Artykuł metodologiczny

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54598

⸱

28 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Streszczenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są generowane z mysich i ludzkich komórek somatycznych poprzez wymuszoną ekspresję zdefiniowanych czynników transkrypcyjnych przy użyciu różnych metod. W tym przypadku wyprodukowaliśmy komórki iPS z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach. Wszystkie uzyskane linie komórkowe iPS wykazywały cechy komórek pluripotencjalnych, w tym zdolność do różnicowania się w kierunku pochodnych wszystkich trzech listków rozrodczych in vitro i in vivo. Strategia ta otwiera możliwość wykorzystania komórek z chorych płodów do opracowania nowych terapii wad wrodzonych.

Wprowadzenie

Diagnostyka prenatalna jest ważnym narzędziem klinicznym do oceny chorób genetycznych (np. aberracji chromosomowych, chorób monogenetycznych lub poligenetycznych/wieloczynnikowych) i wad wrodzonych (np. wrodzona przepuklina przeponowa, torbielowate zmiany w płucach, egzomphalo, gastroschisis). Komórki płynu owodniowego (AF) są łatwe do uzyskania dzięki rutynowo planowanym zabiegom w drugim trymestrze ciąży (tj. amniopunkcji i redukcji owodni) lub cesarskim cięciom1,2. Dostępność komórek AF od pacjentów prenatalnych lub noworodkowych daje możliwość wykorzystania tego źródła w medycynie regeneracyjnej, a kilku badaczy zbadało możliwość leczenia różnych uszkodzeń tkanek lub chorób przy użyciu populacji komórek macierzystych wyizolowanych z AF3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Możliwość łatwego pozyskania komórek migotania przedsionków od chorych pacjentów, w oknie czasowym, w którym choroba często jest stacjonarna, otwiera drogę do pomysłu wykorzystania tego źródła komórek do celów przeprogramowania. Rzeczywiście, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) pochodzące z komórek AF mogą być różnicowane w komórkach będących przedmiotem zainteresowania do testów leków in vitro lub do metod inżynierii tkankowej, w celu przygotowania odpowiedniej terapii specyficznej dla pacjenta przed porodem. Wiele badań wykazało już zdolność komórek AF do przeprogramowywania i różnicowania w szeroki zakres typów komórek13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25,26,27.

Od czasu odkrycia przez Takahashiego i Yamanakę28 przeprogramowanych komórek somatycznych poprzez wymuszoną ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych (Oct4, Sox2, cMyc i Klf4), nastąpił postęp w dziedzinie przeprogramowywania. Biorąc pod uwagę różne metody, możemy rozróżnić podejścia wirusowe i niewirusowe. Pierwsza zakłada użycie wektorów wirusowych (retrowirusów i lentiwirusów), które charakteryzują się wysoką skutecznością, ale zwykle niepełnym wyciszeniem transgenu retrowirusowego, co skutkuje zarówno częściowo przeprogramowaną linią komórkową, jak i ryzykiem mutagenezy insercyjnej29,30,31. Metoda niewirusowa wykorzystuje różne strategie: tj. plazmidy, wektory, mRNA, białka, transpozony. Wyprowadzenie komórek iPS wolnych od sekwencji transgenicznych ma na celu obejście potencjalnie szkodliwych skutków nieszczelnej ekspresji transgenu i mutagenezy insercyjnej. Spośród wszystkich wyżej wymienionych strategii niewirusowych, system transpozon/transpozaza PiggyBac (PB) wymaga jedynie odwróconych powtórzeń końcowych flankujących transgen i przejściowej ekspresji enzymu transpozazy do katalizowania zdarzeń insercji lub wycinania32. Przewagą w stosowaniu transpozonów w porównaniu z innymi metodami generowania komórek iPS jest możliwość uzyskania komórek iPS wolnych od wektorów przy użyciu podejścia wektorowego niewirusowego, które wykazuje taką samą skuteczność jak wektory retrowirusowe. Jest to możliwe dzięki bezśladowemu wycięciu zintegrowanego kodowania transpozonów dla czynników przeprogramowujących po nowej przejściowej ekspresji transpozazy w komórkach iPS33. Biorąc pod uwagę, że PB jest wydajny w różnych typach komórek34,35,36,37, jest bardziej odpowiedni do podejścia klinicznego w odniesieniu do wektorów wirusowych i pozwala na produkcję komórek iPS wolnych od kseno, w przeciwieństwie do obecnych protokołów produkcji wirusów, które wykorzystują warunki ksenobiotyczne, system ten jest używany do pozyskiwania komórek iPS z mysiego AF.

Tutaj proponujemy szczegółowy protokół na podstawie już opublikowanych prac, aby pokazać produkcję pluripotencjalnych klonów iPS z mysich komórek AF (komórki iPS-AF)38.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury były zgodne z włoskim prawem. Próbki mysiego AF pobrano od ciężarnych myszy po 13,5 dniu po stosunku (d.p.c.) od myszy C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J zwanych GFP.

1. Produkcja transpozonów

UWAGA: Wektory ekspresji transpozonów zostały wygenerowane przy użyciu standardowych procedur klonowania. Plazmidowe DNA do transfekcji mysich komórek AF przygotowano przy użyciu komercyjnych zestawów.

  1. Wymieszaj 10 ng plazmidowego DNA z 50 μl bakterii DH5α w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Inkubować probówkę do mikrowirówki na lodzie przez 20 minut.
  2. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 40 sek.
  3. Umieść probówkę wirówkową na lodzie na 2 minuty.
  4. Dodać 250 μl podgrzanego (37 °C) bulionu lizogenicznego (LB). Wstrząsać (300 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  5. Rozprowadzić 30 μl każdej przemiany na płytkach LB z 0,1 mg/ml ampicyliny. Pozostawić płytki do wyschnięcia i inkubować odwrócone w temperaturze 37 °C przez noc.
  6. Następnego dnia, po południu, wybierz 3 kolonie, używając sterylnych końcówek 200 μl, z każdej transformacji i przenieś na 0,1 mg/ml LB amp.
  7. Wstrząsnąć (300 obr./min) bakteriami przez noc w temperaturze 37 °C.
  8. Do oczyszczania plazmidu należy używać zestawów komercyjnych. Plazmidy magazynowe w temperaturze -20 °C.

2. Hodowla fibroblastów embrionalnych myszy (MEF)

  1. Powlekanie płytek 6-dołkowych 0,1% żelatyną
    1. Pokryj płytki pod maską, dodając 1 ml sterylnej 0,1% żelatyny do każdej z sześciu studzienek. Pozostawić żelatynę do polimeryzacji w inkubatorze (37 °C) przez 1 godzinę.
    2. Wyrzuć nadmiar i susz talerze przez 1 godzinę.
    3. Użyj parafilmu do uszczelniania i przechowywania płytek w temperaturze pokojowej.
  2. Inaktywacja MEF za pomocą mitomycyny C
    1. Rozmrozić fiolkę zawierającą 4 x 106 komórek MEF w kąpieli o temperaturze 37 °C.
    2. Wysiewać MEF w pokrywie na szalce Petriego (150 mm) z podłożem MEF.
    3. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. (UWAGA) Dodaj mitomycynę C (5 mg / ml), gdy komórki się zlewają.
    5. Umieścić komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) na 3 godziny.
    6. Usunąć pożywkę za pomocą mitomycyny C. Umyć komórki trzykrotnie solą fizjologiczną z 1x buforem fosforanowym (PBS).
    7. Dodać 2 ml dostępnej w handlu trypsyny i umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut. Następnie dodaj 18 ml pożywki blokującej, aby zatrzymać reakcję trypsyny.
    8. Policz ogniwa za pomocą komory burkera zgodnie z protokołem producenta.
    9. Odwirować komórki przy 145 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    10. Wysiewaj 60 000 komórek/cm2 inaktywowanego MEF na 0,1% płytkach pokrytych żelatyną.
    11. Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed wysiewem komórek AF i/lub iPS-AF.

3. Izolacja komórek AF myszy

  1. Ustaw krycie czasowe i sprawdź zatyczki dopochwowe po 24 godzinach wspólnego trzymania.
  2. Przestrzegać do godziny 13,5 d.p.c i złożyć ciężarną matkę przez zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Oczyść ścianę brzucha zwierzęcia za pomocą 70% etanolu.
  4. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej, nacinając ścianę brzucha, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej.
  5. Odsłoń macicę za pomocą kleszczy. Usuń macicę za pomocą nożyczek i przenieś na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną sterylnym 1x PBS umieszczonym na lodzie.
  6. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zebrać AF przy 10-krotnym powiększeniu.
  7. Przytrzymaj macicę kleszczami i usuń ścianę macicy nożyczkami. Należy uważać, aby uniknąć uszkodzenia błon płodowych i wynikającego z tego wycieku płynu owodniowego.
  8. Zebrać płody na 100 mm szalkę Petriego wypełnioną sterylnym 1x PBS i umieścić na lodzie.
  9. Chwyć łożysko jednego płodu cienkimi kleszczami i umieść na czystej szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  10. Usuń woreczek żółtkowy za pomocą cienkich kleszczy
    11. .
  11. Rozbić owodnię za pomocą cienkich kleszczy punktowych i zebrać 30 μl migotania przedsionków dla każdego płodu za pomocą strzykawki insulinowej do stożkowej fiolki o pojemności 15 ml.
  12. Po pobraniu AF umyj każdy płód sterylnym 1x PBS uzupełnionym 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i zbierz do 15 ml stożkowej probówki zawierającej AF.
  13. Odwirować AF przy 145 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant pod maską i zasiać granulowane komórki AF.

4. Hodowla komórek AF myszy

  1. Wysiewanie mysich komórek AF
    1. Na dzień przed wysiewem należy przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą żelatyną o splocie 0,1% z MEF nasączonym mitomycyną C.
    2. Po pobraniu AF wysiewać komórki uzyskane z amniopunkcji (około 1 x 107 komórek uzyskanych z 6 płodów) na mitotycznie inaktywowany MEF za pomocą pożywki hodowlanej AF.
    3. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , zmieniając podłoże co drugi dzień.
    4. Po 7 dniach hodowli należy przetransfekować komórki AF zgodnie z procedurą opisaną poniżej.

5. Transfekcja, Generacja i Hodowla Komórek iPS-AF

UWAGA: Mysie komórki AF były transfekowane plazmidem transpozonu PB-tetO2-IRES-OKMS, w połączeniu z plazmidem ekspresji transpozazy (mPBazą) i plazmidem transpozonu transkryptonowej z odwrotnym transcykliną (PB-CAG-rtTA). Wszystkie plazmidy zostały dostarczone przez profesora Andrasa Nagya33.

  1. Zmieszać 1 μg PB-tetO2-IRES-OKMS z 0,5 μg mPBazy i 0,5 μg PB-CAG-rtTA (całkowite DNA: 2 μg) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Rozcieńczyć DNA do 100 μl pożywką bez surowicy (Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM).
  3. Dodać 8 μl odczynnika do transfekcji (np. FUGENE) (w stosunku plazmidowego DNA:czynnika transfekcji 2 μg (DNA) do 8 μl środka do transfekcji) do 1,5 ml probówki do mikrowirówki zawierającej DNA.
  4. Inkubować mieszaninę odczynnika do transfekcji/DNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać kroplami 100 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji/DNA na studzienkę do 6-dołkowej płytki z mysimi komórkami AF i rozprowadzić przez delikatne wirowanie, z końcową objętością 2 ml / basenik. Wyjazd na 24 godziny.
  6. Następnego dnia indukuj ekspresję czynników Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) poprzez karmienie komórek świeżą pożywką iPS-AF uzupełnioną 1,5 μg/ml doksycykliny (2 ml pożywki na każdą studzienkę).
  7. Karmić komórki codziennie, bez pasażu, świeżą pożywką zawierającą doks (utrzymywać komórki w pożywce uzupełnionej doksycykliną do ppkt 5.13).
  8. Obserwuj komórki w ciągu 24 godzin pod kątem ekspresji mCherry i codziennie pod kątem tworzenia kolonii (kolonie zwykle pojawiają się między 20 a 30 dniem po transfekcji).
  9. Dzień przed pobraniem kolonii należy przygotować 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z MEF potraktowanym mitomycyną C.
  10. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl należy pobrać pojedyncze kolonie o objętości 50 μl i przenieść je kolejno na 96-dołkową płytkę w osobnych dołkach.
  11. Następnego dnia należy rozdzielić każdą kolonię na pojedyncze komórki, dodając 50 μl komercyjnej trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  12. Pipetuj w górę iw dół, aby zdezagregować kolonię.
  13. Przenieść 50 μl trypsyny zawierającej zdysocjowaną kolonię do nowego dołka z inaktywowanym MEF na 0,1% pokrytej żelatyną 96-dołkowej płytce wypełnionej 100 μl świeżej pożywki iPS-AF uzupełnionej doksycykliną.
  14. Gdy komórki osiągną 60-70% konfluencji, podziel się na studzienkę 24-dołkowej płytki.
  15. Gdy komórki osiągną 60-70% konfluencji, podziel 1:2 na dwie studzienki, jedną z doksycykliną, a drugą bez doksycykliny, aby sprawdzić, czy kolonie pojawiają się również w stanie bez doksycykliny.
  16. Kontynuuj utrzymywanie klonów iPS-AF, niezależnych od doksycykliny, na inaktywowanym MEF w pożywce iPS-AF.
  17. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , codziennie zmieniając podłoże.

6. Barwienie fosfatazą alkaliczną

  1. Barwienie fosfatazą alkaliczną należy wykonywać zgodnie z protokołem producenta za każdym razem, gdy pojawiają się komórki iPS-AF niezależne od doksycykliny.

7. Immunofluorescencja

  1. Za każdym razem, gdy pojawiają się komórki iPS-AF niezależne od doksycykliny, należy wysiać 150 000 komórek/cm2 na dołku 24-dołkowej płytki z inaktywowanym MEF i hodować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. (UWAGA) Utrwal komórki, dodając 300 μl na studzienkę 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodaj 300 μl 0,1% NP-40, aby przepuszczalność komórek.
  4. Przepłukać komórki 300 μl 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Dodać 300 μl buforu blokującego (10% surowicy końskiej w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Należy stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) i SSEA1 (1:80). Rozcieńczyć SSEA1 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 10% normalną surowicą kozią, 0,3 M glicyną w 0,1% PBS-Tween-20. Rozcieńczyć wszystkie inne przeciwciała 10% surowicą końską w 1x PBS.
  7. Inkubować przeciwciała przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Przepłukać 300 μl 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Użyj przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w 10% surowicy końskiej w 1x PBS: Alexa594-sprzężone kozie anty-mysie IgG (1:200), Alexa594-sprzężone anty-kozie IgG kurczaka (1:200), Alexa594-sprzężone kurczaki anty-królicze IgG (1:200), Alexa568-sprzężone kozie anty-mysie IgM (1:200). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  10. Spłucz 1x PBS.
  11. Zabarwić jądra roztworem Hoechsta (1:10 000) w 1x PBS.

8. Różnicowanie komórek in vitro

  1. Aby uformować ciała zarodkowe z wiszącymi kroplami (EB), hoduj pojedyncze krople (2000 komórek/20 μl) na pokrywie szalek Petriego, używając pożywki różnicującej.
  2. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 dni.
  3. Przenieść EB do 100 mm szalek klasy bakteryjnej w kulturze zawiesinowej przez 3 dni w pożywce różnicującej.
  4. Płytka EB w 24 dołkach pokrytych matrycą membrany podstawnej (rozcieńczonej w stosunku 1:10 w DMEM) przez kolejne 14 dni.
  5. Do analiz immunofluorescencyjnych należy stosować przeciwciała pierwszorzędowe: T (1:100), αfp (1:200) i Tubb3 (1:500)37.

9. Powstawanie potworniaka in vivo

  1. Wstrzyknąć 100 μl 1x PBS zawierającego 1 x 106 komórek iPS-AF do mięśnia kończyny tylnej myszy Rag2-/-γc-/-.
  2. Ofiaruj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy 6 tygodni po wstrzyknięciu komórek.
  3. Usuń masy guza, wyróżniające się wielkością, z tylnej kończyny myszy w celu przeprowadzenia następujących analiz.
  4. Wytnij poprzeczne odcinki guza zamrożonego izopentanem o grubości 7-10 μm za pomocą kriostatu.
  5. Dla barwienia hematoksyliną i eozyną (HE):
    1. Wybarwić HE w celu oceny składu tkanki nowotworowej, zgodnie z protokołem producenta.
  6. Dla immunoperoksydazy Barwienie:
    1. Utrwal skrawki potworniaka za pomocą 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przepuszczalność 0,1% Triton X-100.
  7. Inkubować z następującymi przeciwciałami: Tubb3 (1:100), αfp (1:50) i αSMA (1:100) rozcieńczonymi w 1% BSA w 1x PBS. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (dla Tubb3) lub przez noc w temperaturze 4 °C (dla pozostałych przeciwciał).
  8. Zablokuj peroksydazę za pomocą 100% metanolu przez 20 min.
  9. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z mysim HRP (1:150).
  10. Spłucz 1x PBS.
  11. Inkubować z substratem peroksydazy (HRP) (patrz tabela materiałów) przez 5 minut.
  12. Płukać wodą z kranu przez 5 minut.
  13. Barwienie hematoksyliną QS przez 9 sek.
  14. Spłucz wodą z kranu.

10. Ekstrakcja RNA z komórek

  1. Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta.

11. Ekstrakcja RNA z potworniaka

  1. Homogenizować potworniaka za pomocą tłuczka i moździerza oraz ciekłego azotu, aby uniknąć rozmrożenia próbki.
  2. Zważyć 25 mg tkanki.
  3. Dodać 1 ml dostępnego w handlu odczynnika do ekstrakcji RNA i 200 μl chloroformu.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Wirować przy 13 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 min.
  6. Przenieść oczyszczony supernatant do nowej probówki.
  7. Aby oczyścić RNA, użyj dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.

12. Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją

  1. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy do odwrotnej transkrypcji (RT) - reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i oligo (dT) zgodnie z protokołem producenta, aby uzyskać 50 ng / μl cDNA. Rozcieńczyć cDNA wodą wolną od RNaz w stężeniu 10 ng/μL.
  2. Wykonaj RT-PCR przy użyciu polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta, wykorzystując 1 ng/μL cDNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu oceny zdolności do reprogramowania komórki AF myszy pozyskano od płodów myszy GFP. Komórki transfekowano kołkowym plazmidem transpozonu PB-tetO2-IRES-OKMS, który eksprymuje czynniki Yamanaki (Oct4, Sox2, cMyc i Klf4) połączone z fluorescencyjnym białkiem mCzerwonym w sposób indukowalny doksycykliną, oraz plazmidami zawierającymi odwrotnego transaktywatora tetrazykliny (PB-CAG-rtTA) wraz z plazmidem eksprymującym transpozazę (mPBase). Komórki AF myszy transfekowano genami Oct4, Klf4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda wybrana do uzyskania indukcji pluripotencji ma znaczenie dla klinicznego bezpieczeństwa komórek w odniesieniu do długotrwałego przeszczepiania. Obecnie istnieje kilka metod odpowiednich do przeprogramowania. Wśród metod nieintegracyjnych wektor wirusowy Sendai (SeV) jest wirusem RNA, który może wytwarzać duże ilości białka bez integracji z jądrem zakażonych komórek40 i może być strategią pozyskiwania komórek iPS. Wektory SeV mogą być atrakcyjnym kandydatem do generowania komórek iPS klasy t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację CARIPARO Grant numer 13/04 oraz Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant numer 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin i Michela Pozzobon są finansowane przez Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin jest finansowana przez Fundację CARIPARO w ramach grantu nr 13/04. Paolo De Coppi jest finansowany przez Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bakteryjne szalki Petriego 100 mm BD Falcon351029Do in vitro różnicowanie
2-merkaptoetanolu SigmaM6250Dla mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicowej
Alexa568-sprzężone kozie anty-mysie IgM Thermo Fisher ScientificA21043Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)
Alexa594-sprzężone przeciwciało anty-kozie kurczaka IgG Thermo Fisher ScientificA21468Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)
Alexa594-sprzężone z kurczakiem IgG przeciwko królikowi Thermo Fisher ScientificA21442Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)
Alexa594-sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie IgG Thermo Fisher ScientificA11005Przeciwciało drugorzędowe (immunofluorescencja)
Zestaw fosfatazy alkalicznej Sigma85L1Fosfataza alkaliczna  barwienie
AmpicylinaSigmaA0166Do selekcji bakteryjnej
Albumina surowicy bydlęcej SigmaA7906BSA, do rozwiązania blokującego. Rozcieńczony w PBS 1x
ChloroformSigmaC2432Do ekstrakcji RNA
Komórki DH5&alphaThermo Fisher Scientific18265-017Bakterie do procedury
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039Do MEF, mysich komórek AF, komórek iPS-AF i pożywki
różnicującejDoksycyklina SigmaD9891Do wyrażania czynników egzogennych
Probówki wirówkowe (1,5 ml) Sarstedt 72.706Do produkcji PB 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024Do mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicowej
FBS Thermo Fisher Scientific10270106Do MEF średnie
Kleszcze drobnopunktoweF.S.TDumont #5 Izolacja AF
ŻelatynaJ.T.Baker131Używana 0,1%, rozcieńczona w PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718Do roztworu blokującego. Rozcieńczony w PBS 1x
Hematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Detekcja jąder
HE Bio-Optica04-061010Analiza histologiczna potworniaka
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Wykrywanie jąder
Serum dla koni Thermo Fisher Scientific16050-122Do roztworu blokującego
IgG myszy przeciw mysim kozom sprzężonym z HRPSantaCruzsc2005Przeciwciało drugorzędowe (immunoperoksydaza)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Podłoże peroksydazy
Strzykawka insulinowa z igłą (25 G)TerumoSS+01H25161Procedura amniopunkcji
Klf4 SantaCruzsc-20691Królik poliklonalny IgG
L-glutamina Thermo Fisher Scientific25030Do mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicującej
LB bulion (Lennox)SigmaL3022Do wzrostu bakterii
LIF SigmaL5158Do mysich komórek AF i iPS-AF średni
Matrigel BD354234Do różnicowania in vitro. Rozcieńczony w stosunku 1:10 w DMEM
MetanolSigma32213Blokowanie peroksydazy
MULTIWELL 24-dołkowa płytkaBD Falcon353047Do różnicowania in vitro
Płytka 6-dołkowa MULTIWELLBD Falcon353046Do hodowli komórek MEF, myszy AF i iPS-AF
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FKrólicze poliklonalne IgG
Aminokwasy endogenne SigmaM7145Dla mysich komórek AF, iPS-AF i pożywki różnicującej
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000Do roztworu blokującego. Rozcieńczony w PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0Do przepuszczalności komórek. Rozcieńczony w PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Mysi monoklonalny IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012Do RT-PCR
Paraformaldehyd (roztwór)Sigma441244PFA, utrwalacz, rozcieńczony w PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, wolny od Ca2+/Mg2+. Rozcieńczony sterylną wodą w celu uzyskania PBS 1x
Penicylina - Streptomycyna Thermo Fisher Scientific15070063Do MEF, mysich komórek AF, komórek iPS-AF i pożywki różnicującej
Szalka Petriego (150 mm)BD Falcon353025Do hodowli MEF, hodowli tkankowej
PiggyBac ekspresja transpozazy plazmid Dostarczone przez profesora Andrasa Nagyalaboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transpozonowy plazmidDostarczone przez profesora Andrasa Nagyalaboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663Do oczyszczania plazmidów
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Do oczyszczania
plazmidówOdwrócony transaktywator tetracykliny transpozonowy plazmid Dostarczone przez profesora Andrasa Nagyalaboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134Do ekstrakcji RNA
Sox2 SantaCruzsc-17320Kozia poliklonalna IgG
SSEA1 Abcamab16285Mysz monoklonalna IgM
SuperScript II Odwrotna transkryptaza Thermo Fisher Scientific18064-014Do RT-PCR
T Abcamab20680Poliklonalna
polimeraza DNAIgG Taq Thermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsyna Thermo Fisher Scientific25300-054Pasażowanie kultur komórkowych
Triton X-100Bio-Rad161-047Do przepuszczalności komórek, rozcieńczony w PBS 1x
odczynnik TRIzolThermo Fisher Scientific15596-026Do ekstrakcji
Tubb3   Promega G712AMysi monoklonalny IgG1
TWEEN-20SigmaP1379Do przenikania komórek, rozcieńczony w PBS 1x
α FP     R& Systemy DMAB1368mysi monoklonalny IgG1
αSMA Abcamab7817Mysi monoklonalny
(FuGENE HD)Promega E2311Do transfekcji komórek AF
Mikroskop stereoskopowyNikonSM2645Do wykonywania amniopunkcji 
200 μ l końcówkiSarstedt 70.760012Do zbierania kolonii bakterii
NożyczkiF.S.T14094-11 nierdzewne 25UDo wykonywania amniopunkcji 
EtanolSigma2860Do czyszczenia ściany brzucha ciężarnej matki
Szalka Petriego do hodowli tkankowych (150 mm) BD Falcon353025Do ekspansji MEF
Mitomycyna CSigmaM4287-2MGDo inaktywacji MEF
Płytka MULTIWELL 96 dołkówBD Falcon353071Do hodowli iPS-AF
klonowania królika RNA odczynnik do transfekcji IgG2a

Bibliografia

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeprogramowanie kom rek iPSr nicowanie w kierunku warstw zarodkowychtworzenie potworniak wmikroskopia fluorescencyjnaanaliza RT PCRindukcja doksycyklinkom rki zasilaj ce MEF

Powiązane artykuły