Artykuł metodologiczny

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

DOI:

10.3791/54527

⸱

23 października 2016

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie są często narażone na zmiany środowiskowe, takie jak zmiany pH, temperatury, statusu redoks, ekspozycji na światło lub siły mechanicznej. Wiele z tych schorzeń powoduje rozwój białek w komórce i ma szkodliwy wpływ na przetrwanie organizmu. Wykazano, że grupa niepowiązanych, specyficznych dla stresu molekularnych białek opiekuńczych odgrywa istotną rolę w przetrwaniu tych warunków stresowych. Podczas gdy białka te są w pełni sfałdowane i nieaktywne opiekuńczo przed stresem, szybko się rozwijają i stają się aktywne opiekuńczo w określonych warunkach stresu. Po aktywacji, te warunkowo nieuporządkowane białka opiekuńcze wiążą się z dużą liczbą różnych białek podatnych na agregację, zapobiegają ich agregacji i bezpośrednio lub pośrednio ułatwiają ponowne fałdowanie białek po powrocie do warunków niestresowych. Podstawowym podejściem do uzyskania bardziej szczegółowego zrozumienia mechanizmu ich aktywacji i rozpoznawania przez klienta jest oczyszczanie, a następnie charakteryzacja tych białek za pomocą testów opiekuńczych in vitro. Kontrolne testy stresu in vivo są absolutnie niezbędne do niezależnego potwierdzenia uzyskanych wyników in vitro.

Ten protokół opisuje metody in vitro i in vivo do charakteryzowania aktywności opiekuńczej E. coli HdeB, białka opiekuńczego aktywowanego kwasem. Pomiary rozpraszania światła wykorzystano jako wygodny odczyt zdolności HdeB do zapobiegania indukowanej kwasem agregacji uznanego modelowego białka klienckiego, MDH, in vitro. Analityczne eksperymenty ultrawirowania zostały zastosowane w celu ujawnienia złożonego tworzenia się między HdeB a jego białkiem klienckim LDH, aby rzucić światło na los białek klienta po ich powrocie do warunków bezstresowych. Przeprowadzono testy aktywności enzymatycznej białek klienta w celu monitorowania wpływu HdeB na inaktywację i reaktywację klienta wywołaną pH. Wreszcie, badania dotyczące przeżycia wykorzystano do monitorowania wpływu funkcji opiekuńczej HdeB in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powszechnym naturalnym środowiskiem, w którym patogeny mikrobiologiczne doświadczają warunków rozwoju białek wywołanych kwasem, jest żołądek ssaków (zakres pH 1-4), którego kwaśne pH służy jako skuteczna bariera przed patogenami przenoszonymi przez żywność 1. Rozwijanie i agregacja białek, która jest spowodowana protonacją łańcucha bocznego aminokwasów, wpływa na procesy biologiczne, uszkadza struktury komórkowe i ostatecznie powoduje śmierć komórki 1,2. Ponieważ pH peryplazmy bakteryjnej niemal natychmiast równoważy się z pH środowiska dzięki swobodnej dyfuzji protonów przez porowatą błonę zewnętrzną, białka peryplazmatyczne i błony wewnętrznej bakterii Gram-ujemnych są najbardziej wrażliwymi składnikami komórkowymi w warunkach stresu kwasowego 3. Aby chronić swój proteom peryplazmatyczny przed szybkim uszkodzeniem za pośrednictwem kwasów, bakterie Gram-ujemne wykorzystują aktywowane kwasem peryplazmatyczne białka opiekuńcze HdeA i HdeB. HdeA jest warunkowo nieuporządkowanym przyzwoitkiem 4,5: Przy neutralnym pH HdeA występuje jako pofałdowany, nieaktywny dimer opiekuńczy. Po przesunięciu pH poniżej pH 3 funkcja opiekuńcza HdeA jest szybko aktywowana 6,7. Aktywacja HdeA wymaga głębokich zmian strukturalnych, w tym jego dysocjacji na monomery i częściowego rozwinięcia monomerów 6-8. Po aktywacji HdeA wiąże się z białkami, które rozwijają się w kwaśnych warunkach. Skutecznie zapobiega ich agregacji zarówno podczas inkubacji przy niskim pH, jak i przy neutralizacji pH. Po powrocie do pH 7,0 HdeA ułatwia ponowne fałdowanie białek klienta w sposób niezależny od ATP i przekształca się z powrotem w swoją dimeryczną, nieaktywną konformację opiekuńczo-opiekuńczą 9. Podobnie, homologiczny chaperon HdeB jest również nieaktywny opiekuńczo przy pH 7,0. Jednak w przeciwieństwie do HdeA, aktywność opiekuńcza HdeB osiąga pozorne maksimum przy pH 4,0, w warunkach, w których HdeB jest nadal w dużej mierze pofałdowany i dimeryczny 10. Co więcej, dalsze obniżanie pH powoduje inaktywację HdeB. Wyniki te sugerują, że pomimo ich rozległej homologii, HdeA i HdeB różnią się sposobem aktywacji funkcjonalnej, co pozwala im objąć szeroki zakres pH dzięki ochronnej funkcji opiekuńczej. Innym chaperonem, który jest zaangażowany w kwasoodporność E. coli, jest cytoplazmatyczny Hsp31, który wydaje się stabilizować niesfałdowane białka klienta do czasu przywrócenia neutralnych warunków. Dokładny sposób działania Hsp31 pozostał jednak enigmatyczny 12. Biorąc pod uwagę, że inne bakterie enteropatogenne, takie jak Salmonella, nie mają operonu hdeAB, jest bardzo prawdopodobne, że mogą istnieć inne, jeszcze niezidentyfikowane peryplazmatyczne białka opiekuńcze, które są zaangażowane w kwasoodporność tych bakterii 11.

Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na monitorowanie zależnej od pH aktywności opiekuńczej HdeB in vitro i in vivo 10 i mogą być stosowane do badania innych białek opiekuńczych, takich jak Hsp31. Alternatywnie, złożona sieć czynników transkrypcyjnych, które kontrolują ekspresję hdeAB, może być potencjalnie zbadana za pomocą testu stresu in vivo. Aby scharakteryzować funkcję opiekuńczą białek in vivo, można zastosować różne konfiguracje eksperymentalne. Jedną ze ścieżek jest zastosowanie warunków stresu związanego z rozwijaniem białek i fenotypowe scharakteryzowanie zmutowanych szczepów, które albo wykazują nadekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, albo zawierają delecję genu. Badania proteomiczne można przeprowadzić w celu określenia, które białka nie agregują się już w warunkach stresu, gdy obecny jest opiekun, lub można określić wpływ białka opiekuńczego na określony enzym w warunkach stresu za pomocą testów enzymatycznych 14-16. W tym badaniu zdecydowaliśmy się na nadekspresję HdeB w szczepie delecyjnym rpoH, który nie ma czynnika sigma szoku cieplnego 32. RpoH kontroluje ekspresję wszystkich głównych białek opiekuńczych E. coli, a jego delecja zwiększa wrażliwość na warunki stresu środowiskowego, które powodują rozwijanie się białek 15. Aktywność opiekuńczą HdeB in vivo określono poprzez monitorowanie jego zdolności do tłumienia wrażliwości pH szczepu ΔrpoH. Podsumowując, przedstawione tutaj protokoły zapewniają szybkie i proste podejście do scharakteryzowania aktywności białka opiekuńczego aktywowanego kwasem in vitro, a także w kontekście in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja i oczyszczanie peryplazmatycznego HdeB

UWAGA: HdeB ulegał ekspresji w komórkach E. coli zawierających plazmid pTrc-hdeB 10 i został oczyszczony z peryplazmy po lizie polimyksyny.

  1. Przygotować nocną hodowlę komórek E. coli zawierających plazmid pTrc-hdeB 10 w 30 ml LB zawierającym 200 μg/ml ampicyliny (LBAmp). Zaszczepić cztery 1 l kultur LBAmp i hodować je w temperaturze 37 °C i 200 obr./min, aż do osiągnięcia średnicy zewnętrznej 600 nm 0,7. Następnie dodać 300 μM IPTG, aby wywołać ekspresję HdeB i obniżyć temperaturę wzrostu do 30 °C.
  2. Po 5 godzinach ekspresji białka w temperaturze 30 °C, zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przepłukać osad komórkowy 100 ml buforu A (50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) i ponownie odwirować komórki przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 ml buforze A, zawierającym 1 mg/ml siarczanu polimyksyny. W celu skutecznego rozerwania błony zewnętrznej należy delikatnie mieszać zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  5. W celu usunięcia frakcji cytoplazmatycznej i resztek komórkowych należy odwirowywać zawiesinę przez 20 minut w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C. W ten sposób powstaje ~60 ml supernatantu zawierającego rozpuszczalny HdeB.
  6. Supernatant zawierający ekstrakt peryplazmatyczny należy dializować przez noc w stosunku do 150-krotnej objętości buforu B (20 mM Tris/HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) za pomocą membrany dializacyjnej z odcięciem 6 kDa MW. Zagęścić białka do 15 ml za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o masie cząsteczkowej odcięcia 3 kDa. Przefiltrować roztwór białkowy za pomocą filtra porowego 0,2 μm.
  7. Umieścić białko na kolumnie chromatografii anionowymiennej (objętość kolumny 5 ml), która została zrównoważona z buforem B o objętości 5 objętości kolumny o natężeniu przepływu 2,5 ml/min. Po załadowaniu białka do kolumny należy przemywać ją buforem B przez 10 minut przy natężeniu przepływu 2,5 ml/min. Elute HdeB z gradientem liniowym od 0 do 0,5 M NaCl w buforze B przez okres 50 minut z natężeniem przepływu 2,5 ml/min 6.
  8. Zidentyfikuj frakcje zawierające HdeB za pomocą 15% SDS-PAGE. Wymieszać 20 μl próbki z 5 μl 5x zredukowanego bufora ładującego SDS. Załadować 10 μl na żel i uruchomić w buforze Tris-glicyna (14,4 g/L glicyny, 2,9 g/L Tris, 1 g/L dodecylosiarczanu sodu, pH 8,3). Uruchom żel pod napięciem 150 V, aż prążek bromofenolu przesunie się blisko dna żelu (~45 min).
  9. Zebrać wszystkie frakcje zawierające HdeB, dializować w temperaturze 4 °C przez noc w stosunku do 4 l bufora do przechowywania HdeB (50 mM Tris/HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) i zagęścić białko do około 300 μM za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o masie cząsteczkowej odcięcia 3 kDa. Określić stężenie HdeB przy 280 nm, korzystając ze współczynnika ekstynkcji ε280nm = 15,595 M-1 cm-1. Przygotować 100 μl podwielokrotności i błyskawicznie zamrozić podwielokrotności w ciekłym azocie.
    UWAGA: HdeB można przechowywać w temperaturze -70 °C przez co najmniej 6 miesięcy.

2. Test aktywności białka opiekuńczego przy użyciu termicznie rozwijającej się dehydrogenazy jabłczanowej (MDH)

UWAGA: Wpływ oczyszczonego HdeB na agregację rozwijającej się termicznie dehydrogenazy mitochondrialnej jabłczanu świń (MDH) przy różnych wartościach pH monitorowano w sposób opisany poniżej. Wszystkie podane stężenia białek odnoszą się do stężenia monomeru.

  1. Aby przygotować MDH, należy dializować MDH w temperaturze 4 °C przez noc w stosunku do 4 l buforu C (50 mM fosforanu potasu, 50 mM NaCl, pH 7,5) i zagęścić białko do około 100 μM za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o granicy masy cząsteczkowej 30 kDa.
    UWAGA: Wymagana jest ostrożna dializa MDH, ponieważ MDH jest dostarczany w postaci roztworu siarczanu amonu.
  2. W celu usunięcia agregatów należy odwirować białko przez 20 minut w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Oznaczyć stężenie MDH przez absorbancję przy 280 nm (ε280 nm = 7,950 M-1 cm-1). Przygotować 50 μl podwielokrotności MDH i błyskawicznie zamrozić podwielokrotności do przechowywania.
  3. Umieścić kuwetę kwarcową o pojemności 1 ml w spektrofotometrze fluorescencyjnym wyposażonym w uchwyty na próbki i mieszadło o kontrolowanej temperaturze. Ustawić λex/em na 350 nm.
  4. Dodać odpowiednie objętości wstępnie podgrzanego (43 °C) buforu D (150 mM fosforanu potasu, 150 mM NaCl) o żądanych wartościach pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 i pH 5,0) do kuwety i ustawić temperaturę w uchwycie kuwety na 43 °C. Całkowita objętość wynosi 1 000 μl.
  5. Dodać 12,5 μM HdeB (lub alternatywnie taką samą objętość bufora pamięci HdeB dla kontroli buforu) do buforu, a następnie dodać 0,5 μM MDH. Rozpocznij monitorowanie rozpraszania światła. Inkubować reakcję przez 360 sekund, aby umożliwić wystarczające rozwinięcie MDH.
  6. Podnieś pH do 7, dodając 0,16-0,34 objętości 2 M niebuforowanego K2HPO4 i kontynuuj rejestrowanie rozpraszania światła przez kolejne 440 sekund.
  7. Ustaw zakres agregacji MDH, który jest rejestrowany pod nieobecność białka opiekuńczego w określonym punkcie czasowym po neutralizacji (tutaj po 500 sekundach, gdy zaobserwowano maksymalne rozproszenie światła MDH) na 100%. Normalizuj aktywność HdeB do sygnału rozpraszania światła MDH przy braku HdeB przy każdej wskazanej wartości pH.

3. Wykrywanie tworzenia się kompleksu HdeB-LDH za pomocą analitycznego ultrawirowania (aUC)

UWAGA: Eksperymenty z prędkością sedymentacji HdeB samodzielnie lub w kompleksie z termicznie rozwijającą się dehydrogenazą mleczanową (LDH) przeprowadzono przy użyciu ultrawirówki analitycznej.

  1. Aby przygotować LDH, należy dializować LDH w temperaturze 4 °C przez noc w 4 l buforu C (50 mM fosforanu potasu, 50 mM NaCl, pH 7,5) i zagęścić białko do około 200 μM za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących o granicy masy cząsteczkowej 30 kDa.
    UWAGA: Wymagana jest ostrożna dializa LDH, ponieważ LDH jest dostarczany w postaci roztworu siarczanu amonu.
  2. W celu usunięcia agregatów należy odwirowywać LDH przez 20 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Oznaczyć stężenie LDH przez absorbancję przy 280nm (ε 280 nm = 43,680 M-1 cm-1). Przygotować 50 μl podwielokrotności LDH i błyskawicznie zamrozić podwielokrotności do przechowywania.
  3. Inkubować 3 μM LDH w obecności i pod nieobecność 30 μM HdeB w buforze D (odpowiednio pH 4 i 7) przez 15 minut w temperaturze 41 °C.
    UWAGA: Inkubacja LDH w wyższych temperaturach powoduje jego całkowitą agregację i nie można zaobserwować efektu opiekuńczego HdeB.
  4. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Następnie załaduj próbki do komórek zawierających standardowe 2-kanałowe elementy centralne w kształcie sektora o długości ścieżki 1,2 cm. Załadować komórki do ultrawirówki i wyrównać temperaturę 22 °C przez co najmniej 1 godzinę przed sedymentacją.
  5. Wirować próbki w temperaturze 22 °C i 167 000 x g w odpowiednim wirniku przez 12 godzin i monitorować sedymentację białka w sposób ciągły przy długości fali 280 nm. Jak wykazano wcześniej, stosunek sygnału do szumu poprawia się, gdy mierzy się natężenie światła przepuszczanego w każdym kanale, a nie absorbancję. Poprawia to również jakość późniejszego dopasowywania danych.
  6. Przeprowadź analizę danych za pomocą SEDFIT (wersja 15.01b, grudzień 2015 r.), przy użyciu modelu ciągłej dystrybucji c(s) 17. Samouczek opisujący, jak korzystać z SEDFIT, można znaleźć w odnośniku 18.
    1. Ustaw poziom ufności dla regularyzacji ME (maksymalnej entropii) na 0,7.
  7. Oblicz gęstość buforu oraz lepkość za pomocą SEDNTERP 19. Aby oszacować ilość zagregowanego białka klienta, porównaj całki osadzonego LDH o pH 4 z pH 7 jako odniesienie.
    UWAGA: Integrację wykresów rozkładu sedymentacji można przeprowadzić bezpośrednio w SEDFIT. Alternatywne oprogramowanie do analizy danych dotyczących prędkości sedymentacji można znaleźć w niedawnym przeglądzie 20.

4. Monitorowanie inaktywacji i reaktywacji MDH w obecności HdeB

UWAGA: Wpływ oczyszczonego HdeB na ponowne fałdowanie MDH o nieuregulowanym pH określono poprzez monitorowanie aktywności MDH po neutralizacji.

  1. Inkubować 1 μM MDH w buforze D przy pożądanych wartościach pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 i pH 5,0) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy braku lub w obecności 25 μM HdeB. Następnie zmień temperaturę na 20°C na 10 min.
    UWAGA: Nie zaobserwowano ponownego fałdowania MDH nawet w obecności HdeB, gdy MDH inkubowano w temperaturach wyższych niż 37 °C.
  2. Aby zainicjować ponowne fałdowanie MDH zdenaturowanego kwasem, należy zneutralizować próbki do pH 7 przez dodanie 0,13-0,42 objętości 0,5 M fosforanu sodu o pH 8,0.
  3. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 20 °C oznaczyć aktywność MDH, monitorując spadek NADH przy 340 nm 9,
    UWAGA: MDH katalizuje zależną od NADH redukcję szczawiooctanu do L-jabłczanu.
    1. Zmieszać 50 μl reakcji inkubacji z 950 μl buforu do oznaczania (50 mM fosforanu sodu, pH 8,0, 1 mM szczawiooctanu i 150 μM NADH).
      UWAGA: Końcowe stężenie MDH w buforze testowym powinno wynosić 44 nM.
    2. Monitorować zmianę absorbancji za pomocą spektrofotometru wyposażonego w blok regulacji temperatury Peltiera ustawiony na 20 °C.
    3. Należy podać aktywność MDH w stosunku do natywnego MDH 44 nM, który był utrzymywany na poziomie pH 7,0.

5. Wpływ nadekspresji HdeB na przeżycie E. coli w warunkach stresu kwasowego

UWAGA: Genomowe DNA E. coli MG1655 wyizolowano przy użyciu opublikowanego protokołu 21.

  1. Amplifikuj hdeB z E. coli, MG1655 metodą PCR, używając starterów, hdeB-BamH,I-rev, GGT, GGT, GGA, TCC, TTA, ATT, CGG, CAA, GTC, ATT i hdeB-EcoR, I-fw, GGT, GCC, GAA, TTC, AGG, CGC, AAT, TCT, TC, C, C.
  2. Ustawić reakcję PCR w 50 μl w następujący sposób: 10 μl 5x bufor polimerazy, 200 μM dNTPs, 0,5 μM starter JUD2, 0,5 μM starter JUD5, 150 ng genomowe DNA MG1655, 0,5 μl polimerazy DNA, dodać ddH2O do 50 μl.
  3. Wykonaj amplifikację hdeB w następujący sposób: Krok 1: 5 minut w 95 °C, 1 cykl; Krok 2: 30 sekund w 95 °C, 30 sekund w 55 °C, 30 sekund w 72 °C, 40 cykli; Krok 3: 10 min w temperaturze 72 °C.
  4. Sklonuj powstały fragment PCR do miejsc EcoRI i BamHI plazmidu pBAD18 przy użyciu standardowych metod klonowania miejsca ograniczenia. Oczyść plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Sprawdź otrzymany plazmid, sekwencjonując 10.
  5. Przekształć plazmid eksprymujący HdeB lub pustą kontrolę wektora pBAD18 w szczep BB7224 (ΔrpoH) (genotyp: F-, λ-, e14-, [araD139]B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(SmR) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(TcS) suhX401 deoC1 araD+ rpoH::kan+; 16) przy użyciu kompetentnych chemicznie ogniw.
    UWAGA: Ta odmiana jest wrażliwa na temperaturę.
  6. Po 45 sekundach szoku termicznego w temperaturze 42 °C, a przed posiewem, inkubować komórki w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. Wykonać pojedyncze smugi kolonii dodatnich klonów i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. Przygotować hodowlę przez noc w 50 ml LBAmp i hodować komórki przy 200 obr./min i 30 °C.
  7. Rozcieńczyć kultury przez noc 40-krotnie w 25 ml LBAmp i hodować bakterie w obecności 0,5% arabinozy (Ara) w temperaturze 30 °C i 200 obr./min do średnicy zewnętrznej 600 nm = 1,0 w celu indukcji ekspresji białka HdeB.
  8. Do eksperymentów ze zmianą pH użyj LBAmp + Ara, aby rozcieńczyć komórki do średnicy zewnętrznej 600 nm 0,5 i dostosować do odpowiednich wartości pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0 i pH 4,0), dodając odpowiednie objętości 5 M HCl.
  9. Po przekroczeniu wskazanych punktów czasowych (pH 2,1 min; pH 3,5 min; pH 4,30 min) należy zneutralizować kultury przez dodanie odpowiednich objętości 5 M NaOH.
  10. Monitorować wzrost zneutralizowanych kultur w płynnych kulturach przez 12 godzin w temperaturze 30 °C za pomocą pomiarów średnicy zewnętrznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HdeA i HdeB są homologicznymi białkami E. coli, znanymi z ochrony białek periplazmatycznych przed warunkami stresu kwasowego 10. Nasze badania wykazały, że podobnie jak HdeA, HdeB również pełni funkcję aktywowanego kwasem chaperonu molekularnego. Jednak w przeciwieństwie do HdeA, HdeB działa przy pH, które wciąż może być bakteriobójcze, lecz jest znacząco wyższe niż pH optymalne dla HdeA 6,9,10,22. Aby zbadać pH optymalne dla aktywności chaperonowej HdeB

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu zbadania mechanizmu aktywacji i funkcji opiekuńczej HdeB, duże ilości HdeB muszą zostać wyrażone i oczyszczone. Dostępnych jest wiele systemów wektorów ekspresyjnych do produkcji wysokich poziomów białka docelowego, w tym wektory pTrc lub pBAD, które zostały wykorzystane w tym badaniu. Promotory są łatwo dostępne dla polimerazy RNA E. coli , a tym samym umożliwiają silnie podwyższoną ekspresję HdeB w dowolnym szczepie E. coli . Ten aspekt jest szczególnie istotny w przypadku badania nadekspre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Claudii Cremers za jej pomocne porady dotyczące testów opiekuńczych. Ken Wan jest ceniony za swoją pomoc techniczną w oczyszczaniu HdeB. Praca ta była wspierana przez Howard Hughes Medical Institute (do J.C.A.B.) oraz National Institutes of Health grant RO1 GM102829 dla J.C.A.B. i U.J.-U. D. jest stypendystą Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) w ramach stażu podoktorskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NEB10-beta E. komórki coliNew England BiolabsC3019I
AmpicillinGold BiotechnologyA-301-3
LB Mieszanka bulionowa, LennoxLAB Express3003
IPTGGold BiotechnologyI2481C50
Chlorek soduFisher ScientificS271-10
TrisAmresco0826-5kg
EDTAFisher ScientificBP120-500
Siarczan polimyksyny B ICN Biomedicals Inc.
0,2 &mikro; m sterylny filtr strzykawkowyCorning431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)GE Healthcare Life Sciences17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%Bio-Rad4561046
dehydrogenaza jabłczanowa (MDH)Roche10127914001
Fosforan potasu (monozasadowy)Fisher ScientificBP362-500
Potas fosforan (dwuzasadowy)Fisher ScientificBP363-1
F-4500 spektrofotometr fluorescencyjnyHitachiFL25
SzczawiooctanSigmaO4126-5G
NADHSigma N8129-100MG
Fosforan sodu jednozasadowySigma S9390-2.5KG
Fosforan sodu dwuzasadowySigma S397-500
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)Roche10127230001
Ultrawirówka analityczna Beckman Proteome Lab XL-IBeckman Coulter392764
Element centralny, 12 mm, Epon WęglowyBeckman Coulter306493
AN-50 Ti Rotor, analityczny, 8-miejscowyzestaw Beckman Coulter363782
Wizard Plus MiniprepPromegaA1470używany do oczyszczania plazmidu (Protokół 5.1)
L-arabinozaGold BiotechnologyA-300-500
GlycineDOT Scientific IncDSG36050-1000
Kuweta fluorescencyjnaHellma Analytics119004F-10-40
OligonukleotydyInvitrogen
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530S
dNTP zestawInvitrogen10297018
Kwas solnyFisher ScientificA144-212
Wodorotlenek soduFisher ScientificBP359-500
Amicon Ultra 15 mlUFC900324miliporowej
Avanti J-26XPIBeckman Coulter393127
spektrofotometr Varian Cary 50Agilent Tech
Spectra/Por 1 MWCO: 6 kDaSpectrum Laboratories132650
Ultra Filtry odśrodkowe Amicon 30KMilliporeUFC803024
SDSFisher Scientificbp166-500
Veriti 96-dołkowy termocyklerThermo Fisher 4375786
100565 Wirówka do 3K NMWL Membrana dializowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kaperon HdeBtest rozpraszania wiat akaperon in vitroprze ywalno in vivokaperon aktywowany kwasemagregacja bia ekdehydrogenaza malanowatesty prze ywalno ci

Powiązane artykuły