Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54540

⸱

11 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Streszczenie

Aktywowane hiperpolaryzacją cykliczne kanały bramkowane nukleotydami (HCN) są wyrażane wszędzie w mózgu, gdzie funkcjonują w celu regulacji pobudliwości neuronów. Subkomórkowa dystrybucja tych kanałów w neuronach piramidowych obszaru hipokampa CA1 jest regulowana przez białko oddziałujące z Rab8b zawierające powtórzenia tetratrikopeptydu (TRIP8b), podjednostkę pomocniczą. Genetyczny nokaut podjednostek tworzących pory HCN lub TRIP8b prowadzi do wzrostu zachowań podobnych do leków przeciwdepresyjnych, co sugeruje, że ograniczenie funkcji kanałów HCN może być przydatne w leczeniu dużego zaburzenia depresyjnego (MDD). Pomimo dużego zainteresowania terapeutycznego, kanały HCN ulegają również ekspresji w sercu, gdzie regulują rytmiczność. Aby obejść problemy związane z blokowaniem sercowych kanałów HCN, nasze laboratorium zaproponowało niedawno celowanie w interakcję białko-białko między HCN a TRIP8b w celu specyficznego zakłócenia funkcji kanału HCN w mózgu. TRIP8b wiąże się z podjednostkami tworzącymi pory HCN w dwóch różnych miejscach interakcji, chociaż tutaj nacisk kładziony jest na interakcję między domenami powtórzeń tetratrikopeptydu (TPR) TRIP8b a końcowym ogonem C HCN1. W niniejszym protokole opisano rozszerzony opis metody oczyszczania TRIP8b i wykonywania wysokoprzepustowego badania przesiewowego w celu identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów interakcji między HCN i TRIP8b. Metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych wykorzystuje test oparty na polaryzacji fluorescencyjnej (FP) do monitorowania wiązania dużego fragmentu TRIP8b z oznaczonym fluoroforem peptydem jedenastu aminokwasów odpowiadającym ogonowi końcowemu HCN1 C. Metoda ta pozwala na identyfikację związków "trafionych" na podstawie zmiany polaryzacji emitowanego światła. Następnie przeprowadzane są testy walidacyjne, aby upewnić się, że związki "trafione" nie są sztuczne.

Wprowadzenie

Aktywowane hiperpolaryzacją kanały HCN (cykliczne nukleotydy) ulegają ekspresji w sercu i ośrodkowym układzie nerwowym, gdzie odgrywają ważną rolę w regulacji pobudliwości błony1. Kanały HCN są zaangażowane w patogenezę dużego zaburzenia depresyjnego (MDD)2, co skłoniło kilka grup do zaproponowania, że farmakologiczne ograniczenie funkcji kanału HCN może być skuteczne jako nowe leczenie MDD3. Jednak bezpośrednie ukierunkowanie na kanały HCN nie jest opłacalne ze względu na ich ważną rolę w potencjale czynnościowym serca4. Iwabradyna, jedyny zatwierdzony przez FDA antagonista kanału HCN, jest stosowana w leczeniu niewydolności serca w celu wywołania efektu bradykardycznego5. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na środki farmakologiczne, które ograniczają funkcję kanału HCN wyłącznie w ośrodkowym układzie nerwowym.

Tetratricopeptide zawierające powtarzające się białko oddziałujące z Rab8b (TRIP8b) jest specyficzną dla mózgu podjednostką pomocniczą kanałów HCN, która kontroluje ekspresję powierzchniową i lokalizację kanałów HCN6,7. Genetyczny nokaut TRIP8b powoduje zmniejszenie kanałów HCNw mózgu 7 bez wpływu na ekspresję HCN w sercu8. Co ciekawe, myszy z nokautem TRIP8b spędzają mniej czasu w bezruchu podczas zadania wymuszonego pływania i zadania zawieszenia ogona7, dwóch powszechnie stosowanych testów przesiewowych skuteczności przeciwdepresyjnej9-11. Wyniki te sugerują, że zamiast bezpośrednio celować w kanały HCN z małocząsteczkowym antagonistą funkcji kanału HCN, zakłócenie interakcji między TRIP8b i HCN może być wystarczające do wytworzenia zachowania podobnego do przeciwdepresyjnego.

TRIP8b wiąże się z HCN w dwóch różnych miejscach wiązania. Cykliczna domena wiążąca nukleotydy (CNBD) HCN oddziałuje z konserwatywną domeną TRIP8b znajdującą się na końcu N do domen TPR TRIP8b12,13. Chociaż reszty CNBD, które są zaangażowane w tę interakcję, zostały zmapowane14, region TRIP8b, który jest zaangażowany, nie został zawężony poza fragment13-aminokwasu an-80. Druga interakcja zachodzi między domenami powtórzeń tetratrikopeptydu (TPR) TRIP8b a końcowym tripeptydem C HCN ("SNL" w HCN1, HCN2 i HCN4, ale "ANM" w HCN3)3,12. Niedawno rozwiązana struktura krystaliczna15 tej interakcji ogona C wykazała znaczne podobieństwo strukturalne do interakcji między peroksysomalnym receptorem importowym, peroksyną 5 (PEX5), a jego oddziałującymi partnerami, zawierającymi peroksysomalne sekwencje celujące typu 1 (PTS1)16.

Chociaż oba miejsca interakcji są wymagane do działania kanału HCN, interakcja między domenami TPR TRIP8b a końcowym tripeptydem C HCN1 służy jako dominujące miejsce wiązania i reguluje ekspresję powierzchniową HCN. Dlatego ta interakcja została wybrana jako miejsce docelowe w tym badaniu. W pozostałej części manuskryptu, gdy pojawia się odniesienie do interakcji między TRIP8b i HCN, to właśnie do tej interakcji jest się odniesiona. Oddziaływanie to jest rekapitulowane przez wysoce rozpuszczalny fragment TRIP8b odpowiadający jego konserwatywnemu terminalowi C zawierającemu domeny TPR wymagane do wiązania ogona końcowego C HCN (reszty 241-602 izoform 1a-4 TRIP8b)3.

W celu opracowania wysokoprzepustowego ekranu do identyfikacji małych cząsteczek zdolnych do zakłócenia tej interakcji, zastosowano test oparty na polaryzacji fluorescencyjnej (FP)17. Polaryzacja fluorescencyjna opiera się na wzbudzeniu liganda znakowanego fluoroforem światłem spolaryzowanym i pomiarze stopnia polaryzacji emitowanej fluorescencji18. W obecności partnera wiążącego ruch obrotowy liganda fluorescencyjnego jest ograniczony i emitowane jest światło spolaryzowane19. W przypadku braku partnera wiążącego, ruch obrotowy liganda prowadzi do emisji zdepolaryzowanego światła.

W załączonym protokole przedstawiono metodę oczyszczania N TRIP8b (241-602) oznaczonego terminalem (6xHis) za pomocą kulek kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA). Podobny protokół zastosowano do oczyszczenia 40 końcowych aminokwasów HCN1 (HCN1c40) oznaczonych s-transferazą glutationu (GST) zastosowanych w kroku 7 protokołu. Ze względu na ograniczoną ilość miejsca pominięto szczegółowy opis tej procedury.

W krokach od 2 do 7 protokołu prezentowany jest przepływ pracy przesiewowej o wysokiej przepustowości (zobacz Rysunek 1). Interakcje białko-białko są niezwykle trudnym celem dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych, a czytelnikom zaleca się poszukanie dodatkowych zasobów na ten temat20.

Kroki 2 i 3 procedury charakteryzują powinowactwo in vitro oczyszczonego konstruktu TRIP8b (241-602) dla znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) jedenastu peptydów aminokwasowych odpowiadających końcowemu ogonowi C HCN1 (HCN1FITC). Opierając się na strukturze krystalicznej kompleksu TRIP8b-HCN15, ten jedenaście segmentów aminokwasowych jest wystarczający do wytworzenia wiązania z TRIP8b (241-602). W kroku 2 Kd oddziaływania mierzy się przez miareczkowanie TRIP8b (241-602) do ustalonego stężenia HCN1FITC. W kroku 3 nieznakowana wersja peptydu HCN użytego w kroku 2 jest miareczkowana do ustalonego stężenia zarówno TRIP8b (241-602), jak i HCN1FITC w celu zbadania, czy znacznik FITC zakłóca wiązanie. Eksperymenty te są niezbędne do wyboru odpowiednich stężeń TRIP8b (241-602) i HCN1FITC stosowanych w wysokoprzepustowym sitodruku.

Założeniem wysokoprzepustowego ekranu jest to, że mała cząsteczka zdolna do zakłócenia interakcji między TRIP8b (241-602) a HCN1FITC spowoduje spadek spolaryzowanego światła. W kroku 4 współczynnik Z testu obliczasię 21 dla danego stężenia TRIP8b (241-602) i HCN1FITC, aby upewnić się, że test jest odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (krok 5). Kroki 6 i 7 to testy walidacyjne mające na celu potwierdzenie, że trafienia zidentyfikowane w pierwotnym ekranie o wysokiej przepustowości działają poprzez zakłócenie interakcji między TRIP8b (241-602) a HCN1FITC, a nie poprzez niespecyficzny mechanizm. W kroku 6 peptyd HCN1 znakowany karboksymetylorodaminą (TAMRA) (HCN1TAMRA) jest używany w identycznym teście polaryzacji fluorescencji do filtrowania związków fluorescencyjnych, które zagrażają testowi FP za pomocą znacznika FITC. Krok 7 wykorzystuje większy fragment końcowy HCN1 C (HCN1C40) i wykorzystuje test zbliżeniowy oparty na kulkach, który opiera się na "tunelowaniu" tlenu singletowego z kulki dawcy do kulki akceptorowej zbliżenia się do siebie przez oddziałujące białka22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oczyszczanie białka TRIP8b (241-602)

  1. Przekształć plazmid zawierający TRIP8b (241-602) w wektorze ekspresji białka bakteryjnego pGS213 w kompetentną E. coli do ekspresji białka zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść 300 μl kultury na agarze Luria Bulion (LB) z 5 μg/ml chloramfenikolu i ampicyliny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
  2. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić 50 ml LB 50 μg/ml chloramfenikolu i ampicyliny. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin (wstrząsając).
  3. Dodać 50 ml kultury do 1 l LB z 50 μg/ml ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
  4. Gdy kultura osiągnie odczyt OD600 wynoszący 0,8-1,2, zmień temperaturę inkubatora na 18 °C i dodaj IPTG (Isopropyl-Beta-D-Thiogalactoside) do końcowego stężenia 1 mM. Pozwól, aby ekspresja białka postępowała przez 16 godzin.
  5. Wirować E. coli w temperaturze 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzać bakterie. Po wyjęciu probówek z wirówki, utrzymuj bakterie na lodzie do końca procedury. Zawiesić bakterie w 36 ml buforu A z 0,25 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF).
  6. Sonikuj zawieszone bakterie na lodzie za pomocą płaskiej przez 5-10 minut, na przemian 30 sekund "włącz" i 30 sekund "wyłącz" przy dużej mocy.
  7. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wirować przez dodatkowe 15 minut, jeśli supernatant nie jest jeszcze klarowny.
  8. Nałożyć supernatant na kolumnę z 2 ml kulek Ni-NTA. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.
  9. Pozwolić, aby niezwiązany materiał przepłynął przez kolumnę i przemyć 500 ml buforu A.
  10. Przemyć kolumnę 250 ml buforu B.
  11. Przemyć kolumnę 125 ml buforu A uzupełnionego 5 mM imidazolem.
  12. Eluować białko z kolumny za pomocą 20 ml buforu elucyjnego.
  13. Dodać wymyte białko do kasety dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej – 10 kDa) za pomocą strzykawki. Dializować białko przez 60 minut w 4 litrach zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C.
  14. Przenieś kasetę do dializy do nowego wiadra o pojemności 4 litrów z zimnym PBS. Dializować białko przez 16 godzin w temperaturze 4 oC.
  15. Następnego ranka sprawdź stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek Coomassie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zagęścić białko za pomocą koncentratora białka, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, jeśli zaobserwowane jest stężenie poniżej 40 μM. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu przechowywania.

2. Test polaryzacji fluorescencji na małą skalę w celu scharakteryzowania interakcji dwóch fragmentów białka

  1. Rozmrozić 200 μl 40 μM TRIP8b (241-602) i dodać do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl PBS do 11 dodatkowych probówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Wykonaj rozcieńczenia seryjne, przenosząc 100 μl TRIP8b (241-602) z oryginalnej probówki do następnej probówki z serii, pipetując w górę i w dół i powtarzając proces. W ten sposób uzyska się 12-punktową serię 2-krotnych rozcieńczeń TRIP8b (241-602) w zakresie 0,01-40 μM.
  3. Przygotować 650 μl mieszaniny wzorcowej 0,1 μMHCN1 FITC (6,5 μl z 10 μM podwielokrotności) i 2 mM ditiotreitolu (DTT) w PBS.
    Uwaga: Miks główny to 2x.
  4. Ustaw 12 nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Do każdej probówki dodać 50 μl mieszanki wzorcowej zawierającej HCN1FITC, a następnie dodać 50 μl z każdego z 12 seryjnych rozcieńczeń.
    Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie 12 probówek, z których każda zawiera 0,05 μMHCN1 FITC i połowę stężenia TRIP8b (241-602) z oryginalnego rozcieńczenia szeregowego.
  5. Dodać serię rozcieńczeń do płytki testowej, 30 μl na basenik, w trzech powtórzeniach. Użyj solidnej, czarnej, 384-dołkowej płytki o niskim wiązaniu.
  6. Wirować płytkę przez 2 minuty przy 900 x g przy suchej smoła.
  7. Odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierz polaryzację fluorescencji za pomocą następujących parametrów pomiarowych: wzbudzenie 485 nm, emisja 530 nm, zwierciadło dichroiczne 505 nm, czas całkowania 100 ms.
  8. Wykreśl wartości polaryzacji (mP) w funkcji stężenia TRIP8b (241-602) na skali logarytmicznej. Dopasuj dane do równania Hilla, aby określić powinowactwo (Kd) TRIP8b (241-602) do znakowanego peptydu HCN1.
    Uwaga: Do przygotowania seryjnych rozcieńczeń zamiast probówek można również użyć płytki wielodołkowej.

3. Zbadaj interakcję białko-białko za pomocą kontroli pozytywnej

  1. Dodać 200 μl nieznakowanego peptydu HCN1 (200 μM) do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl PBS do 11 dodatkowych probówek o pojemności 1,5 ml. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia, przenosząc 100 μl z probówki zawierającej 200 μl peptydu do pierwszej probówki ze 100 μl PBS. Powtórz proces, aby wygenerować 12 probówek z 2-krotnymi rozcieńczeniami nieznakowanego peptydu HCN1.
  2. Przygotować 650 μl mieszanki wzorcowej 0,2 μM HCN1FITC i 4 μM TRIP8b(241-602).
    Uwaga: Jest to rozwiązanie 2x.
  3. Dodać 50 μl mieszanki wzorcowej do 12 nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodać 50 μl każdego seryjnego rozcieńczenia do probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Załadować czarną 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania w trzech egzemplarzach, dodając 30 μl na dołek.
  6. Odwirować płytkę przez 2 minuty przy 900 x g w temperaturze pokojowej.
  7. Odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek z funkcją FP. Należy użyć tych samych ustawień, które opisano w kroku 2.7.
  8. Obliczyć powinowactwo nieznakowanego peptydu do TRIP8b(241-602) za pomocą równania Cheng-Prusoffa: Kd1 = IC50 / (1 + [L]/Kd2), gdzie Kd1 reprezentuje powinowactwo nieznakowanego peptydu do TRIP8b (241-602), IC50 określa się w poprzednim kroku i reprezentuje zdolność nieznakowanego liganda do wypierania znakowanego liganda, [L] jest stężeniem znakowanego liganda w kroku 3.2, a Kd2 jest powinowactwem TRIPb(241-602) do znakowanego ligandu.

4. Oceń wydajność testu (Oblicz współczynnik Z)

  1. Przygotować mieszankę wzorcową, sporządzając 12 ml roztworu buforu FP z 2 μM TRIP8b (241-602), 50 nMHCN1 FITC i 1 mM DTT w FP Buffer.
    Uwaga: Będzie to wymagało 60 μl 40 μM TRIP8b (241-602), 60 μl 10 μMHCN1 FITC i 1,080 μl buforu FP.
  2. Dodać 30 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka czarnej 384-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
  3. Dodaj 1 μl 1 mM nieznakowanego peptydu HCN1 do 192 studzienek, aby służyły jako kontrola pozytywna.
  4. Dodać 1 μl buforu FP do 192 studzienek, aby służyły jako kontrola ujemna.
  5. Odwirować płytkę przez 2 minuty przy 900 x g w temperaturze pokojowej.
  6. Odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek.
  7. Obliczyć współczynnik Z dla testu, stosując następujący wzór: Z = 1 - 3*(σpos-σ neg)/(μneg-μ pos), gdzieσ pos i σneg są odchyleniami standardowymi studzienek kontroli dodatniej i ujemnej, a μpos i μneg reprezentują średnie sygnały w studzienkach kontroli dodatniej i ujemnej.

5. Ekran o wysokiej przepustowości

  1. Rozmrozić podwielokrotności TRIP8b (241-602) i HCN1FITC i trzymać je na lodzie.
  2. Przygotować 10 ml TRIP8b (2 μM) i HCN1FITC (50 nM) w buforze FP.
  3. Dozować 25 μl mieszaniny do każdego dołka 384-dołkowej czarnej płytki do mikromiareczkowania o niskim poziomie wiązania za pomocą pipety.
  4. W przypadku badań przesiewowych w bibliotece dodaj związki do każdej studzienki w kolumnach od 3 do 22 (końcowe stężenie 40 μM dla każdego) za pomocą akustycznego urządzenia do obsługi cieczy.
    Uwaga: Ze względu na stosunkowo niski wskaźnik trafień obserwowany w tym teście, dwa różne związki zostały połączone w jednym dołku. Dwa związki z każdej aktywnej studzienki zostały następnie przetestowane indywidualnie w celu określenia, który nadaje aktywność.
  5. Dodać 100 nl dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdej studzienki w kolumnach 1 i 23 każdej płytki jako kontrolę ujemną.
  6. Dodaj nieznakowany peptyd HCN1 do każdej studzienki w kolumnach 2 i 24 każdej płytki jako kontrole pozytywne.
  7. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Czytać płytki lub inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin przed odczytem.
  8. Zmierz polaryzację fluorescencyjną na czytniku płytkowym. Użyj tych samych ustawień, co opisano w kroku 2.7.
  9. Oblicz procentową inhibicję, normalizując sygnały przy użyciu średnich kontroli pozytywnych i ujemnych z każdej płytki jako 100%. Użyj równania XN = 100% * ((Xneg - X)/(Xneg - Xpos)) gdzie XN jest znormalizowanym procentem zahamowania odpowiadającym sygnałowi X, Xpos jest średnim sygnałem z dołków kontroli dodatniej, a Xneg jest sygnałem ze studzienek kontroli ujemnej.

6. Potwierdzenie trafień za pomocą peptydu HCN oznaczonego tagiem TAMRA

  1. Walidacja trafień z ponad 50% hamowaniem za pomocą peptydu HCN1 znakowanego TAMRA (HCN1TAMRA).
    1. Przygotować mieszaninę wzorcową składającą się z 12 ml 2 μM TRIP8b (241-602) i 50 nMHCN1 TAMRA w buforze FP.
    2. Dozować 25 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka czarnej 384-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
    3. Przenieść seryjne rozcieńczenia każdego związku aktywnego do odpowiednich studzienek. Dokonać dwukrotnego rozcieńczenia, tak aby stężenie każdego trafienia mieściło się w zakresie od 0,2 μM do 200 μM.
    4. W przypadku reakcji kontroli ujemnej przenieść 100 nl DMSO do każdej studzienki. Do kontroli pozytywnej dodać 100 nl seryjnie rozcieńczonego nieznakowanego peptydu HCN1 o końcowym stężeniu w zakresie od 200 μM do 0,1 μM.
    5. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Przed odczytem odczytać płytki lub inkubować przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
    6. Zmierz polaryzację fluorescencji (mP) przy użyciu następujących parametrów pomiarowych: wzbudzenie 535 nm, emisja 580 nm, zwierciadło dichroiczne 535 nm, czas całkowania 20 ms.
    7. Oblicz wartości IC50, dopasowując dane FP zależne od stężenia każdego związku przy użyciu czteroparametrowego modelu regresji nieliniowej23.

7. Walidacja dawki i odpowiedzi testu zbliżeniowego opartego na koralikach

  1. Rozmrozić 1 podwielokrotność białek fuzyjnych TRIP8b znakowanych Hisem (241-602) (His-TRIP8b) i HCN1 znakowanych GST (GST-HCN1C40) i trzymać je na lodzie.
  2. Połączyć His-TRIP8b z GST-HCN1C40 w buforze testowym w stężeniach 400 nM His-TRIP8b i 40 nM GST HCN1C40. Przygotować 300 μl mieszaniny dla każdego badanego związku.
    Uwaga: Związki są podawane w trzech egzemplarzach w 11 różnych stężeniach plus kontrola DMSO (bez związku).
  3. W przypadku studzienek kontrolnych należy przygotować 30 μl His-TRIP8b (200 nM) bez GST-HCN1C40, a następnie oddzielnie przygotować 30 μl GST-HCN1C40 (20 nM) bez His-TRIP8b w buforze testowym.
  4. Dla każdego badanego związku dodać 7 μl mieszaniny His-TRIP8b:GST-HCN1C40 (przygotowanej w kroku 7.2 powyżej) do 36 dołków płytki za pomocą 16-kanałowej pipety. W celu zbadania pojedynczego związku należy ułożyć 12 różnych stężeń w rzędach A-L, a trzy kontrpróby w kolumnach 1-3. Dodać 7 μl roztworu His-TRIP8b (przygotowanego w 7.3) do kolumn 1-3 rzędu M i 7 μl roztworu GST-HCN1C40 (przygotowanego w 7.3) do kolumn 1-3 rzędu N. Krótko odwirować płytkę, aby upewnić się, że ciecze znajdują się na dnie każdej studzienki i usunąć wszelkie pęcherzyki.
  5. Dozować badane związki trafione do płytki w taki sposób, aby stężenie każdego trafienia mieściło się w zakresie od 200 μM (w rzędzie A) do 0,1 μM (w rzędzie K). Dozować objętość DMSO w rzędach L-N, która odpowiada ilości związku dozowanego w rzędach AK.
  6. Potrząsać płytką przez 2 minuty i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Rozcieńczyć kulki akceptora anty-GST w stosunku 1:50 buforem testowym.
  8. Dodać 3,5 μl rozcieńczonych kulek akceptora do każdego dołka płytki za pomocą 16-kanałowej pipety i mieszać delikatnie pipetując, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
  9. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  10. Rozcieńczyć kulki donora chelatu niklu w stosunku 1:50 buforem do oznaczania. Nie wystawiaj mieszaniny na działanie światła.
  11. Dodać 3,5 μl rozcieńczonych kulek Donora do każdego dołka płytki za pomocą 16-kanałowej pipety i mieszać delikatnie pipetując, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
  12. Inkubować płytkę przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  13. Czytaj na czytniku płytek. Użyj czytnika płytek o następujących parametrach pomiaru: czas wzbudzenia 40 ms, czas emisji 100 ms, wysokość detekcji 0,1 mm.
  14. Oblicz wartości IC50, dopasowując dane dla każdego związku przy użyciu czteroparametrowego modelu regresji nieliniowej23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby uniknąć problemów z prawami autorskimi w odniesieniu do naszej poprzedniej publikacji, do przygotowania rysunków 2 i 3 wykorzystano sondę HCN1TAMRA znakowaną TAMRA. Należy zauważyć, że zamiana ta nie wpłynęła znacząco na wyniki, a protokoły są identyczne z tymi opisanymi powyżej dla HCN1FITC. Aby ocenić oddziaływanie z HCN1TAMRA, TRIP8b (241-602) miareczkowano do stażego stężenia HCN1TAMRA , stosując protokó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na jego potencjał jako celu terapeutycznego w MDD24, istnieje znaczne zainteresowanie podejściami farmakologicznymi, które antagonizują funkcję kanału HCN w ośrodkowym układzie nerwowym4. Jednak wysiłki te zostały wstrzymane przez ważną rolę kanałów HCN w tworzeniu rozrusznika serca i ryzyku arytmii25. Doszliśmy do wniosku, że zakłócenie interakcji między HCN a jego specyficzną dla mózgu podjednostką pomocniczą, TRIP8b8, może być wystarczające do wywołania efektów po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.) oraz National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). Część tych prac została wykonana przez Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) w Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), który jest finansowany przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds w Chicago Community Trust i Cancer Center Support Grant P30 CA060553 z National Cancer Institute przyznany Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe przeprowadzono w Laboratorium Analiz Wysokoprzepustowych, które jest również podstawową placówką Kompleksowego Centrum Onkologicznego im. Roberta H. Lurie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza Ni-NTA Qiagen30210
 ThermoFisher66456
Izopropyl b-D-1-tiogalaktopiranozyd Sigma-AldrichI5502 - 1 gr
384-dołkowy talerz Corning3820
Proxiplate Perkin-Elmer 
Koraliki akceptujące GST Perkin-Elmer 6760603C
NiChelatePerkin-Elmer AS101D
pGS21-aGenscriptSD0121
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Coomassie KitKoncentrator białka ThermoFisher23200
ThermoFisher88527
Perkin Elmer Enspire Wielomodowy czytnik płytekPerkin-Elmer #2300-001M
BL21 (DE3) Kompetentne komórkiAgilent200131
Kaseta do dializy 6008289

Bibliografia

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44(2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcja HCN1 TRIP8btest polaryzacji fluorescencjiwysokoprzepustowe przesiewanieoczyszczanie białektest wiązania peptydówobliczanie IC50test zbliżeniowy oparty na kuleczkachwalidacja związkówterapia depresji
Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.