcie i średnicy, wybijając otwory w arkuszu gumy silikonowej.
    Uwaga: W typowym eksperymencie standardowy zestaw dziurkaczy służy do wybijania cylindrycznego otworu o średnicy 7 mm w arkuszu gumy silikonowej o grubości 1/16" (całkowita objętość zbiornika ~300 μL).
  4. Zamontuj silikonową formę na standardowym szklanym szkiełku mikroskopowym tak, aby otwory wybite w formie były całkowicie podparte szkłem. Zaleca się umycie szkła 0,1 M HCl, ale nie jest to wymagane przed montażem formy silikonowej.
  5. Współwytłacz zawartość strzykawki z podwójną lufą przez mieszalnik statyczny, aby całkowicie wypełnić (lub lekko przepełnić, z meniskiem u góry) silikonową formę.
    Uwaga: Podczas jednej próbki do wytłaczania można przygotować wiele próbek, pod warunkiem, że czas żelowania jest tego samego rzędu wielkości lub dłuższy niż całkowity czas wymagany do wypełnienia wielu form.
  6. Umieść kolejny standardowy szklany szkiełko mikroskopowe na wierzchu formy i poczekaj na zakończenie żelowania.
    Uwaga: Standardowe receptury opisane w rozdziale dotyczącym syntezy żelują w ciągu <1 minuty; wolniejsze czasy żelowania (a tym samym dłuższe wymagane czasy oczekiwania) obserwuje się przy niższych gęstościach grup funkcyjnych, niższych stężeniach polimerów i/lub wyższych frakcjach OEGMA475 w stosunku do M(EO)2MA (dla hydrożeli POEGMA).
  7. Zdejmij górne szkiełko mikroskopu i za pomocą szpatułki odepchnij hydrożel od formy z gumy silikonowej.
  8. Podnieś formę z dolnego szkiełka mikroskopu, aby odzyskać hydrożele do dalszych testów.

4. Wytwarzanie mikrocząsteczek żelu usieciowanego hydrazonem

  1. Produkcja chipa mikroprzepływowego
    1. Odwodnić płytkę krzemową (D = 76,2 mm, grubość 380 μm, domieszkowana P, orientacja <100>) przez ogrzewanie na płycie grzejnej w temperaturze 200 °C przez 5 minut.
    2. Wyśrodkuj wafel na powlekarce wirowej i pokryj warstwę fotorezystu SU-8 100 o grubości ~100 μm, nakładając ~7 ml rezystu SU-8, zwiększając prędkość wirowania do 3000 obr./min z prędkością 500 obr./min, a następnie utrzymując prędkość 3000 obr./min przez 30 sekund.
    3. Piecz panierkę w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie delikatnie piecz ją w temperaturze 95 °C przez 30 minut.
    4. Wydrukuj fotomaskę na przezroczystości ze wzorem mikroprzepływowym zdefiniowanym przez Rysunek 2A, tak aby przezroczyste sekcje były pożądanym wzorem spolimeryzowanej warstwy fotorezystu.
    5. Włóż płytkę silikonową pokrytą fotorezystem i fotomaskę do wyrównywacza maski i naświetlaj płytkę światłem 365 nm przez 95 s (moc naświetlania 6,5 W).
    6. Piecz wzorzystą wafelkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C, najpierw umieszczając ją na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C, a następnie podgrzewając płytę grzejną do 95 °C w temperaturze 10 °C/min.
    7. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i umieść go w zlewce o pojemności 500 ml zawierającej 100 ml wywoływacza SU-8 na co najmniej 10 minut, powoli obracając wafel w roztworze, aby usunąć nienaświetlony fotorezyst. Po 10 minutach opłucz wzorzystą płytkę izopropanolem i osusz powietrzem. Przechowuj wzorzysty wafel w chłodnym, suchym miejscu, z dala od światła, gdy nie jest używany do formowania replik miękkiej litografii.
    8. Umieść wzorzystą formę mikroprzepływową na szalce Petriego. Umieść długości ~10 mm silikonowej rurki L/S 13 na wlotach i wylotach chipa.
    9. Wlej ~ 10 ml poli(dimetylosiloksanu) (PDMS; przygotowanego przez zmieszanie bazy elastomeru silikonowego i utwardzacza z elastomeru silikonowego w stosunku 10:1) na wierzch chipa, ostrożnie unikając umieszczania jakichkolwiek PDMS w umieszczonej silikonowej rurce.
    10. Umieść szalkę Petriego w komorze próżniowej na ~10 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza utrzymujące się w strukturze wzorzystej i wokół niej podczas utwardzania.
    11. Utwardzić PDMS, umieszczając szalkę Petriego zawierającą wzorzystą formę i nieutwardzoną PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 85 °C na 2-3 godziny.
    12. Ostrożnie oderwij utwardzony PDMS od wzorzystej płytki krzemowej, aby odsłonić miękką litograficzną replikę formy mikroprzepływowej PDMS z wzorem litograficznym.
    13. Umieść wzorzysty PDMS i szklaną szkiełko do góry nogami w myjce plazmowej o dużej mocy z zasilaniem powietrzem. Zastosuj plazmę o natężeniu 200 mTorr i 45 W przez 90 sekund, aby przykleić PDMS do szkiełka i stworzyć ostateczny chip mikroprzepływowy.
  2. Synteza mikrocząstek żelu
    1. Przygotować funkcjonalizowany hydrazydami PNIPAM (PNIPAM-Hzd) przez rozpuszczenie NIPAM (4,5 g), kwasu akrylowego (0,5 g - 15 mol% całkowitego monomeru), kwasu tioglikolowego (TGA, 80 μL) i estru dimetylowego kwasu 2,2-azobisisomasłowego (AIBME, 0,056 g) w 20 ml bezwodnego etanolu, a następnie postępować zgodnie z krokami 1.4-1.14 w celu zakończenia syntezy, zmieniając temperaturę reakcji na 56 °C w kroku 1.5.
    2. Przygotować funkcjonalizowany aldehydami PNIPAM (PNIPAM-Ald) przez rozpuszczenie NIPAM (4 g), N-(2,2-dimetoksyetylo)metakrylanu (DMEMA, 0,95 g - 13,4 % mol całkowitego monomeru), kwasu tioglikolowego (TGA, 80 μL) i estru dimetylowego kwasu 2,2-azobisisomasłowego (AIBME, 0,056 g) w 20 ml etanolu, a następnie wykonując kroki 2.2.4-2.2.10 w celu zakończenia syntezy, zmieniając temperaturę reakcji na 56 °C w kroku 2.2.5.
    3. Rozpuścić PNIPAM-Hzd i PNIPAM-Ald w stężeniu 6% wag. w wodzie dejonizowanej i załadować do oddzielnych standardowych strzykawek o pojemności 5 ml.
    4. Rozpuść 1% wag. niejonowy środek powierzchniowo czynny (np. Span 80) w ciężkim oleju parafinowym i załaduj roztwór do standardowej strzykawki o pojemności 60 ml.
    5. Podłącz dwie strzykawki z roztworem polimeru prekursorowego indywidualnie do dwóch oddzielnych kanałów wlotowych polimeru na chipie mikroprzepływowym, a roztwór oleju parafinowego do kanału wlotowego oleju na chipie mikroprzepływowym za pomocą silikonowej rurki 1/32" ID (~30 cm długości na wlot, ~45 cm długości na wylot).
    6. Używając dwóch oddzielnych pomp strzykawkowych do infuzji (jedna dla oleju przed strumieniem, druga dla oleju dodawanego za dyszą), dostarcz olej do chipa z natężeniem przepływu od 1,1 ml / h do 5,5 ml / h bez uruchamiania przepływu polimeru, aby zalać chip i upewnić się, że chip jest wolny od wad i sprawny (zwykle utrzymywany przez okres 30 minut).
    7. Za pomocą oddzielnej pompy strzykawkowej do infuzji dostarczyć każdy z wodnych roztworów polimerowych do chipa z szybkością przepływu 0,03 ml/h.
    8. Po początkowym okresie stabilizacji w celu zapewnienia, że przepływ jest zrównoważony i powstają jednorodne cząstki (30 min - 1 h), zebrać cząstki do magnetycznie mieszanej kolby okrągłodennej.
    9. Zbieraj cząstki, aż cały olej zostanie zużyty (12-55 godzin, w zależności od przepływu). Zatrzymać pompy strzykawkowe i, w razie potrzeby, natychmiast przepompować wodę zamiast roztworów polimerów prekursorowych przez chip w celu oczyszczenia. Jednak biorąc pod uwagę szybkie żelowanie tych materiałów in situ po zatrzymaniu przepływu, zaleca się użycie nowego chipa do każdego oddzielnego eksperymentu.
    10. Wyłącz mieszanie magnetyczne i pozwól, aby mikrocząsteczki żelu opadły. Zdekantować cały dostępny olej parafinowy za pomocą pipety.
    11. Aby usunąć pozostały olej parafinowy, przemyj mikrocząstki żelu pentanem (nakładanym w objętości 10 ml na każde 0,5 ml objętości mikrocząstek), energicznie mieszaj emulsję przez ~ 1 minutę, pozwól mikrocząstkom żelu ponownie się osiąść przez ~1-2 godziny i zdekantuj pozostałą fazę organiczną za pomocą pipety. Powtórz co najmniej 5 razy, aby zapewnić pełne usunięcie oleju parafinowego.
    12. Ponownie zawiesić mikrocząsteczki żelu w 10 ml dejonizowanej wody w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml i przepłukać fiolkę azotem przez noc, aby usunąć wszelkie pozostałości pentanu.

5. Wytwarzanie usieciowanych nanożeli Hydrazone

  1. Rozpuścić roztwory podstawowe PNIPAM-Hzd (1 w/v%) i PNIPAM-Ald (1 w/v%) w wodzie dejonizowanej. Przygotować PNIPAM-Hzd i PNIPAM-Ald zgodnie z opisem odpowiednio w sekcjach 4.2.1 i 4.2.2.
  2. Podgrzać 5 ml podwielokrotności roztworu podstawowego PNIPAM-Hzd do temperatury 70°C za pomocą kąpieli olejowej przy mieszaniu magnetycznym (350 obr./min) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml.
    UWAGA: Roztwór powinien stać się nieprzezroczysty (tj. temperatura powinna przekroczyć dolną temperaturę krytyczną roztworu PNIPAM-Hzd), ale nie powinien powstać widoczny osad.
  3. Dodawać kroplami 0,25 ml podwielokrotności PNIPAM-Ald (5-20% masy PNIPAM-Hzd obecnego w roztworze nasiennym) do podgrzanego roztworu PNIPAM-Hzd przez okres 5-10 s.
  4. Kontynuować mieszanie roztworu w fiolkach scyntylacyjnych przez dodatkowe 15 minut, po czym wyjąć próbkę z kąpieli olejowej i pozostawić produkt do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez noc.
  5. Powstałe nanożele należy dializować w cyklach 6x6 godzinnych (przy użyciu membrany dializacyjnej MWCO o mocy 3500 kDa) w stosunku do wody dejonizowanej, aby usunąć wszelkie nieusieciowane polimery. W razie potrzeby liofilizuj do przechowywania.

6. Wytwarzanie usieciowanych nanowłókien hydrazonowych

  1. Przygotować funkcjonalizowany hydrazydem POEGMA (POEGMA-Hzd) przez rozpuszczenie 37 mg 2,2'-azobis(2-metylopropionianu) dimetylu (AIBMe), 4,0 g metakrylanu oligoetylenu glikolu (OEGMA475, 475 g/mol, n=7-8 powtarzających się jednostek tlenku etylenu) i 0,25 g kwasu akrylowego (AA) w 20 ml dioksanu i wykonując kroki 1,3-1.14 w celu zakończenia syntezy.
  2. Przygotować funkcjonalizowany aldehydem POEGMA (POEGMA-Ald) przez rozpuszczenie 50 mg 2,2'-azobis(2-metylopropionianu) dimetylu (AIBMe), 4,0 g metakrylanu oligoetylenu glikolu (OEGMA475, 475 g/mol, n=7-8 powtórzeń tlenku etylenu) i 0,60 g metakrylanu N-(2,2-dimetoksyetylo)(DMEMA) w 20 ml dioksanu i wykonując kroki 2.2.3-2.2.10 w celu zakończenia syntezy.
  3. Rozpuścić POEGMA-Hzd (15% wag.) i POEGMA-Ald (15% wag.) w oddzielnych roztworach wody dejonizowanej.
  4. Rozpuścić poli(tlenek etylenu) (PEO, Mw=600x103 g/mol, 5 wt%) w wodzie dejonizowanej. Wymieszać 1 ml roztworu PEO z każdym reaktywnym roztworem POEGMA przygotowanym w kroku 6.3, aby uzyskać końcowe roztwory prekursorowe o zawartości 7,5% wag. polimeru prekursorowego POEGMA i 2,5% % wag. PEO.
  5. Załadować oba roztwory do oddzielnych beczek tej samej strzykawki dwubębnowej opisanej w punkcie 3 (łącznie z mieszalnikiem statycznym 1,5") i zamontować strzykawkę dwucylindrową na pompie strzykawkowej do infuzji.
  6. Podłącz mieszalnik statyczny i igłę 18G z końcówką do strzykawki dwucylindrowej.
  7. Podłącz zasilacz wysokonapięciowy do igły z końcówką, uziemionej na kolektorze.
    UWAGA: Kolektory składają się z kwadratu folii aluminiowej o wymiarach 10 mm x 10 mm lub aluminiowego dysku o średnicy ~10 mm obracającego się z prędkością 200 obr./min, oba zamontowane prostopadle do igły w odległości 10 cm od końca igły.
  8. Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością 0,48 ml/h i jednocześnie włączyć wysokie napięcie 8,5 kV, aby wykonać elektroprzędzenie i wytworzyć nanowłókna.
  9. Kontynuuj elektroprzędzenie zgodnie z potrzebami, aby wykonać rusztowania o różnej grubości lub do wyczerpania roztworów wlotowych.
  10. Aby usunąć przyrząd do elektroprzędzenia PEO, należy namoczyć zebrane rusztowania na 24 godziny w wodzie dejonizowanej.

Wyniki

Objętościowe hydrożele wytłaczane z dwukomorowej strzykawki do silikonowej formy dopasowują się do jej wymiarów i stają się samodzielne po usunięciu formy; żelowanie następuje zazwyczaj od kilku sekund do kilku minut po współwytłaczaniu, w zależności od użytych prekursorów polimerowych. Typowa charakterystyka poprzez pomiar pęcznienia (mierzone grawimetrycznie przy użyciu wkładki do hodowli komórkowej w celu łatwego usunięcia hydrożelu z roztworu pęczniejącego), termoreaktywności (mierzonej tą samą techniką, ale z cykliczną zmianą temperatury inkubacji powyżej i poniżej temperatury przejścia fazowego), degradacji (mierzonej tą samą techniką, lecz w dłuższych okresach czasu) oraz modułu ścinania lub sprężystości (mierzonego na próbkach formowanych o grubości 2 mm i średnicy 7 mm) wykazuje możliwość dostrojenia odpowiedzi hydrożelu w zależności od chemii polimeru prekursorowego (w szczególności, dla POEGMA, stosunku krótkich do długich łańcuchów monomerów OEGMA użytych do przygotowania hydrożelu), ułamka molowego grup funkcyjnych w polimerach prekursorowych oraz stężenia tych polimerów prekursorowych (Rysunek 5)27.

Mikrofluidyka prowadzi do powstania dobrze zdefiniowanych mikrocząstek żelowych o rozmiarze od 25 do 100 µm, przy czym wielkość ta jest kontrolowana przez szybkości przepływu fazy olejowej i/lub połączonych faz polimerowych w roztworze wodnym (Rysunek 6A)31. Optyczna mikroskopia z użyciem stoлика grzewczego potwierdza, że mikrocząstki żelowe zachowują termoreaktywny charakter hydrożeli masowych, wykazując odwracalne, zależne od temperatury pęcznienie i kurczenie się z jedynie niewielką histerezą w pierwszym cyklu (przypisywalną nieodwracalnemu tworzeniu się wiązań wodorowych między sąsiednimi grupami amidowymi w stanie zapadniętym34), co jest zgodne z obserwacjami w przypadku hydrożeli masowych PNIPAM (Rysunek 6B)32. Ponadto mikrocząstki żelowe z czasem degradują z powrotem do swoich prekursorów oligomerycznych, co umożliwia ich wydalanie przez nerki (Rysunek 6C)32.

Samoorganizacja napędzana nanoagregacją polimeru PNIPAM funkcjonalizowanego hydrazydem w podgrzanym roztworze, a następnie sieciowanie z polimerem PNIPAM funkcjonalizowanym aldehydem, prowadzi do powstania wysoce monodyspersyjnych nanogeli (polidyspersyjność <0,1) o rozmiarach w zakresie 180-300 nm, w zależności od zastosowanych warunków procesu (Rysunek 7A)28. Nanogele zachowują typową reakcję termiczną charakterystyczną dla konwencjonalnych nanogeli PNIPAM sieciowanych rodnikowo, przy czym zaobserwowano niższy stopień termicznego kurczenia się wraz ze zwiększeniem ilości dodanego polimeru sieciującego (Rysunek 7B). Nanogele mogą być liofilizowane i redyspergowane bez zmiany rozmiaru cząstek (Rysunek 7C) oraz ulegać degradacji w czasie w wyniku hydrolizy do ponownego utworzenia oligomerycznych polimerów prekursorowych użytych do formulacji nanogeli (Rysunek 7D).

Reaktywne elektroprzędzenie tworzy nanowłóknistą strukturę hydrożelu (Rysunek 8A), w której możliwe jest uzyskanie średnic nanowłókien rzędu ~300 nm bez obecności widocznych cząstek rozpylonych elektrostatycznie33. Namoczenie nanowłókien opartych na POEGMA w wodzie prowadzi do szybkiej hydratacji (około dwa rzędy wielkości szybciej niż w przypadku żelu masowego o tym samym składzie, Rysunek 8B), przy jednoczesnym zachowaniu nanowłóknistej morfologii przez 8-10 tygodni przed degradacją hydrolityczną w warunkach fizjologicznych; szybsza degradacja jest obserwowana w środowiskach katalizowanych kwasem, co jest spodziewane ze względu na możliwość kwasowej katalizy degradacji wiązań hydrazonowych (Rysunek 8C). Struktury nanowłókniste są również mechanicznie wytrzymałe zarówno w stanie suchym, jak i napęczniałym podczas wielu cykli, co umożliwia łatwą manipulację i wielokrotne rozciąganie (Rysunek 8D).

figure-results-1
Rycina 5: Właściwości biodegradowalnych termoreaktywnych hydrożeli żelujących in situ. (A) Reprezentatywne mikrostruktury sieci żelu POEGMA i obrazy objętościowego hydrożelu wraz z odpowiadającymi im czasami żelowania w funkcji molowego % wbudowania OEGMA475 w polimerach prekursorach; (B-C) Moduł zachowawczy hydrożeli PO100 przy zmiennym (B) stężeniu polimeru prekursora i (C) molowym % wbudowania grup funkcyjnych na polimer prekursora; (D-F) Właściwości fizykochemiczne hydrożeli POEGMA w funkcji molowego % wbudowania OEGMA475 : (D) moduł zachowawczy, (E) profil degradacji w 1 M HCl oraz (F) temperatura przejścia objętościowego w odpowiedzi na zmianę temperatury w zakresie 20-60 °C. Wszystkie słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe dla n=4 pomiarów powtórzonych. Zaadaptowano z referencji27 za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 6: Właściwości degradowalnych mikrocząsteczek żelu otrzymanych za pomocą reaktywnej mikrofluidyki. (A) Wpływ szybkości przepływu oleju parafinowego na rozmiar (oczyszczonych) mikrocząsteczek żelu w wodzie; (B) Termoreaktywność oczyszczonych mikrocząsteczek żelu w wodzie po pojedynczym cyklu termicznym powyżej i poniżej temperatury przejścia fazowego objętościowego; (C) Ocena wizualna (zdjęcia) oraz ślady chromatografii przenikania w żelu (wykres) potwierdzające degradację mikrocząsteczek żelu z powrotem do ich prekursorowych komponentów polimerowych (tutaj w 1 M HCl w celu przyspieszenia degradacji w skali czasu obrazowania); pasek skali = 100 µm. Adaptacja z referencji32. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 7: Właściwości degradowalnych nanogeli otrzymanych w drodze reaktywnego samoorganizowania. (A) Rozkłady wielkości cząstek nanogeli przygotowanych przy różnych stosunkach masowych polimerów aldehydu do hydrazydy, wyznaczone metodą dynamicznego rozpraszania światła (wstawka: mikrograf elektronowy transmisyjny potwierdzający sferyczny kształt nanogeli); (B) Termoczułość samoorganizujących się cząstek w funkcji stosunku masowego polimeru aldehydu do hydrazydy użytego do przygotowania nanogeli (metodą dynamicznego rozpraszania światła), gdzie słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe dla n=4 powtórzeń; (C) Wizualne potwierdzenie braku agregacji nanogeli przed i po liofilizacji; (D) Wizualne potwierdzenie degradacji nanogeli katalizowanej kwasem (tutaj w 1 M HCl dla spójności z wcześniejszymi badaniami); (E) Przebiegi chromatografii przenikania żelowej produktów degradacji nanogeli, wskazujące na ich podobieństwo do prekursorowych polimerów funkcjonalizowanych hydrazydą i aldehydem. Adaptowano za zgodą z referencją28. Copyright 2015, American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 8: Właściwości biodegradowalnych nanowłókien otrzymanych w procesie reaktywnego elektroprzędzenia. (A) Obrazy z mikroskopii elektronowej skaningowej nanowłókien w stanie suchym (lewo), częściowo zanurzonych w wodzie (środek, cienka błona) oraz całkowicie namoczonych w wodzie przez noc (prawo, grube rusztowanie); (B) Pęcznienie hydrożelu nanowłóknistego (czerwony) w stosunku do hydrożelu masowego (niebieski) o tym samym składzie, gdzie słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe dla n=4 powtórzeń; (C) Obrazy z mikroskopii elektronowej skaningowej oraz (wstawka) obrazy wizualne obrazujące degradację nanowłókien katalizowaną kwasem w 1M HCl; (D) Cykle rozciągania suchych (80 cykli, 20% wydłużenia/cykl) i spęcznionych (325 cykli, 10% wydłużenia/cykl w 10 mM PBS) hydrożeli nanowłóknistych otrzymanych metodą elektroprzędzenia. Rycina zmodyfikowana na podstawie źródła33 i powielona za zgodą Royal Society of Chemistry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Z powodzeniem zastosowaliśmy wszystkie te techniki wytwarzania do wielu systemów polimerowych, stosując jedynie niewielkie zmiany metod opisanych szczegółowo powyżej dla PNIPAM i POEGMA; Jednak użytkownicy tych protokołów muszą być świadomi potencjalnych problemów, które mogą wystąpić, gdy inne polimery są podstawiane do tych procesów. W szczególności zwiększenie lepkości polimerów prekursorowych może negatywnie wpłynąć zarówno na przetwarzalność (zwłaszcza w metodzie mikroprzepływowej), jak i na efektywność mieszania dwóch polimerów prekursorowych. Ponadto czas żelowania polimerów musi być kontrolowany w tempie zależnym od docelowej morfologii, aby uniknąć przedwczesnego żelowania, które służy zahamowaniu przepływu lub uniemożliwieniu interdyfuzji reaktywnych prepolimerów, niezbędnych do utworzenia pożądanych jednorodnych struktur żelowych. Poniżej opisano konkretne ograniczenia każdej strategii, a także podejścia, które zastosowaliśmy w celu dostosowania tych podejść do takich ograniczeń w każdej skali długości produkcji.

Hydrożele luzem za pomocą koekstruzji strzykawki z podwójną lufą
Czas żelowania jest kluczową zmienną, którą należy kontrolować, aby zapewnić skuteczność techniki strzykawki dwucylindrowej do formowania hydrożeli luzem. Polimery, które żelują zbyt szybko w kontakcie (<1-2 s), mogą zatkać mieszalnik statyczny, całkowicie zatrzymując przepływ lub powodując wytłaczanie ze strzykawki niestechiometrycznych ilości dwóch polimerów prekursorowych. Odkryliśmy, że czasy żelowania >5 s są preferowane (choć nie wymagane) przy użyciu tej techniki; Jest to szczególnie ważne, jeśli replikowane hydrożele są odlewane do analizy fizycznej lub mechanicznej, aby upewnić się, że każdy odlew hydrożelowy ma ten sam skład. Czas żelowania można łatwo zmienić, zmieniając gęstość reaktywnych grup funkcyjnych na jednym lub obu polimerach prekursorowych (niższa gęstość grupy funkcyjnej prowadząca do wolniejszego żelowania) lub zmieniając stężenie polimerów prekursorowych używanych do tworzenia żelu (niższe stężenia prowadzące do wolniejszego żelowania)21. Alternatywnie, zastąpienie (bardziej reaktywnej) grupy aldehydowej (mniej reaktywną) grupą ketonową jako elektrofilem w parze żelującej znacznie skraca czas żelowania bez znaczącej zmiany składu powstałego hydrożelu35; Polimery przygotowane z mieszanin prekursorów monomerycznych aldehydu i ketonów można stosować do dostrojenia czasu żelowania zgodnie z potrzebami bez zmiany stężenia zastosowanych polimerów prekursorowych (a tym samym procentu masowego ciał stałych w powstałym żelu).

Chcielibyśmy również zauważyć, że pierwszy odlew hydrożelowy nie zawsze ma takie same właściwości, jak kolejne odlewane hydrożele, co przypisuje się niewielkim różnicom w szybkości, z jaką zawartość dwóch beczek faktycznie dociera do mieszalnika statycznego. W rezultacie, zazwyczaj zalewamy strzykawkę dwucylindrową, wytłaczając niewielką (<0,3 ml) frakcję żelu przed rozpoczęciem procesu odlewania, aby zminimalizować taką zmienność. Wreszcie, chociaż zwykle nie jest to problematyczne w przypadku stosowania oligomerycznych syntetycznych prepolimerów, lepkość jednego lub więcej roztworów polimerów prekursorowych może stanowić wyzwanie w kontekście tej techniki, zarówno pod względem ułatwienia przepływu za pomocą prostego wciśnięcia kciuka, jak i promowania efektywnego mieszania w mieszalniku statycznym. Jednak, co nieco zaskakujące, nawet prekursorowe roztwory polimerów o znacznie różnej lepkości nadal tworzą stosunkowo jednorodne hydrożele przy użyciu statycznych nasadek mieszalnika opisanych w wykazie części (np. PNIPAM z węglowodanem o wysokiej masie cząsteczkowej26), co sugeruje, że obawy dotyczące nieefektywnego mieszania w wyniku niedopasowanych lepkości mogą nie być znaczące, przynajmniej w skali masowej. W razie potrzeby użycie pompy strzykawkowej (zamiast kciuka) do sterowania przepływem i/lub użycie igły o większej średnicy na wylocie może pomóc w przezwyciężeniu problemów związanych z wytłaczaniem w tych systemach.

Hydrożele w mikroskali za pomocą reaktywnych mikrofluidyków
Kluczowym krokiem związanym z podejściem mikrofluidycznym do wytwarzania mikrocząstek żelowych jest zalanie chipa mikrofluidycznego dwoma reaktywnymi polimerami. Jeśli polimery są dostarczane do chipa pod różnymi ciśnieniami lub z różną szybkością, różnica ciśnień może spowodować przepływ wsteczny jednego roztworu polimeru prekursorowego do zbiornika (lub przynajmniej w kierunku zbiornika) drugiego polimeru prekursorowego. Powoduje to żelowanie przed powstaniem cząstek, skutecznie blokując przepływ, a tym samym wymagając utylizacji wiórów. Męcząca ścieżka odciśnięta między każdym zbiornikiem a punktem mieszania tworzy znaczny opór dla przepływu wstecznego; Jednak nawet przeszkolony operator od czasu do czasu żeluje wiór, zanim zostanie osiągnięty stabilny reżim przepływu. Z naszego doświadczenia wynika, że zazwyczaj potrzeba od 1 do 2 minut do ustabilizowania przepływów po zainicjowaniu tworzenia kropel (w tym czasie wytwarzane są stosunkowo polidyspersyjne mikrocząstki żelu); Jeśli w ciągu pierwszych 5-10 minut pracy nie zostaną zaobserwowane żadne problemy, prawdopodobnie uda się osiągnąć kilka godzin ciągłej produkcji cząstek monodyspersyjnych. Zastosowanie polimerów prekursorowych o stosunkowo dobrze dopasowanej lepkości, a także nienatychmiastowych czasach żelowania (preferowanych co najmniej >15 s) znacznie pomaga w unikaniu takich problemów i promowaniu tworzenia stabilnych przepływów.

Należy pamiętać, że różne natężenia przepływu w zakresie od 0,01-0,1 ml / h w fazie wodnej i 1,1-5,5 ml / h w fazie olejowej zostały przetestowane przy użyciu tej konstrukcji chipa, co doprowadziło do wytworzenia cząstek w zakresie wielkości ~ 25-100 μm w zależności od ścinania zastosowanego na złączu skupiającym przepływ; Szybsze prędkości przepływu są równoznaczne z wyższym ścinaniem, a zatem powstają mniejsze cząstki31,32. Stwierdzono, że zmiana natężenia przepływu oleju przy jednoczesnym utrzymaniu całkowitego natężenia przepływu w wodzie na niskim poziomie (~0,03 ml / h, jak podano w protokole) jest najbardziej skuteczna w kontrolowaniu wielkości mikrocząstek żelu bez uszczerbku dla monodyspersji lub żywotności urządzenia, przy czym zaobserwowano, że oba te czynniki znacznie się zmniejszają na wyższym końcu podanych całkowitych natężeń przepływu wody. Możliwe są większe prędkości przepływu oleju (>5,5 ml/h w celu wytworzenia mniejszych cząstek, ale zwiększone ryzyko rozwarstwienia wiórów (częste ograniczenie spotykane w przypadku mikroprzepływowych chipów PDMS wiązanych plazmą). Łączenie wiórów przy użyciu innej metody może umożliwić szybsze przepływy, a tym samym mniejszą produkcję mikrocząstek żelu, co jest strategią, którą obecnie badamy. Zmniejszenie rozmiaru dyszy może również pomóc w zmniejszeniu rozmiaru mikrocząstek, które mogą być wytwarzane, aczkolwiek przy zwiększonym ryzyku przedwczesnego żelowania przed powstaniem cząstek. Wolniejsze prędkości przepływu prowadziły do niestabilności przepływu, a tym samym do większej polidyspersji i zwiększonego ryzyka żelowania wiórów; To ograniczenie można przezwyciężyć poprzez zastosowanie wielokanałowego mikroprzepływowego systemu kontroli przepływu, który ma wyższą stabilność i wyższą rozdzielczość niż standardowe pompy strzykawkowe stosowane w tym protokole.

Wybór oleju miał kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu, ponieważ cięższe oleje (korzystne pod względem zapobiegania aglomeracji mikrocząstek żelu po pobraniu) prowadziły do znacznie mniej spójnego tworzenia się cząstek w dyszy niż lekki olej silikonowy opisany w protokole. Przypuszczamy, że ta zmniejszona odtwarzalność jest wynikiem mniejszej konsystencji pompowania cięższych olejów za pomocą strzykawki, co prowadzi do bardziej zmiennego ścinania w punkcie mieszania. Wyzwaniem było również uniknięcie agregacji mikrocząstek żelu w kolbie zbiorczej, szczególnie bezpośrednio po wyjściu z urządzenia mikroprzepływowego, w którym to momencie żelowanie in situ nie było zakończone i dostępna była duża liczba dostępnych reaktywnych grup funkcyjnych tworzących mostki między zderzających się cząstkami w kąpieli zbiorczej. Wyzwanie to jest rozwiązywane poprzez: zwiększenie długości kanału wyjściowego na samym chipie mikroprzepływowym, utrzymanie mikrocząstek żelu w przepływie laminarnym przez dłuższy czas, aby promować pełniejsze żelowanie; dodanie bocznych kanałów za dyszą, aby wprowadzić więcej oleju do wióra, a tym samym lepiej oddzielić mikrocząstki żelu w tym kanale po mieszaniu bez wpływu na pola ścinające na samej dyszy lub szybkość produkcji cząstek; oraz dodanie mieszalnika magnetycznego do kolby zbiorczej, aby uniknąć sedymentacji mikrocząstek żelu i utrzymać większą średnią separację między sąsiednimi cząstkami. Podczas gdy bardzo wolno żelujące polimery prawdopodobnie poprawiłyby stabilność urządzenia i zminimalizowały problemy z zalewaniem, zaobserwowano również, że takie systemy znacznie zwiększają ryzyko agregacji mikrocząstek żelu, ponieważ większa liczba reaktywnych grup funkcyjnych pozostaje nieprzereagowana (a tym samym jest w stanie tworzyć mostki międzycząsteczkowe) przez dłuższy czas. W związku z tym czasy żelowania rzędu 15-60 s wydają się być optymalne dla tej techniki: wystarczająco wolne, aby umożliwić zalewanie, ale wystarczająco szybkie, aby zapewnić, że większość reaktywnych grup funkcyjnych zostanie zużyta, zanim mikrocząstki żelu opuszczą kanał przepływu laminarnego do kolby zbiorczej.

Wreszcie, usunięcie oleju szablonowego jest niezbędne, aby zapewnić, że powstałe cząstki zachowają inteligentne właściwości przewidywane na podstawie składu dodanych prepolimerów i umożliwią wykorzystanie tych cząstek w kontekście biomedycznym. Opisana procedura mycia pentanem była pod tym względem wysoce skuteczna w ogólnej produkcji mikrocząstek żelu. Jednak zastosowanie tej techniki w bezpośrednim kontekście biomedycznym (np. enkapsulacja komórek w chipie) wymagałoby ponownej oceny tego protokołu. Badaliśmy również zastosowanie oliwy z oliwek, która sugeruje się, że jest olejem bardziej obojętnym w kontekście kontaktu z komórkami36, jako środka dyspergującego. Chociaż tworzenie się cząstek było możliwe, populacje mikrocząstek żelu były znacznie bardziej polidyspersyjne niż można było to osiągnąć w przypadku oleju mineralnego, przynajmniej przy obecnej konstrukcji chipa. W związku z tym, chociaż wydaje się, że chip jest przystosowany zarówno do tworzenia mikrocząstek z polimeru syntetycznego, jak i naturalnego żelu polimerowego31, może być wymagany zmodyfikowany projekt, aby szerzej wykorzystać tę technikę we wszystkich możliwych kombinacjach materiałów.

Hydrożele w nanoskali poprzez reaktywną samoorganizację
Nanożele zostały utworzone przy użyciu bardzo szerokiego zakresu warunków przetwarzania, w tym różnych stężeń polimeru z nasion (0,5-2 wag.), różnych proporcji sieciowania: polimeru nasiennego (0,05-0,2), różnych temperatur (40-80 °C), różnych prędkości mieszania (200-800 obr./min) i różnych czasów nagrzewania po dodaniu polimeru sieciującego (2-60 min)28. Jeśli chodzi o stężenia, obserwowane tendencje są generalnie zgodne z przewidywaniami, ponieważ wyższe stężenia polimeru z nasion prowadzą do większych nanożeli, a wyższe proporcje środka sieciującego do polimeru zarodkowego prowadzą do powstania nanożeli o wyższej gęstości usieciowania, a tym samym niższej termoresponsywności. Należy podkreślić, że zbyt wysokie zwiększenie stężenia polimeru nasiennego ostatecznie prowadzi do agregacji masowej, w przeciwieństwie do nanoagregacji, zgodnej z tym, co obserwuje się w konwencjonalnym procesie wytrącania wolnych rodników w celu wytworzenia termoczułych nanożeli3. Stwierdzono również, że krótsze czasy nagrzewania sprzyjają tworzeniu mniejszych i bardziej monodyspersyjnych cząstek. Stawiamy hipotezę, że utrzymywanie nanoagregatu przez dłuższy czas w temperaturze wyższej od LCST jednego lub obu polimerów prekursorowych zwiększa prawdopodobieństwo agregacji po zderzeniu nanożelu, przy czym zwiększona hydrofobowość wiązania hydrazonowego w stosunku do grup funkcyjnych aldehydu prekursorowego lub hydrazydu sprawia, że agregacja ta jest bardziej prawdopodobna wraz ze wzrostem osiągniętego stopnia usieciowania. Ostatecznie krótsze czasy nagrzewania są korzystne z punktu widzenia procesu, ponieważ populacja nanożeli monodyspersyjnych może powstać w ciągu zaledwie 2 minut po dodaniu polimeru sieciującego; Stwierdzono, że 10 minut to najdłuższy czas, który pozwala na konsekwentne wytwarzanie monodyspersyjnych nanożeli, a jednocześnie pozwala na produkcję bardziej usieciowanych nanożeli. Co ciekawe, metoda ta jest wyjątkowo niewrażliwa na mieszanie, z prawie identycznymi rozmiarami cząstek i rozkładem wielkości cząstek wynikającymi z mieszania z różnymi prędkościami, a nawet skalowania procesu do większych objętości. Choć początkowo zaskoczony tym wynikiem, prawdopodobnie świadczy on o podstawowej roli termodynamiki w regulacji produkcji nanożelu.

Aby osiągnąć niską polidyspersyjność, kluczowymi zmiennymi wydają się być stabilność koloidalna i stopień uwodnienia nanokruszywa. Na przykład nanoagregaty przygotowane przy użyciu bardziej hydrofilowych polimerów funkcjonalizowanych hydrazydami jako nasiona, w przeciwieństwie do mniej hydrofilowych polimerów funkcjonalizowanych aldehydami, prowadzą do powstania nanożeli o znacznie niższych polidyspersjach. Różnica między temperaturą montażu eksperymentalnego a LCST polimeru nasiennego jest również krytyczna. Praca w temperaturze nieco wyższej od polimeru nasiennego LCST ((T - LCST) < 5 °C) zapewnia największe prawdopodobieństwo powstania monodyspersyjnego nanożelu; działanie znacznie powyżej LCST tworzy więcej hydrofobowych i zapadniętych nanoagregatów, które są bardziej podatne na agregację i mniej podatne na sieciowanie, podczas gdy działanie poniżej LCST skutkuje stosunkowo niezwartym polimerem zarodkowym, którego nie można skutecznie lub odtwarzalnie usieciować. Aby uzyskać najlepsze przewidywanie monodyspersyjności cząstek, zalecamy najpierw wykonanie skanu UV/vis w celu zmierzenia początku LCST polimeru zarodkowego, a następnie przeprowadzenie procesu samoorganizacji w temperaturze 1-2 °C wyższej od LCST.

Należy zauważyć, że nanożele wytworzone tą metodą mogą być liofilizowane i ponownie zdyspergowane bez żadnej zmiany stabilności koloidalnej, co często nie jest możliwe w przypadku struktur samoorganizujących się i naszym zdaniem można je przypisać naszej metodzie stabilizacji sieciowania. Przewidujemy również, że tylko polimer nasienny musi być termoczuły, aby ta metoda zadziałała; Zastosowanie polimerów sieciujących, które nie reagują lub reagują na inne bodźce, może jeszcze bardziej poszerzyć ostateczne zastosowanie tej techniki. Wreszcie, ponieważ mieszanie dwóch reaktywnych polimerów prekursorowych jest w tym przypadku pasywne, a nie aktywne, czas żelowania jest znacznie mniej ważny z punktu widzenia kontroli procesu w porównaniu z innymi opisanymi strategiami wytwarzania. Jednak nawet w tej technice pożądane jest utrzymanie całkowitego czasu sieciowania <30 minut, aby zminimalizować ryzyko agregacji cząstek.

Hydrożele nanowłókniste metodą reaktywnego elektroprzędzenia
Kontrolowanie czasu żelowania reaktywnych prepolimerów ma ponownie zasadnicze znaczenie dla powodzenia produkcji nanowłókien żelowych. W szczególności zasadnicze znaczenie ma w przybliżeniu dopasowanie czasu przebywania polimerów prekursorowych w mieszalniku statycznym (kontrolowanego przez zmianę natężenia przepływu roztworu ze strzykawki dwulufowej, jak również długości i krętości mieszalnika statycznego) z czasem żelowania polimerów prekursorowych zarówno dla zachowania wirowalności, jak i zapewnienia skutecznego sieciowania włókien przędzonych między igłą a kolektorem. Szybsze żelowanie prowadzi do nieefektywnego rozwoju stożka Taylora, a tym samym słabej przędzalności, podczas gdy wolniejsze żelowanie powoduje, że roztwór wodny zamiast żelu uderza w kolektor, co skutkuje rozprzestrzenianiem się i ostatecznym tworzeniem się cienkowarstwowego żelu zamiast nanowłókien. Stwierdzono również, że praca w czasie przebywania nieco krótszym od czasu żelowania masowego jest skuteczna (a nawet preferowana w celu zmniejszenia ryzyka zatkania igły), ponieważ parowanie wody podczas wirowania roztworu skutecznie koncentruje polimery prekursorowe w strumieniu, a tym samym przyspiesza kinetykę żelowania podczas procesu przędzenia. W tym samym duchu praca przy większych odległościach między igłą a kolektorem (>10 cm) jest ogólnie korzystna w tym procesie, ponieważ krótsze odległości skracają czas dostępny do odparowania wody, a tym samym wymagają bardziej rygorystycznej kontroli zależności między czasem przebywania a czasem żelowania w celu zachowania produktu nanowłóknistego.

Należy zauważyć, że użycie PEO (lub innego polimeru o dużej masie cząsteczkowej i łatwego do elektroprzędzenia) jest niezbędne w tym protokole w celu promowania tworzenia nanowłókien, ponieważ krótkie i silnie rozgałęzione oligomery POEGMA nie mogą same osiągnąć odpowiedniego stopnia splątania, aby wywołać elektroprzędzenie; zamiast tego wyniki elektronatryskiwania we wszystkich warunkach procesu są testowane pod kątem preparatów zawierających wyłącznie POEGMA (chociaż może to mieć również zastosowanie do wytwarzania degradowalnych cząstek żelu przy użyciu tej samej chemii). Minimalne stężenie PEO wynoszące 1 % wag. (1 masa cząsteczkowa MDa) jest wymagane do utrzymania w pełni nanowłóknistej morfologii. Należy pamiętać, że PEO można usunąć z włókien po prostej procedurze namaczania (woda dejonizowana, 24 godziny) bez naruszania integralności sieci nanowłóknistej; w ten sposób PEO działa bardziej jako przejściowa pomoc w elektroprzędzeniu niż niezbędny składnik końcowego produktu nanowłóknistego. Należy również zauważyć, że różne rodzaje kolektorów, w tym prosta folia aluminiowa (do tworzenia cienkowarstwowych hydrożeli, które mogą rozwarstwiać się z kolektora po namoczeniu), a także obracający się dysk aluminiowy (do tworzenia grubszych rusztowań) mogą być używane w połączeniu z tą samą techniką, pod warunkiem, że inne zmienne procesowe kontrolujące szybkość żelowania, szybkość elektroprzędzenia, a szybkość parowania wody podczas elektroprzędzenia pozostaje niezmieniona.

Co ciekawe, w zależności od metody zastosowanej do przygotowania różnych morfologii, zaobserwowano istotne różnice w czasach degradacji hydrożeli przygotowanych z tych samych prekursorów hydrożelu. Na przykład hydrożele nanowłókniste POEGMA rozkładają się wolniej niż hydrożele POEGMA luzem o tym samym składzie, pomimo ich znacznie większej powierzchni, a tym samym dostępu do wody w celu hydrolizy wiązań hydrazonowych. Odnosimy te różnice do nieodłącznych kontrastów między opisanymi protokołami pod względem geometrii mieszania polimerów prekursorowych, co może prowadzić do wewnętrznych jednorodności żelu i/lub morfologii, które są znacząco różne i/lub stężenia in situ prekursorów polimerów w tej samej skali czasowej co żelowanie, szczególnie istotne w elektroprzędzeniu ze względu na jednoczesne parowanie wody i sieciowanie obserwowane w tym procesie. Chociaż może to nieco skomplikować wybór polimerów prekursorowych, jeśli jeden polimer jest przeznaczony do stosowania w każdym protokole, może to również stanowić techniczną okazję w zakresie wytwarzania hydrożeli o jednym składzie chemicznym, ale bardzo różnych właściwościach fizycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, opisane metody zapewniają strategię wytwarzania degradowalnych (lub przynajmniej usuwalnych nerkowo) analogów polimerów termoczułych w wielu skalach długości (masowych, mikro i nano) i z wieloma rodzajami struktur wewnętrznych (cząstki lub włókna). Protokoły te rozwiązują kluczowe bariery utrudniające pomyślne zastosowanie konwencjonalnie przygotowanych syntetycznych materiałów termoczułych w dziedzinie biomedycyny: wstrzykiwalność i degradowalność. Kontynuujemy badania nad zastosowaniem takich materiałów zarówno w dostarczaniu leków, jak i w inżynierii tkankowej, począwszy od fizycznego celowania w nowotwory, transportu leków przez barierę krew-mózg, terapeutycznego dostarczania białek w tylnej części oka, kierunkowego wzrostu tkanek oraz termoodwracalnej adhezji i różnicowania komórek. między innymi aplikacjami.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie z Kanadyjskiej Rady ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC), programu NSERC CREATE-IDEM (Integrated Design of Extracellular Matrices), 20/20: NSERC Ophthalmic Biomaterials Research Network oraz programu Ontario Ministry of Research and Innovation Early Researcher Awards.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
2,2 - ester dimetylowy kwasu azobisisobutryicWako Chemicals101138
Metakrylan eteru metylowego (M(EO)2MA)Sigma Aldrich447927188,2 g/mol, n=2 jednostki powtórzeń tlenku etylenu
Oligo (glikol etylenowy) metakrylan eteru metylowego (OEGMA475)Sigma Aldrich447943475 g/mol, n=8-9 powtarzających się jednostek tlenku etylenu
Kwas akrylowy (AA), 99%Sigma Aldrich147230
Kwas tioglikolowy (TGA), 98%Sigma AldrichT3758
Dioksan, 99%Caledon Labs360481
Azot, klasa UHPAir LiquideAlphagaz1 765A-44
Dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH), 98%Alfa AesarA15119
N'-etylo-N-(3-dimetyloaminopropylo)-karmodiimid (EDC, x%)KarbosyntolitFD05800
Kwas solny (HCl), 37%Sigma Aldrich320331
Wodorotlenek sodu (NaOH), 97%Sigma Aldrich221465
Aminoacetyloaldehyd dimetyloacetal, 99%Sigma Aldrich121967
4-Hydroxy-TEMPO, 97%Sigma Aldrich176141
chlorek metakryloilo,97x%Sigma Aldrich523216
eter naftowy, 95%Sigma Aldrich32047
siarczan magnezu, 99,5%Sigma AldrichM7506
, >99,0%Sigma Aldrich443808
sól fizjologicznabuforowana fosforanemBioShopPBS405.11x, pH 7,3-7,5
N-izopropylokrylakamid, 99%J& K Scientific258717Rekrystalizowany z 60% heksanów/40% toluenu
Etanol, bezwodnyKomercyjne alcholeP016EAAN
Rozpiętość 80Sigma AldrichS6760
Pentan, klasa odczynnikaCaledonLabs 1/10/7800
Średnia wartość poli(tlenku etylenu) 600 000Sigma Aldrich182028
Materiały niezbędne do syntezy i produkcji hydrożeli
Parownik obrotowyHeidolphG3
Rurki do dializy (odcięcie masy cząsteczkowej 3500 Da)Spectrum Labs28170-166Vol/length = 6,4 ml / cm
Strzykawka dwucylindrowaMedmixL seriaL seria, 2,5 mL, stosunek objętości 1:1
Mikser statycznyMedmixserii LSeria L, 2,5 mL, stosunek objętości 1:1, długość 1,5"
Arkusz gumy silikonowej, grubość 1/16"McMaster-Carr9010K12, 30A Durometer (Super Soft)
Pompka strzykawkowaKD ScientificKDS Legato 200Infuse Only Podwójna pompa strzykawkowa
Zasilacz wysokonapięciowySpellman230-20R0 do 20 kV
Microfluidic Chip Fabrication
Silicon waferUniversity Wafer2080D = 76,2 mm; 380 &mikro; m grubość; Domieszkowane P; < 100> orientacja 
SU-8 100MicroChemY131273
SU-8 DeveloperMicroChemY020100
Niestandardowa 2,5-calowa maszyna do powlekaniaZbudowany we własnymN/A
KARL SUSSMJB3 UV400 (z lampą 276 W)
Rurka silikonowa Masterflex L/S 13Cole ParmerOF-96400-13Utwardzana
nadtlenkiemDow Corning Sygard 184 Baza z elastomeru silikonowego Kleje Ellsworth4019862
Dow Corning Sygard 184 Utwardzacz z elastomeru silikonowego Kleje Ellsworth4019862
środek do czyszczenia plazmowego o dużej mocy HarrickPDC-002-HP
strong>Instrumenty do charakteryzacji
Mach 1 tester mikromechanicznyBiomomentumLB007-PL
Kultura tkankowa Cellstar 12-dołkowa płytkaGreiner Bio-one665 180
Wkładka do hodowli komórkowej na płytkę 12-dołkowąCorning08-771-128 µ m wielkość porów
Mikroskopoptyczny Olympus BX51 Mikroskop optycznyBX51
Stolik mikroskopu z kontrolowaną temperaturąLinkam ScientificTHMS600
Chromatograf z przenikaniem żelu (GPC)Wody590 Pompa HPLCWody Kolumny styragelowe (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7,8 mm (ID); cząstki 5 mm), Detektor indeksu refrakcji Waters 410
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)Analizatorwielkości cząstek Brookhaven 90Plus
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)TEMSCANJEOL 1200EXNapięcie przyspieszające 100 kV
Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)TescanVega II LSUNapięcie przyspieszające 10 kV
MicrosquisherCellScale Biomaterials TestingMS-50M-01
eter tert-butylowy Ciężki olej parafinowy Caledon Labs 1326197 zakresie Nakładka do masek <

Bibliografia

  1. Heskins, M., Guillet, J. E. Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide). J. Macromol. Sci. A. 2 (8), 1441-1455 (1968).
  2. Lutz, J. -F., Akdemir, Ö, Hoth, A. Point by Point Comparison of Two Thermosensitive Polymers Exhibiting a Similar LCST: Is the Age of Poly(NIPAM) Over. J. Am. Chem. Soc. 128 (40), 13046-13047 (2006).
  3. Pelton, R. H., Chibante, P. Preparation of Aqueous Lattices with N-Isopropylacrylamide. Colloids Surf. 20 (3), 247-256 (1986).
  4. Palasis, M., Gehrke, S. H. Permeability of Responsive Poly(N-Isopropylacrylamide) Gel to Solutes. J. Controlled Release. 18 (1), 1-11 (1992).
  5. Kawaguchi, H., Fujimoto, K., Mizuhara, Y. Hydrogel Microspheres .3. Temperature-Dependent Adsorption of Proteins on Poly-N-Isopropylacrylamide Hydrogel Microspheres. Colloid Polym. Sci. 270 (1), 53-57 (1992).
  6. Okuyama, Y., Yoshida, R., Sakai, K., Okano, T., Sakurai, Y. Swelling Controlled Zero-Order and Sigmoidal Drug-Release from Thermoresponsive Poly(N-Isopropylacrylamide-Co-Butyl Methacrylate) Hydrogel. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 4 (5), 545-556 (1993).
  7. Snowden, M. J. The Use of Poly(N-Isopropylacrylamide) Lattices as Novel Release Systems. J. Chem. Soc. - Chem. Comm. (11), 803-804 (1992).
  8. Haraguchi, K., Takehisa, T., Ebato, M. Control of cell cultivation and cell sheet detachment on the surface of polymer/clay nanocomposite hydrogels. Biomacromolecules. 7 (11), 3267-3275 (2006).
  9. Lee, B., et al. Initiated chemical vapor deposition of thermoresponsive poly(N-vinylcaprolactam) thin films for cell sheet engineering. Acta Biomater. 9 (8), 7691-7698 (2013).
  10. Cole, M. A., Voelcker, N. H., Thissen, H., Griesser, H. J. Stimuli-responsive interfaces and systems for the control of protein-surface and cell-surface interactions. Biomaterials. 30 (9), 1827-1850 (2009).
  11. Feil, H., Bae, Y. H., Feijen, J., Kim, S. W. Molecular Separation by Thermosensitive Hydrogel Membranes. J. Membrane Sci. 64 (3), 283-294 (1991).
  12. Kim, J., Park, K. Smart hydrogels for bioseparation. Bioseparation. 7 (4-5), 177-184 (1998).
  13. Yamashita, K., Nishimura, T., Nango, M. Preparation of IPN-type stimuli responsive heavy-metal-ion adsorbent gel. Polym. Adv. Tech. 14 (3-5), 189-194 (2003).
  14. Ziolkowski, B., Czugala, M., Diamond, D. Integrating stimulus responsive materials and microfluidics: The key to next-generation chemical sensors. J. Intelligent Mater. Syst. Struct. 24 (18), 2221-2238 (2013).
  15. Zhang, Y., Kato, S., Anazawa, T. A flap-type hydrogel actuator with fast responses to temperature. Smart Mater. Struct. 16 (6), 2175-2182 (2007).
  16. Suzuki, D., Taniguchi, H., Yoshida, R. Autonomously Oscillating Viscosity in Microgel Dispersions. J. Am. Chem. Soc. 131 (34), 12058-12059 (2009).
  17. Schild, H. G. Poly(N-isopropylacrylamide): Experiment, Theory and Application. Prog. Polym. Sci. 17, 163-249 (1992).
  18. Oh, J. K., Min, K., Matyjaszewski, K. Preparation of poly (oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate) by homogeneous aqueous AGET ATRP. Macromolecules. 39 (9), 3161-3167 (2006).
  19. Vihola, H., Laukkanen, A., Tenhu, H., Hirvonen, J. Drug Release Characteristics of Physically Cross-Linked Thermosensitive Poly(N-vinylcaprolactam) Hydrogel Particles. J. Pharm. Sci. 97 (11), 4783-4793 (2008).
  20. Zhang, L. F., Liang, Y., Meng, L. Z. Thermo-sensitive amphiphilic poly(N-vinylcaprolactam) copolymers: synthesis and solution properties. Polym. Adv. Tech. 21 (10), 720-725 (2010).
  21. Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable and tunable poly(ethylene glycol) analogue hydrogels based on poly(oligoethylene glycol methacrylate). Chem. Comm. 50 (25), 3306-3309 (2014).
  22. Lutz, J. -F. Polymerization of oligo (ethylene glycol)(meth) acrylates: toward new generations of smart biocompatible materials. J. Polym. Sci. A. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  23. Lutz, J. -F., Hoth, A. Preparation of Ideal PEG Analogues with a Tunable Thermosensitivity by Controlled Radical Copolymerization of 2-(2-Methoxyethoxy)ethyl Methacrylate and Oligo(ethylene glycol) Methacrylate. Macromolecules. 39 (2), 893-896 (2006).
  24. Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
  25. Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Degradable Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide) Hydrogels. ACS Macro Lett. 1 (3), 409-413 (2012).
  26. Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Mixed Natural-Synthetic Polymer Hydrogels with Modular Properties. Biomacromolecules. 13 (2), 369-378 (2012).
  27. Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable poly(oligoethylene glycol methacrylate)-based hydrogels with tunable phase transition behaviours: Physicochemical and biological responses. Acta Biomater. 10 (10), 4143-4155 (2014).
  28. Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Temperature-Induced Assembly of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, and Degradable Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels Based on Oligomeric Precursors. Langmuir. 31, 5767-5778 (2015).
  29. Bakaic, E., Smeets, N. M. B., Dorrington, H., Hoare, T. "Off-the-shelf" thermoresponsive hydrogel design: tuning hydrogel properties by mixing precursor polymers with different lower-critical solution temperatures. RSC Adv. 5 (42), 33364-33376 (2015).
  30. Bulpitt, P., Aeschlimann, D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: Preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 47 (2), 152-169 (1999).
  31. Kesselman, L. R. B., Shinwary, S., Selvaganapathy, P. R., Hoare, T. Synthesis of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, Degradable "Smart" Microgels Using Microfluidics. Small. 8 (7), 1092-1098 (2012).
  32. Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Microfluidic production of degradable thermoresponsive microgels based on poly(N-isopropylacrylamide). Soft Matter. , (2016).
  33. Xu, F., Sheardown, H., Hoare, T. Reactive Electrospinning of Degradable Poly(oligoethylene glycol methacrylate)-Based Nanofibrous Hydrogel Networks. Chem. Comm. 52 (7), 1451-1454 (2016).
  34. Troll, K., et al. The collapse transition of poly(styrene-b-(N-isopropyl acrylamide)) diblock copolymers in aqueous solution and in thin films. Colloid Polym. Sci. 286 (8), 1079-1092 (2008).
  35. Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
  36. Kelly, T. A., Felder, M. S., Ollar, R. A. Inducing Apoptosis in a Mammalian Cell by Contacting with Paraffin or Agar. US Patent. , 6,274,377 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Platforma mikrofluidycznametoda samozgromadzeniastrategia elektroprz dzeniasieciowanie hydrazonowewytwarzanie hydro eli masowychgenerowanie mikrocz steksynteza nanogeliprodukcja nanow kien

Powiązane artykuły