Artykuł metodologiczny

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54535

⸱

1 października 2016

 ,  ,  , 
1Division of Analytical Biosciences, Leiden Academic Center for Drug Research, Leiden University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Streszczenie

W metabolomice, szeroki zakres technik analitycznych jest używany do globalnego profilowania (endogennych) metabolitów w złożonych próbkach. W artykule przedstawiono protokół analizy metabolitów anionowych i kationowych w próbkach biologicznych metodą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas (CE-MS). CE doskonale nadaje się do analizy wysoce polarnych i naładowanych metabolitów, ponieważ związki są rozdzielane na podstawie ich stosunku ładunku do wielkości. Niedawno opracowana konstrukcja interfejsu bez osłony, tj. porowaty interfejs końcówki, służy do sprzężenia CE z jonizacją elektronatryskową (ESI) MS. Takie podejście do interfejsów pozwala na efektywne wykorzystanie właściwości CE o z natury niskiego przepływu w połączeniu ze stwardnieniem rozsianym, co skutkuje limitami wykrywalności nanomolowej dla szerokiego zakresu klas metabolitów polarnych. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na zastosowaniu kapilary z gołej stopionej krzemionki z porowatą końcówką emitera w warunkach separacji o niskim pH do analizy szerokiego zakresu klas metabolitów w próbkach biologicznych. Wykazano, że ta sama metoda CE-MS bez osłonki może być stosowana do profilowania metabolitów kationowych, w tym aminokwasów, nukleozydów i małych peptydów lub metabolitów anionowych, w tym fosforanów cukrowych, nukleotydów i kwasów organicznych, jedynie poprzez przełączanie polaryzacji napięcia wykrywania i separacji MS. Wysoce bogate w informacje profile metaboliczne w różnych próbkach biologicznych, takich jak mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy i ekstrakty z linii komórkowej glejaka, można uzyskać za pomocą tego protokołu w czasie krótszym niż 1 godzina analizy CE-MS.

Wprowadzenie

We współczesnej metabolomice, zaawansowane techniki analitycznego rozdzielania są używane do analizy szerokiego zakresu klas metabolitów w celu uzyskania reprezentatywnego odczytu stanu fizjologicznego organizmu1. Ostatecznym celem badania metabolomicznego jest uzyskanie odpowiedzi na dane pytanie biologiczne/kliniczne. Obecnie Baza danych metabolomu człowieka składa się z ponad 40 000 wpisów metabolitów reprezentujących zarówno związki endogenne, jak i egzogenne (te ostatnie pochodzące ze składników odżywczych, mikrobioty, leków i innych źródeł)2. Biorąc pod uwagę ogromną różnorodność właściwości fizykochemicznych i zakresu stężeń tych metabolitów, należy stosować w połączeniu wiele technik analitycznych o różnych mechanizmach separacji w celu profilowania jak największej liczby metabolitów w danej próbce biologicznej. Na przykład w zespole Psychogios i wsp. zastosowano kombinację pięciu analitycznych technik separacji do profilowania metabolicznego ludzkiej surowicy, co doprowadziło do wykrycia ponad 4000 chemicznie zróżnicowanych metabolitów3.

W tym artykule zostanie zwrócona uwaga na ostatnio opracowane strategie CE-MS do profilowania metabolicznego próbek biologicznych4,5. W CE, a dokładniej w elektroforezie w strefie kapilarnej (CZE; zwykle określanej jako CE), związki są rozdzielane na podstawie ich stosunku ładunku do wielkości, a zatem ta technika analityczna jest wysoce odpowiednia do analizy metabolitów polarnych i naładowanych. Mechanizm rozdzielania CE zasadniczo różni się od technik opartych na chromatografii, zapewniając tym samym uzupełniający obraz składu metabolicznego próbek biologicznych6-8. Soga i współpracownicy jako pierwsi wykazali użyteczność CE-MS dla globalnego profilowania metabolitów w próbkach biologicznych9,10. Do tej pory wykonalność i przydatność CE-MS dla metabolomiki była szeroko wykazywana11-15. CE jest na ogół sprzężony z MS za pomocą techniki flizelinyosłona-ciecz 16,17; Jednak ze względu na rozcieńczenie ścieków kapilarnych przez ciecz osłonową, czułość wykrywania jest z natury zagrożona.

Ostatnio wykazano, że użycie interfejsu bez osłonki znacznie poprawiło zasięg wykrywania metabolitów obecnych w różnych próbkach biologicznych w porównaniu do CE-MS wykorzystującego klasyczną granicę faz osłona-ciecz5,18,19. Na przykład około 900 cech molekularnych wykryto w ludzkim moczu za pomocą CE-MS bez osłonki, podczas gdy około 300 cech molekularnych zaobserwowano za pomocą CE-MS5 z cieczą osłonkową. Zastosowany interfejs bez osłony został oparty na porowatym emiterze końcówki, który został wynaleziony przez Moini20, co pozwoliło na efektywne wykorzystanie właściwości CE o nieodłącznie niskim przepływie w połączeniu z nano-ESI-MS.

W celu stymulowania stosowania bezosłonkowego CE-MS w dziedzinie metabolomiki, przedstawiono protokół opisujący, jak to podejście może być wykorzystane do analizy wysoce polarnych metabolitów w próbkach biologicznych, jak to jest na przykładzie analizy ekstraktów z linii komórkowej glejaka. Wykazano, że bezosłonowa metoda CE-MS do profilowania metabolitów kationowych może być również stosowana do profilowania metabolitów anionowych przy użyciu dokładnie tych samych warunków kapilarnych i separacji, skracając w ten sposób czas analizy i zapewniając jedną platformę analityczną do globalnego profilowania naładowanych metabolitów. W protokole opisano również strategię skutecznego wyrównania bezosłonowego emitera porowatej końcówki z instrumentem MS.

Protokół

UWAGA: Opisany tutaj protokół użycia CE-MS bez osłonki do badań profilowania metabolicznego jest przeznaczony wyłącznie do użytku laboratoryjnego. Przedstawione poniżej procedury opierają się na niedawno opublikowanych pracach4,5. Dalsze szczegóły eksperymentalne można znaleźć w tych artykułach. Przed użyciem tego protokołu należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Podczas przeprowadzania eksperymentów opisanych w niniejszym protokole należy stosować wszystkie odpowiednie laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, w tym okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice.

1. Przygotowanie roztworów odczynników i próbek

  1. Przygotowanie elektrolitu tła (BGE)
    1. Codziennie przygotowywać nowy roztwór BGE (10% (v/v) kwas octowy, pH 2,2).
    2. Dodać 9,0 ml wody do szklanej fiolki o pojemności 10 ml i dodać 1,0 ml kwasu octowego do wody pod wyciągiem. Dokładnie wymieszaj roztwór za pomocą wiru.
  2. Przygotowanie mieszaniny wzorcowej metabolitów
    1. Rozpuścić 50 μl mieszaniny wzorca kationowego o stężeniu 50 μM, zawierającej 60 metabolitów kationowych, w 50 μl wody i dokładnie wymieszać roztwór. Przechowywać w temperaturze -80 °C, gdy nie jest używany.
    2. Rozpuścić 50 μl mieszaniny wzorca anionowego o wielkości 50 μM zawierającej 30 metabolitów anionowych w 50 μl wody i dokładnie wymieszać roztwór. Przechowywać ten roztwór w porcjach, aby zapobiec cyklom zamrażania/rozmrażania tej samej mieszaniny wzorcowej, w temperaturze -80 °C, gdy nie jest używany.
      UWAGA: Mieszaniny wzorcowe metabolitów są stabilne przez 3 miesiące, jeśli są prawidłowo przechowywane w temperaturze -80 °C.
  3. Przygotowanie ekstraktów z linii komórkowej glejaka
    1. Prym do adherencji ludzkich komórek glejaka wielopostaciowego U-87 MG należy trzykrotnie przemyć 1 ml lodowatego 0,9% roztworu chlorku sodu21.
    2. Dodać 2 ml lodowatego roztworu metanolu/wody (8/2, v/v) do przylegających komórek i zeskrobać za pomocą skrobaka do komórek z gumową końcówką21.
    3. Zebrać roztwór metanolu/wody w probówce i ultradźwięki przez 2 minuty.
    4. Dodać chloroform do frakcji metanol/woda (stosunek końcowy 8/8/2, v/v/v) i odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 16,100 x g i temperaturze 4 °C.
    5. Zebrać warstwę metanol/woda i odparować tę frakcję za pomocą koncentratora próżniowego. Rozpuścić wysuszony materiał w 50 μl wody w celu analizy metodą CE-MS bez osłony. Gdy nie jest używana, należy przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C.

2. Konfiguracja systemu CE-MS bez osłony

  1. Montaż wkładu z gołą topioną krzemionką z emiterem porowatej końcówki
    1. Umieść nowy wkład z gołą topioną krzemionką z porowatą końcówką emiterową (średnica wewnętrzna 30 μm x długość całkowita 90 cm) w przyrządzie CE.
    2. Zastosuj płukanie do przodu przy ciśnieniu 50 psi przez 15 minut za pomocą oprogramowania sterującego przyrządem CE przy użyciu 100% metanolu i sprawdź wzrokowo, czy płyn wypływa z wylotu kapilarnego podczas tego etapu płukania. Wykonaj również płukanie w przeciwnym kierunku przy ciśnieniu 50 psi przez 5 minut za pomocą roztworu BGE, aby wizualnie sprawdzić, czy ciecz wypływa z przewodzącej kapilary.
    3. Powtórzyć krok 2.1.2 pod ciśnieniem 100 psi, w przypadku gdy nie zaobserwowano tworzenia się kropel cieczy na wylocie kapilary. Zainstaluj nowy wkład z gołą stopionką krzemionkową, jeśli na tym etapie nie zaobserwowano tworzenia się kropel cieczy.
    4. Przepłukać kapilarę separacyjną wodą o ciśnieniu 50 psi przez 10 minut, następnie 0,1 M NaOH przy 50 psi przez 10 minut, następnie wodą o ciśnieniu 50 psi przez 10 minut, a na koniec BGE przy ciśnieniu 50 psi przez 10 min.
      UWAGA: Kroki od 2.1.1 do 2.1.4 są wymagane tylko do instalacji nowego wkładu kapilarnego.
  2. Sprzężenie kapilarnego porowatego emitera końcówki z ESI-MS
    UWAGA: Przed sprzężeniem kapilary CE z MS upewnij się, że przyrząd MS został skalibrowany i podłączony do systemu CE. Ustaw napięcie ESI na 0. Wyposażyć instrument MS w źródło nanosprayu. Gaz 1, gaz 2 i temperatura grzałki interfejsu nie zostały zastosowane, ponieważ ESI przy bardzo niskich natężeniach przepływu występuje po prostu poprzez przyłożenie napięcia rozpylania jonów ustawionego na 1500 V. Ustaw kurtynę na 5 psi.
    1. Wyjmij końcówkę opryskiwacza wkładu z topioną krzemionką z rurki wodnej i zainstaluj ją w adapterze źródła nanosprayu w celu połączenia z instrumentem MS. Upewnij się, że wysokość fiolek BGE w przyrządzie CE odpowiada wysokości końcówki opryskiwacza.
    2. Sprawdzić, czy ciecz przepływa przez przewodzącą kapilarę, przepłukując BGE pod ciśnieniem 50 psi przez 5 minut. Podczas tego etapu płukania należy zaobserwować tworzenie się kropli u podstawy igły opryskiwacza ESI.
    3. Przepłukać kapilar separacyjny BGE pod ciśnieniem 50 psi przez 10 minut w kierunku do przodu. Na tym etapie należy zaobserwować tworzenie się kropli na końcówce porowatej końcówki emitera (końcówki opryskiwacza).
    4. Umieścić porowatą końcówkę emitera do wejścia do wlotu MS w odległości około 2 do 3 mm.
    5. Przyłóż napięcie 30 kV przy użyciu czasu narastania wynoszącego 1 minutę i rozpocznij pozyskiwanie danych MS w zakresie m/z od 65 do 1 000 m/z do badań profilowania metabolicznego, wykorzystując najpierw napięcie ESI 0,
      UWAGA: Widmo masowe powinno być pozbawione sygnału, ponieważ nie powinno być elektrorozpylania.
    6. Ustaw napięcie ESI na 1,000 V podczas kontynuowania pomiarów. Zwiększać napięcie ESI z krokami co 200 V, aż do uzyskania stałego sygnału tła przez co najmniej 15 minut.
    7. Zoptymalizuj położenie emitera porowatej końcówki w stosunku do środka wlotu MS, przesuwając go w kierunku x, y lub z, aby zobaczyć, która pozycja zapewnia maksymalny i najbardziej stabilny sygnał MS (elektroferogram jonów całkowitych).
    8. Po zoptymalizowaniu położenia emitera porowatej końcówki i określeniu optymalnego napięcia ESI, należy ustawić napięcie ESI na 0 V i zmniejszyć napięcie CE z 30 kV do 1 kV, stosując czas narastania wynoszący 5 minut.
    9. Stworzenie metody MS przy użyciu optymalnego napięcia ESI i metody CE na przyrządzie CE do analizy wzorców metabolitów i próbek biologicznych.

3. Analiza wzorców metabolitów i próbek biologicznych

  1. Ocena wydajności bezosłonowego systemu CE-MS
    1. Przenieść 20 μl wzorcowej mieszaniny anionowego metabolitu do pustej mikrofiolki o pojemności 100 μl (fiolka do PCR), która mieści się w fiolce CE, i umieścić tę fiolkę w tacce na próbkę wlotową.
      UWAGA: Minimalna objętość wymagana w mikrofiolce do niezawodnego wstrzyknięcia wynosi 2 μl.
      1. Uruchom metodę trybu jonów ujemnych akwizycji MS utworzoną w kroku 2.2.9, a następnie uruchom sekwencję CE za pomocą oprogramowania sterującego przyrządem CE.
      2. Przepłukać kapilar separacyjny BGE przy ciśnieniu 50 psi przez 3 minuty, a następnie wstrzyknąć pod ciśnieniem 2,0 psi przez 60 sekund (20 nl odpowiada 3% objętości kapilary), a następnie wstrzyknąć BGE przy ciśnieniu 1,0 psi przez 10 sek.
        UWAGA: Następnie uruchamiana jest akwizycja danych MS.
      3. Przyłożyć napięcie -30 kV z czasem narastania 1,0 min przy ciśnieniu 0,5 psi przez 30 min na wlocie. Po 30 minutowej separacji elektroforetycznej należy przerwać akwizycję danych MS i zmniejszyć napięcie CE do -1 kV przy użyciu czasu narastania wynoszącego 5 min (stopniowy spadek napięcia CE po separacji elektroforetycznej poprawia trwałość emitera kapilarnego z porowatą końcówką).
    2. Pomiędzy wstrzyknięciami próbki płukać kapilar wodą, 0,1 M wodorotlenkiem sodu, wodą i BGE pod ciśnieniem 30 psi przez 3 minuty.
    3. Analizuj zarejestrowane dane, określając czasy migracji i intensywność sygnału analizowanej mieszaniny metabolitów anionowych.
    4. Ocenić, czy wzorce metabolitów anionowych pojawiają się w obszarze od 10 do 28 minut.
    5. Sprawdź, czy trzy strukturalnie spokrewnione izomery, tj. D-glukozo-1-fosforan, D-glukozo-6-fosforan i D-fruktozo-6-fosforan są częściowo oddzielone, tj. rozdzielczość między pierwszymi dwoma pikami wynosi około 0,75, a ostatnich dwóch pików wynosi około 0,50 (patrz rysunek 1).
      UWAGA: Rozdzielczość 1,5 oznacza separację linii bazowej dwóch sąsiednich pików.
    6. Powtórzyć kroki 3.1.1 i 3.1.2 dla mieszaniny metabolitów kationowych. Upewnij się, że detekcja MS jest teraz w trybie jonów dodatnich, a napięcie CE wynosi +30 kV.
    7. Analizuj zarejestrowane dane, określając czasy migracji i intensywność sygnału analizowanej mieszaniny metabolitów kationowych.
    8. Oceń, czy wzorce metabolitów kationowych pojawiają się w regionie między 8 a 22 minutą. Sprawdź, czy izoleucyna i leucyna migrują między 15 a 15,5 minutą i określ, czy rozdzielczość wynosi około 0,5.
  2. Analiza próbek biologicznych
    1. Powtórzyć kroki 3.1.1 i 3.1.2 dla anionowego profilowania metabolicznego ekstraktu z linii komórkowej glejaka.
      UWAGA: Zawartość metaboliczna uzyskana po wstępnym traktowaniu próbki odpowiada gęstości komórek wynoszącej około 20 komórek/nl, dlatego wstrzyknięcie 20 nl odpowiada 400 komórkom na analizę. .
    2. Stwórz elektroferogram wyekstrahowanych jonów dla metabolitu kwasu mlekowego (m/z 89.0243) z dokładnością masową 5 mDa i sprawdź, czy intensywność sygnału przekracza 100 000 zliczeń.
    3. Powtórzyć kroki 3.1.1 i 3.1.2 dla kationowego profilowania metabolicznego ekstraktu z linii komórkowej glejaka.
      UWAGA: W przypadku wstrzyknięcia 20 nl w tym trybie należy obserwować bardzo bogaty w informacje elektroferogram jonów całkowitych.
    4. Po zakończeniu analiz lub gdy nie jest używana, przepłukać kapilarę wodą o ciśnieniu 50 psi przez 15 minut i przechowywać część wlotową kapilary w fiolce zawierającej wodę, a część porowatą (część wylotową) w probówce również zawierającej wodę.

Wyniki

Zaproponowana metoda CE-MS bez osłonki pozwala na uzyskanie wysoce efektywnych, tj. o liczbie teoretycznych półek od 60 000 do 400 000, profili metabolitów anionowych i kationowych przy nanomolarnych granicach detekcji, z wykorzystaniem 10% kwasu octowego (pH 2,2) jako BGE. Wydajność rozdziału tej metody w analizie silnie polarnych metabolitów anionowych zademonstrowano na przykładzie trzech strukturalnie powiązanych izomerów fosforanów cukrów (Rysunek 1). Choć nie uzyskano rozdziału do linii bazowej dla tych trzech analitów, rozdział częściowy jest wystarczający, aby umożliwić ich selektywną detekcję za pomocą MS, ponieważ anality te mają tę samą dokładną masę. Potencjał metody CE-MS bez osłonki do profilowania metabolicznego ograniczonej liczby komórek, tj. wstrzyknięcie 20 nl odpowiada 400 komórkom (gęstość komórek wynosi ok. 20 komórek/nl), zademonstrowano w analizie metabolitów kationowych w ekstrakcie linii komórkowej glejaka (Rysunek 2), w której wykryto ponad 300 cech molekularnych powyżej stosunku S/N ≥ 5.

Elektroferogram wyekstrahowanych jonów, wykres chromatograficzny, piki glukozo-fosforanu, intensywność względem czasu.
Rysunek 1. Analiza izomerów fosforanów cukrów za pomocą CE-MS bez osłony. Elektroferogram wyekstrahowanych jonów dla trzech izomerów fosforanów cukrów (25 µM) otrzymany za pomocą CE-MS bez osłony w trybie jonów ujemnych. Warunki eksperymentalne: BGE, 10% kwas octowy (pH 2.2); napięcie rozdzielcze, -30 kV (+0.5 psi przyłożone do wlotu kapilary CE); wtrysk próbki, 2.0 psi przez 60 sec. Reprodukowano za zgodą4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Elektroferogram, rozdział aminokwasów, analiza jonów, intensywność piku, wyniki chromatografii.
Figura 2. Analiza izoleucyny i leucyny za pomocą bezosłonowej CE-MS. Elektroferogram jonów wyekstrahowanych dla dwóch izomerów aminokwasów (25 µM) uzyskany metodą bezosłonowej CE-MS w trybie jonów dodatnich. Warunki eksperymentalne: BGE, 10% kwas octowy (pH 2.2); napięcie rozdziału, +30 kV; wtrysk próbki, 2.0 psi przez 60 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Całkowity elektroferogram jonowy, analiza ekstraktu z komórek glejaka, m/z 65-1000, tryb jonów dodatnich.
Rysunek 3. Potencjał bezpowłokowej CE-MS w profilowaniu kationowych metabolitów w ekstrakcie z linii komórkowej. Profil metaboliczny (całkowity elektroferogram jonowy) zaobserwowany w ekstrakcie z linii komórkowej glejaka przy użyciu bezpowłokowej CE-MS w trybie jonów dodatnich. Warunki eksperymentalne: BGE, 10% kwas octowy (pH 2,2); napięcie separacji, +30 kV; wtrysk próbki, 2,0 psi przez 60 s. Powielone za zgodą4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Zaprezentowano bezosłonową metodę CE-MS wykorzystującą emiter z porowatą końcówką do analizy wysoce polarnych i naładowanych metabolitów. Unikalną cechą tego podejścia jest to, że metabolity anionowe lub kationowe mogą być profilowane tylko poprzez przełączanie detekcji MS i polaryzacji napięcia CE. Szeroki zakres wysoce polarnych i naładowanych metabolitów w próbkach biologicznych może być analizowany z wysoką wydajnością separacji, co ma kluczowe znaczenie dla strukturalnie podobnych metabolitów, oraz z granicami wykrywalności w (niskim) zakresie nanomolowym. Prezentowany protokół koncentrował się na wykorzystaniu bezosłonkowego CE-MS do profilowania metabolicznego ekstraktów komórkowych w celu zilustrowania użyteczności metody profilowania metabolicznego próbki biologicznej. Opisane tutaj podejście może być również wykorzystane do profilowania metabolicznego innych rodzajów próbek biologicznych, takich jak ludzki mocz5, pod warunkiem, że zastosowana zostanie odpowiednia procedura wstępnej obróbki próbki.

Bezosłonowa metoda CE-MS opiera się na porowatym emiterze końcówki, który pozwala na wykorzystanie wewnętrznie niskiej płynności CE. W tym kontekście, stabilny sygnał ESI jest warunkiem wstępnym dla powtarzalnych badań profilowania metabolicznego. Dlatego ważne jest, aby końcówka opryskiwacza była prawidłowo umieszczona przed wlotem MS. W tej konfiguracji proces ESI zależy głównie od charakteru BGE i dlatego optymalizacja BGE ma kluczowe znaczenie. Konfiguracja bez osłony jest mniej wszechstronna w porównaniu z systemami CE-MS z powłoką i cieczą, w których można dodawać wszelkiego rodzaju kompozycje osłony-cieczy w celu poprawy wydajności jonizacji. Igła opryskiwacza ESI bez osłony musi być całkowicie wypełniona cieczą przewodzącą (tj. roztworem BGE). Niestabilny sygnał ESI może wynikać z częściowego lub całkowicie zatkanego kapilary. Płukanie pod wysokim ciśnieniem za pomocą BGE może rozwiązać ten problem. W przeciwnym razie należy wymienić kapilar separacyjny. Przed oceną skuteczności analitycznej należy najpierw wygenerować stabilny sygnał tła ESI, który jest spójny z dnia na dzień.

Skuteczność analityczna metody CE-MS bez osłonki do badań profilowania metabolicznego musi być sprawdzana codziennie przy użyciu mieszanin wzorcowych metabolitów. W tych samych warunkach doświadczalnych należy uzyskać spójne czasy migracji, tj. zmienność poniżej 3% dla śróddziennego (n = 10) i międzydziennego (n = 5) przy użyciu wstrzyknięcia 20 nl mieszaniny wzorcowej metabolitu (12,5 μM), wysokości/powierzchni pików (zmiana poniżej 15%) i liczby płytek (w zakresie od 60 000 do 400 000). Granice wykrywalności powinny mieścić się w zakresie nanomolowym dla większości wzorców metabolitów. Tylko wtedy, gdy kryteria te są spełnione, metoda jest gotowa do profilowania metabolicznego próbek biologicznych. Jeśli nie, przyrząd MS musi zostać dostrojony i ponownie skalibrowany lub należy wymienić emiter kapilarny z porowatą końcówką.

Skuteczny etap płukania między analizami CE-MS ma ogromne znaczenie, nie tylko dla zapobieżenia potencjalnemu przeniesieniu, ale także dla utrzymania wydajności separacji. Potencjalne przeniesienie może być spowodowane zanieczyszczeniem fiolek BGE próbką i dlatego można je rozwiązać poprzez wymianę na nowe fiolki BGE. Gdy metoda CE-MS bez osłony nie jest używana, ważne jest, aby odłączyć kapilarnę separacyjną i przechowywać stronę wlotową kapilary w wodzie, a zewnętrzną zanurzoną z tuleją ochronną w rurce zawierającej wodę, aby przedłużyć żywotność kapilary.

Podsumowując, proponowana metoda CE-MS bez osłonki wykazuje duży potencjał w zakresie profilowania metabolicznego próbek biologicznych, gdy jest stosowana zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszym protokole. Na tym etapie zdecydowanie potrzebne są międzylaboratoryjne dane porównawcze dotyczące CE-MS bez osłony, aby ocenić (długoterminową) odtwarzalność i solidność tego podejścia w odniesieniu do metabolomiki. Protokół ten może stymulować takie badanie. Nadal należy wziąć pod uwagę różne wyzwania analityczne. Aby uzyskać optymalną wydajność, prąd CE powinien być utrzymywany najlepiej poniżej 5 μA, a na tym etapie kapilarne porowate emitery końcówek są dostarczane tylko na długości 91 cm, co może utrudniać rozwój testów o wysokiej przepustowości. Ponadto do anionowego profilowania metabolicznego zastosowano bufor separacyjny o niskim pH, który może nie być najbardziej optymalny dla osiągnięcia wyjściowej separacji strukturalnie powiązanych fosforanów cukru. Ważne jest również to, że można analizować tylko metabolity anionowe, które są (częściowo) naładowane ujemnie w zastosowanych warunkach separacji. Kolejnym krokiem jest ocena przydatności bezosłonowej metody CE-MS do klinicznych badań profilowania metabolicznego, ponieważ obecnie pojedynczy emiter kapilarny z porowatą końcówką może być używany tylko do analizy do 100 próbek biologicznych.

Ogólnie rzecz biorąc, dalsze postępy w podejściu CE-MS bez osłonki otworzą nowy kierunek w dziedzinie metabolomiki, tj. w kierunku głębszego zrozumienia funkcji biologicznych w przypadkach ograniczonych do próby.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dr. Rawi Ramautar pragnie podziękować za wsparcie finansowe programu grantów Veni Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO Veni 722.013.008).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przyrząd CESI 8000SciexA98089Adapter OptiMS wymagany do sprzężenia
wkładu CESI z MS OptiMS z topionej krzemionki, 30  μ m ID x 90  cm długość całkowitaSciexB07367
Adapter OptiMS do źródła Sciex Nanospray IIIFiolki SciexB07363
CESISciexB11648
MikrofiolkiSciex144709
Lodowaty kwas octowySigmaA6283Zastosowanie w dygestorii
Mieszanina metabolitów kationowychTechnologieludzkiego metabolomuH3304-3034
Mieszanina metabolitów anionowychHuman Metabolome TechnologiesH3304-1031
Metanol (LC-MS Ultra Chromasolv)Sigma14262Stosować w dygestoriach
Roztwór wodorotlenku soduSigma720790,1
M U-87 MG Linia komórkowa glejakaSigma89081402
ChloroformSigma650498Toksyczny; stosować w dygestoriach

Bibliografia

  1. Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. Human metabolomics: strategies to understand biology. Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).
  2. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).
  3. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6, e16957(2011).
  4. Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling. Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).
  5. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal Chem. 84, 885-892 (2012).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS. Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).
  7. Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue. Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).
  8. Ibanez, C., et al. CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation. Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).
  9. Soga, T., et al. Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).
  10. Soga, T., et al. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  11. Britz-McKibbin, P. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics. Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).
  12. Ibanez, C., et al. A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease. J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).
  13. Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era. Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).
  14. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).
  15. Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry. Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).
  16. Maxwell, E. J., Chen, D. D. Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).
  17. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments. J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).
  18. Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis. Analyst. 137, 5026-5033 (2012).
  19. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).
  20. Moini, M. Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip. Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).
  21. Dettmer, K., et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interfejs z porowatą końcówkąprofilowanie metabolitówmetabolity anionowemetabolity kationoweczysta krzemionka topionajonizacja elektrosprayanaliza metabolomiczna
Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.