Artykuł metodologiczny

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

DOI:

10.3791/54603

⸱

6 października 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty do miejsc wtórnych, takich jak płuca, wątroba i kości, to traumatyczne zdarzenie ze śmiertelnością około 90% 1. Spośród tych miejsc płuca są najtrudniejsze do oceny za pomocą przyżyciowego obrazowania optycznego ze względu na ich zamknięte położenie w ciele, delikatną naturę i istotną rolę w utrzymaniu prawidłowej fizjologii. Podczas gdy metody kliniczne (pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i tomografia komputerowa (CT)) są w stanie zapewnić nieinwazyjne obrazy tej tkanki, brakuje im rozdzielczości niezbędnej do wizualizacji najwcześniejszych zdarzeń zasiewu, z pojedynczym pikselem składającym się z prawie tysiąca komórek. Obecne modele przerzutowego wysiewu płuc postulują, że zdarzenia tuż po przybyciu komórki nowotworowej są deterministyczne dla przeżycia i późniejszego wzrostu. Oznacza to, że narzędzia do obrazowania przyżyciowego w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczej komórki 2 są niezbędne do zdefiniowania fenotypów komórek zasiewających i przetestowania tych modeli. Podczas gdy obrazowanie optyczne płuc w wysokiej rozdzielczości zostało przeprowadzone przy użyciu różnych preparatów ex vivo, eksperymenty te są zazwyczaj testami pojedynczych punktów czasowych i są podatne na artefakty i możliwe błędne wnioski z powodu dramatycznie zmienionego środowiska (temperatura, profuzja, cytokiny itp.) wynikającego z usunięcia z jamy klatki piersiowej i układu krążenia 3. Ostatnie prace wykazały, że poklatkowe przyżyciowe obrazowanie optyczne nienaruszonego płuca jest możliwe przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania 2,4,5, jednak typowe czasy obrazowania zostały ograniczone do około 6 godzin. W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania długoterminowego przyżyciowego obrazowania poklatkowego płuc z wykorzystaniem takiego okna przez okres 12 godzin. Sekwencje obrazów poklatkowych uzyskane tą metodą umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie interakcji komórka-komórka, dynamiki błony i perfuzji naczyniowej w płucach. Dalej opisujemy technikę przetwarzania obrazu, która daje bezprecedensowo wyraźny obraz mikrokrążenia płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie optyczne o wysokiej rozdzielczości okazało się kluczowe dla zrozumienia wielu procesów biologicznych, umożliwiając pomiar i ilościowe określenie parametrów jednokomórkowych i subkomórkowych. W badaniach nad rakiem obrazowanie przyżyciowe komórek guza i zrębu doprowadziło do odkrycia wielu interakcji mikrośrodowiskowych 6-11, które są obecne tylko u nienaruszonego zwierzęcia.

Odkrycia dotyczące mikrośrodowisk związanych z wewnątrznaczyniowością i rozprzestrzenianiem się komórek nowotworowych w raku piersi za pomocą obrazowania optycznego in vivo o rozdzielczości pojedynczej komórki doprowadziły nawet do powstania nowych markerów rokowania i odpowiedzi na leczenie u pacjentek z rakiem piersi w wieku 12-16 lat. Najlepszymi dostępnymi technologiami obrazowania do oglądania w głąb nienaruszonych narządów wewnętrznych są metody kliniczne (MRI, PET, CT), które oferują doskonały widok całego narządu i mogą ujawnić patologie jeszcze przed wystąpieniem objawów klinicznych. Nie są jednak w stanie ujawnić najwcześniejszych etapów przerzutów i mechanizmów komórkowych napędzających postęp nowotworu ze względu na brak rozdzielczości pojedynczej komórki. Zanim przerzuty do płuc staną się widoczne w tych modalnościach, są one dobrze ugruntowane i rozprzestrzeniają się. Biorąc pod uwagę szacunki, że 90% rozsianych komórek nowotworowych, które docierają do płuc, albo nie przeżywa 17, albo początkowo pozostaje uśpionych 18, oraz obserwację, że przybywają znacznie wcześniej niż wcześniej oczekiwano 19, obrazowanie najwcześniejszych etapów przybycia i przeżycia staje się kluczowe dla zrozumienia procesu wysiewu przerzutów i nawrotu wzrostu guza w odległych miejscach.

Przeprowadzenie tych obserwacji w płucach okazało się jednak niezwykle trudne; zdecydowana większość badań obrazowych wykorzystywała preparaty ex vivo lub eksplantacyjne 20-23, które dają wgląd w płuca tylko w pojedynczych punktach czasowych. Chociaż preparaty te dostarczają użytecznych informacji, nie dają pełnego zrozumienia interakcji, związków przyczynowo-skutkowych oraz dynamiki zachodzących między różnymi składnikami mikrośrodowiska. Brak prawidłowego układu krążenia (i towarzyszące mu zachwianie homeostazy) oraz odłączenie od reszty układu odpornościowego organizmu skłania do walidacji wniosków, jakie preparaty te generują w nienaruszonej tkance in vivo.

Wiele grup przeprowadziło obrazowanie śródżyciowe nienaruszonego płuca 2,4,5,24-33, przy czym Wearn i German jako pierwsi chirurgicznie odsłonili warstwę opłucnową 24, a Terry jako pierwsi wykorzystali wszczepialne okno obrazowania 25.

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w płucach jest znacznie utrudnione przez ciągły ruch płuc i opracowano kilka technik, aby przezwyciężyć to ograniczenie. Wagner i Filley (27) badali naturalny ruch płuc psów i zaprojektowali swój protokół chirurgiczny, aby zlokalizować wszczepione okno w stosunkowo nieruchomym obszarze, podczas gdy Wagner wykorzystał podciśnienie w swoim przygotowaniu chirurgicznym do unieruchomienia tkanki 28. Od tego czasu do obrazowania płuc stosuje się różne techniki, w tym: zaciskanie oskrzeli, sekwencyjny bezdech i obrazowanie bramkowane, akwizycja nadpróbkowana, klejenie płata płuc i próżnia 34. Każda z nich ma swoje zalety i wady i żadna technika nie okazała się lepsza od innych 34. Na przykład zaciskanie oskrzeli i sekwencyjny bezdech zmieniają normalną wymianę gazów w płucach i mogą powodować niedodmę. Obrazowanie bramkowane i akwizycja z nadpróbkowaniem nie mają tych wad, ale wymagają szybkiego lub specjalistycznego sprzętu do obrazowania, który nie jest powszechnie dostępny. Wreszcie, zarówno klejenie płuc, jak i technika próżniowa pozwalają uniknąć obu wyżej wymienionych wad, ale mogą wykazywać obrażenia wywołane siłą ścinającą, jeśli nie zostanie zachowana ostrożność. W ostatnich latach okno próżniowe zostało zminiaturyzowane i przystosowane do stosowania u myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej 4,5,33 i uzyskano doskonałe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości 2. Tabela 1 podsumowuje tę bogatą historię i podkreśla te prace, które opisują nowatorskie postępy w stosowaniu okien obrazowania płuc w trybie przyżyciowym.

Ten protokół opisuje użycie rozszerzonej poklatkowej wielofotonowej mikroskopii przyżyciowej do obrazowania przerzutów w żywym, nienaruszonym płucu z najwyższą możliwą rozdzielczością subkomórkową. Obrazy są pozyskiwane przez okres do 12 godzin za pomocą mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w obiektyw o dużej aperturze numerycznej i detektory z wieloma lampami fotopowielaczy (PMT). Transgeniczne modele myszy są wykorzystywane do fluorescencyjnego znakowania natywnych makrofagów wraz z fluorescencyjnym dekstranem o wysokiej masie cząsteczkowej i transfekowanymi komórkami nowotworowymi z białkiem fluorescencyjnym (w celu znakowania odpowiednio naczyń krwionośnych i komórek nowotworowych). Chociaż ten wybór komórek znakowanych fluorescencyjnie umożliwia wizualizację interakcji i dynamiki komórek nowotworowych-śródbłonka-makrofagów, protokół ten będzie działał dla każdego szczepu myszy fluorescencyjnej lub niefluorescencyjnej. Po nabyciu szczątkowy ruch dryfu (jeśli występuje) jest eliminowany za pomocą wtyczki Fiji 35,36 i niestandardowych makr, które uśredniają czas kanału naczyniowego, aby wyeliminować spowodowane przez nieznakowane krążące krwinki.

Chociaż ten protokół skupia się na obrazowaniu przerzutów, techniki te mają zastosowanie do wielu innych procesów biologicznych, które można obserwować za pomocą obrazowania pojedynczych komórek w płucach w wysokiej rozdzielczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystania kręgowców, w tym z uprzednią zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Albert Einstein College of Medicine.

1. Generowanie fluorescencyjnie znakowanego modelu myszy i komórek nowotworowych

  1. Przygotować 100 ml 0,1 % (m/v) buforu soli fizjologicznej buforowanej albuminą/fosforanem w surowicy bydlęcej (BSA/PBS), mieszając 0,1 g BSA ze 100 ml PBS.
  2. Przygotować znakowane fluorescencyjnie komórki nowotworowe przez stabilną transfekcję.
    UWAGA: Tutaj używamy komórek E0771-LG, wysoce przerzutowej pochodnej komórek gruczolakoraka sutka myszy E0771 37, które zostały wyizolowane z guzów przerzutowych rozwiniętych w płucach myszy C57BL / 6, którym wstrzyknięto dożylnie rodzicielskie komórki E0771 38.
    1. 24 godziny przed transfekcją, umieścić 1 x 10 5 komórek EO771-LG na naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm na 2 ml wolnego od antybiotyków 10% FBS (płodowej surowicy bydlęcej) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .
    2. W czasie transfekcji inkubować 2 μg fluorescencyjnego wektora białkowego z 10 μl odczynnika do transfekcji przez 30 minut, a następnie dodać 190 μl zredukowanej pożywki surowicy.
    3. Umyj komórki EO771-LG solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (D-PBS) i delikatnie dodaj mieszankę transfekcyjną.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 6 godzin.
    5. Przemyć transfekowane komórki i hodowlę w 2 ml kompletnego DMEM (10% FBS, 1 mM pirogronianu, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) przez 2 dni.
    6. Przemyć komórki 2 ml sterylnego PBS, dodać 500 μl 0,25 % trypsyny-EDTA i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
    7. Zebrać zawiesinę komórek i wymieszać z co najmniej 1 objętością kompletnego DMEM i odwirować w momencie 280 x g.
    8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego DMEM i rozszerzyć hodowlę komórkową do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej.
    9. Rozpocznij selekcję transfekowanych komórek od dodania 700 μg/ml selektywnego antybiotyku G418 do 8 ml kompletnego DMEM i hodowli przez tydzień, zmieniając pożywkę co trzy dni.
  3. Wzbogać populację fluorescencyjną z transfekowanych komórek, które zostały poddane selekcji w G418 przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) 39,40.
    1. Umyj komórki 5 ml PBS i dodaj 1,5 ml 0,25% trypsyny.
    2. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C i wymieszać z co najmniej jedną objętością kompletnego DMEM.
    3. Zebrać zawiesinę komórek i odwirować w temperaturze 280 x g, a następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml sterylnego 0,1 % (w/v) buforu BSA/PBS.
    4. Przefiltrować zawiesinę komórek przez siatkę 40 μm i dostosować objętość do 1 ml z 0,1 % buforem BSA/PBS do sortowania.
    5. FACS - sortuj 10% najjaśniejszej populacji na podstawie widma fluorescencji za pomocą sortera FACS 41.
    6. Hodować posortowane komórki przez kolejny tydzień pod kontrolą selekcji (700 μg/ml G418 w kompletnym DMEM).
    7. Ponownie wybierz fluorescencyjnie znakowane komórki za pomocą cytometrii przepływowej, powtarzając kroki od 1.3.1 do 1.3.6 po raz kolejny.
    8. Po drugiej rundzie selekcji trypsynizuj, filtruj i ponownie zawieszaj komórki w 0,1% BSA/PBS, jak opisano (kroki 1.3.1-1.3.4). Dostosuj stężenie do 2 x 106 komórek/ml do sortowania pojedynczych komórek na 96-dołkowe płytki za pomocą sortera FACS.
    9. Przygotować 3-5 96-dołkowych płytek ze 100 μl pełnego DMEM do pobrania. Aby poprawić przeżywalność po sortowaniu, dodaj 100 μl przefiltrowanej pożywki hodowlanej z szalek, w których hodowano komórki EO771-LG 42.
    10. Po posortowaniu komórek na płytki 96-dołkowe, należy przywrócić komórki do hodowli na 2 dni (37 °C, 5% CO2 ).
    11. Zidentyfikuj studzienki z żywotnymi pojedynczymi klonami, badając je pod odwróconym mikroskopem przy 5-krotnym powiększeniu.
    12. Trypsynizuj i rozwijaj żywotne klony oraz zamrażaj komórki w celu wykonania kopii zapasowej.
      1. Umyj studzienki z rosnącymi klonami za pomocą 100 μl sterylnego PBS. Dodać 50 μl 0,25% w/v trypsyny i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać 50 μl kompletnego DMEM i przenieść na sterylną 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V lub okrągłodenną, aby wirować przy 280 x g przez 5 minut.
      2. Zawiesić komórki w 100 μl 700 μg/ml G418 complete DMEM i umieścić każdy klon na płytkach 12-dołkowych. Dodać 400 μl kompletnego DMEM z G418 i hodować aż do zlewu.
      3. Przemyć studzienki 500 μl PBS, dodać 100 μl 0,25% trypsyny i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać 100 μl kompletnego DMEM i wirować przez 5 minut przy 280 x g. Ponownie zawiesić komórki w 100 ul kompletnego DMEM z G418 i komórki płytkowe w 6-dołkowych płytkach aż do zlewania się.
      4. Po zlaniu trypsynizuj komórki, odwiruj i ponownie zawieś w 10% DMSO w FBS, aby zamrozić zapasy komórek.
      5. Przechowywać 1/10 zawiesin komórkowych w hodowli, posiewając je na 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych w celu oceny ich potencjału przerzutowego.
  4. Zbadaj potencjał przerzutowy wybranych klonów.
    1. Trypsynizuj i ponownie zawiesić komórki w soli fizjologicznej do stężenia 2,5 x 106 komórek/ml i wstrzyknij 200 μl myszom C57BL/6 dożylnie przez żyłę ogonową.
    2. Po 2 tygodniach należy pobrać tkankę płucną zgodnie z wcześniejszym opisem 23 i określić ilościowo obciążenie guza za pomocą liczby powierzchni lub metody stereologicznej 43. Wybierz klony o wysokim potencjale przerzutowym do obrazowania przyżyciowego.
  5. Raise MacBlue (specyficzny dla mieloidu promotor napędzający ekspresję białka cyjanowej fluorescencji (CFP) (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP16)) myszy reporterowe 44,
    UWAGA: Zazwyczaj używa się myszy w wieku od 8 do 12 tygodni, ale myszy już w wieku od 7 do 20 tygodni również zostały przetestowane pod kątem działania.

2. Konfiguracja mikroskopu wielofotonowego i przygotowanie do obrazowania

UWAGA: Chociaż ten protokół może być wykonany na dowolnym mikroskopie wielofotonowym, system używany do pozyskiwania danych pokazanych w tym protokole został wcześniej szczegółowo opisany 45.

  1. Włącz wszystkie elementy mikroskopu i lasera, w tym lasery dwufotonowe i detektory, co najmniej godzinę przed żądanym czasem obrazowania.
  2. Tuż przed zabiegiem zmierz moc światła dopływającego do mikroskopu, umieszczając głowicę miernika mocy optycznej na ścieżce wiązki tuż przed mikroskopem i wyreguluj pokrętła lustra wnęki końcowej lasera, aż maksymalne natężenie światła przy 880 nm zostanie odczytane na mierniku mocy optycznej.

3. Konfiguracja systemu próżniowego

  1. Przykleić szkiełko nakrywkowe do okienka obrazowania (rysunek uzupełniający 1) za pomocą cyjanoakrylanu. Odczekaj co najmniej 4 godziny, aż klej całkowicie wyschnie.
    UWAGA: Ten krok można również wykonać z wyprzedzeniem.
  2. Odetnij końcówkę pipety o pojemności 100 μl w pierwszej linii od małego otworu i podłącz nieodcięty koniec do cienkiego węża próżniowego.
  3. Podłącz system próżniowy zgodnie z rysunkiem 1 i rysunkiem uzupełniającym 2.
  4. Przy włączonym podciśnieniu i zablokowanym otwartym końcu wyreguluj regulator podciśnienia na <3 inHg.
    UWAGA: Ostateczna regulacja poziomu podciśnienia zostanie przeprowadzona poprzez obserwację układu naczyniowego in vivo.
  5. Nałóż cienką warstwę smaru naftowego na spód płytki obrazowej, aby zapobiec odprowadzaniu medium zanurzeniowego soczewki obiektywu przez płytkę obrazową.
  6. Umieść płytkę obrazową na stoliku mikroskopu.
    UWAGA: Niestandardowa płyta obrazowa (rysunek uzupełniający 3) to arkusz aluminium o grubości 1/8 cala, obrobiony zarówno tak, aby zmieścił się w przestrzeni wkładki stolika, jak i z otworem przelotowym pośrodku do przytrzymania okienka obrazowania.
  7. Włóż okienko próżniowe do płytki obrazowej szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół.
  8. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie i narzędzia, w tym płytkę sceniczną do obrazowania i okienko obrazowania, 70% etanolem.
  9. Podłącz odcięty koniec końcówki pipety do okienka podciśnieniowego i przyklej wąż do płytki obrazowej.
  10. Zbliż obiektyw do okienka obrazowania i umieść dużą kroplę wody między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym.
  11. Upewnij się, że nie ma wycieków z szkiełka nakrywkowego, blokując centralny otwór okienka podciśnienia i sprawdzając, czy kropla wody między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym nie została zassana.
    UWAGA: Kulka myszy komputerowej w starym stylu umieszczona nad oknem jest przydatna do blokowania centralnego otworu.

4. Chirurgia

  1. Przygotuj sterylne pole operacyjne.
    1. Umieść wszystkie instrumenty w zasięgu ręki. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie i narzędzia, w tym obszar operacyjny i narzędzia chirurgiczne, za pomocą 70% etanolu.
  2. Przywiąż szew 2-0 o długości 3 cali do cewnika, 1/4 cala nad tuleją za pomocą podwójnego węzła.
  3. Przygotować cewnik do żyły ogonowej zgodnie z opublikowanym protokołem Harney i wsp. 46.
  4. Używając lampy grzewczej na podczerwień (IR), ogrzej zwierzę w klatce przez ~5 minut, aby zwiększyć przepływ krwi w żyle ogonowej i pomóc we wprowadzeniu cewnika. Zaleca się utrzymywanie zwierzęcia w cieple do temperatury fizjologicznej przez cały zabieg chirurgiczny za pomocą lampy grzewczej lub podkładki rozgrzewającej.
  5. Znieczulić zwierzę 5% izofluranem i sprawdzić, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  6. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia.
  7. Nałóż balsam do depilacji na 10-30 sekund, aby usunąć sierść z lewej strony zwierzęcia; od linii środkowej klatki piersiowej do 1/4 grzbietu i od pachy do tuż pod klatką piersiową.
  8. Usuń nadmiar balsamu i wysterylizuj odsłoniętą skórę 70% alkoholem.
  9. Przymocuj sterylną strzykawkę wypełnioną PBS do cewnika do żyły ogonowej i włóż taśmę zgodnie z opublikowanym protokołem przez Harneya i wsp. 46. Upewnij się, że taśma jest dobrze przyklejona do samej igły i nie jest wolna w szczelinie między ogonem a taśmą.
  10. Zaintubuj mysz zgodnie z opublikowanym protokołem przez Das i wsp. 47 lub przez DuPage i wsp. Rozdział 48
  11. Włączyć respirator i ustawić go tak, aby dostarczał 135 oddechów na minutę i 200 μl mieszaniny izofluranu i tlenu.
  12. Podłączyć cewnik dotchawiczy do respiratora.
  13. Przesuń mysz na obszar operacyjny. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie usunąć cewnika.
  14. Zawiąż szew 2-0 wokół pyska myszy pod przednimi zębami.
  15. Przyklej cewnik do pyska.
  16. Przyklej lewą kończynę przednią do cewnika, aby nie dostała się do pola operacyjnego.
  17. Zmniejsz znieczulenie izofluranem do poziomu podtrzymującego 2,5% i sprawdź, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  18. Za pomocą ostrych nożyczek usuń 1cm2 skóry powyżej lewej ściany klatki piersiowej.
  19. Podnieś poduszeczkę tłuszczową sutka i kauteryzuj wszelkie odsłonięte naczynia krwionośne za pomocą pisaka do kauteryzacji.
  20. Wytnij poduszeczkę tłuszczową, przecinając ostrymi nożyczkami.
  21. Usuń warstwę mięśniową aż do klatki piersiowej, tnąc ostrymi nożyczkami. Uważaj, aby nie przeciąć żyły pachowej biegnącej u podstawy kończyny przedniej.
  22. Użyj kleszczy, aby chwycić i podnieść 6. żebro. Za pomocą ostrych nożyczek trzymanych pod płytkim kątem (~5°) odetnij żebro w pobliżu krawędzi otworu w skórze. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotknąć odsłoniętej tkanki płucnej.
  23. Poszerz otwór w ścianie klatki piersiowej, aby odsłonić cały płat płuca, usuwając cztery kolejne żebra.
    Uwaga: Otwór powinien znajdować się w odległości co najmniej 5 mm od mostka, aby ominąć serce.
  24. Ostrożnie podnieś mysz, chwytając za ogon i cewnik dotchawiczy, a następnie przenieś mysz do etapu obrazowania mikroskopowego.
  25. Przy wyłączonym podciśnieniu napełnij komorę okna próżniowego PBS.
  26. Odwróć mysz i umieść odsłonięte płuco nad oknem obrazowania próżniowego.
  27. Powoli włącz próżnię do około 3-5 cali rtęci za pomocą zaworu kulowego.
  28. Umieść uprząż krępującą wykonaną z bibuły złożonej na pół dwa razy na klatce piersiowej myszy i przyklej taśmę do płytki sceny, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 2.
  29. Przypnij czujnik uda pulsoksymetru do górnej części uda zwierzęcia i uruchom oprogramowanie.
  30. Umieść komorę środowiskową na scenie i włącz ogrzewanie, aby utrzymać mysz w fizjologicznej temperaturze.
  31. Zmniejsz poziom izofluranu do 1-1,5 %, aby utrzymać znieczulenie i utrzymać przepływ krwi.

5. Obrazowanie przyżyciowe

  1. Zbliż soczewkę obiektywową o aperturze numerycznej (NA) 25 x 0,95 do szkiełka nakrywkowego i dodaj między nie dużą kroplę wody.
  2. Korzystając z trybu epifluorescencji, view kanał FITC i ustaw ostrość na tkance płucnej.
  3. Jeśli nie zostanie to zrobione przed operacją, wstrzyknij komórki nowotworowe przez cewnik żyły ogonowej.
    1. Odłączyć strzykawkę PBS od cewnika do żyły ogonowej.
    2. Załadować sterylną strzykawkę 100 μl zawiesiny komórek nowotworowych (2 x 10 7 komórek/ml w maksimum PBS).
      UWAGA: Ten krok można wykonać z wyprzedzeniem, aby zbadać docieranie komórek rakowych do płuc w różnych punktach czasowych.
    3. Połączyć strzykawkę z komórkami nowotworowymi na cewniku żyły ogonowej.
    4. Powoli wstrzyknij komórki nowotworowe do żyły ogonowej.
    5. Odłączyć strzykawkę z komórkami nowotworowymi od cewnika żyły ogonowej.
    6. Ponownie podłączyć strzykawkę PBS do cewnika do żyły ogonowej.
      UWAGA: Zidentyfikuj lokalizacje wszystkich komórek nowotworowych przed wstrzyknięciem dekstranu, ponieważ trudno jest odróżnić komórki nowotworowe od sygnału dekstranu przez oko po wstrzyknięciu.
  4. Zlokalizuj komórki nowotworowe do obrazu
    1. Aby obrazować poszczególne komórki nowotworowe, zlokalizuj wszystkie komórki nowotworowe i zarejestruj ich lokalizację za pomocą wielopunktowego panelu oprogramowania.
      1. Zlokalizuj wszystkie pola widzenia do obrazu, obserwując komórki nowotworowe w okularze mikroskopu.
      2. W oprogramowaniu przełącz się na panel wielopunktowy, klikając przycisk Wielopunktowy i zapisz lokalizację komórki, klikając przycisk Dodaj pozycję.
    2. W przypadku obrazowania mozaiki zlokalizuj początek mozaiki i ustaw współrzędne obrazowania
      1. Zlokalizuj pozycję w lewym górnym rogu struktury, która ma zostać przechwycona.
      2. Wyzeruj współrzędne x, y i z stolika, naciskając przycisk "Zero" na kontrolerze sceny.
      3. Załaduj odpowiednią listę współrzędnych mozaiki, klikając przycisk "Załaduj" i wybierając listę.
        UWAGA: Przykładowa lista dla mozaiki 2 x 2 z 20% zachodzeniem na siebie pola widzenia 500 μm to: Poz. 1 = (0,0), Poz. 2 = (400,0), Poz. 3 = (0,400), Poz. 4 = (400,400).
  5. Wyjąć strzykawkę z PBS w cewniku do żyły ogonowej i zastąpić strzykawką zawierającą dekstran.
  6. Powoli wstrzyknąć do 100 μl 20 mg / ml 155 kDa rodaminy-dekstranu rozpuszczonego w PBS do myszy przez cewnik do żyły ogonowej, a następnie wstrzyknąć 50 μl sterylnego PBS w celu przepłukania linii. Nie wprowadzaj żadnych pęcherzyków powietrza do linii. W razie potrzeby należy wstrzyknąć dekstran co najmniej godzinę po wstrzyknięciu komórki rakowej, tak aby całkowita objętość podana myszy nie przekraczała 4 ml/kg/godz.
  7. Ustawianie parametrów obrazowania.
    1. Przełącz mikroskop w tryb wielofotonowy.
    2. Ustaw powiększenie na współczynnik 2X, klikając przycisk Sygnały czasowe i aktualizując pole Współczynnik powiększenia.
    3. Dostosuj moc lasera do ~10 % (~10-15 mW na próbce), klikając przycisk Detektory i laser, a następnie ustawiając suwak Moc tsunami na 10.
  8. Zobrazuj każdą lokalizację, aby zweryfikować obecność komórek nowotworowych i zobrazować przepływ i integralność układu krwionośnego.
    UWAGA: Naczynia powinny wydawać się w pełni ukrwione z przepływającymi erytrocytami, a fluorescencyjny dekstran powinien być zawarty w naczyniach bez przecieku do przestrzeni pozanaczyniowych. Oczekuje się, że około 10 - 20 komórek nowotworowych znajdzie się w przezroczystym otworze okna próżniowego.
  9. Dostosuj głębokość początkową każdej lokalizacji, która ma zostać zobrazowana.
    1. Dla każdej lokalizacji dostosuj pozycję z, obracając pokrętło ostrości na stage kontrolerze, aby zobrazować górny wycinek komórki nowotworowej.
    2. Umieść komórkę na środku pola widzenia.
    3. Kliknij przycisk Multipoint, kliknij pozycję pola widzenia, aby je podświetlić, a następnie kliknij przycisk Dodaj, a następnie przycisk Usuń, aby zastąpić zapisaną pozycję komórki na liście punktów wielopunktowych.
    4. Obserwuj wzrokowo względną jasność komórki nowotworowej w każdej pozycji.
  10. Zapisz nowe lokalizacje każdej z komórek, klikając przycisk Zapisz w panelu Wielopunktowy i określ nazwę pliku.
  11. Aby zobrazować pojedyncze komórki nowotworowe, wybierz trzy komórki o mniej więcej równoważnej jasności i usuń wszystkie inne lokalizacje z listy wielopunktowej, klikając ich lokalizację na liście, a następnie klikając przycisk Usuń.
  12. Kliknij przycisk Detektory i laser i dostosuj suwaki wzmocnienia PMT kanałów zielonego i czerwonego 45, tak aby sygnały były poniżej nasycenia.
  13. Dostosuj suwak dla kanału niebieskiego 45 tak, aby makrofagi były cyjan.
    UWAGA: Każdy drugi sygnał harmoniczny pojawi się tylko w kanale niebieskim i może zostać oddzielony od makrofagów cyjanowych, postępując zgodnie z procedurą odejmowania kanału opisaną wcześniej 45.
  14. Ustaw głębokość początkową stosu z na 0 μm, a głębokość końcową na 24 μm, przesuwając stolik z do lokalizacji i klikając odpowiednio przyciski Początek i Koniec.
    UWAGA: Komórki na tej głębokości zostaną zobrazowane z najlepszym sygnałem do szumu i rozdzielczością.
  15. Ustaw rozmiar kroku z na 3 μm.
  16. Ustaw parametry obrazowania zgodnie z parametrami opisanymi wcześniej 45,49.
    1. Aby zobrazować poszczególne komórki nowotworowe, kliknij przycisk Timing Signals, a następnie wprowadź 4 V w polu współczynnika powiększenia (co odpowiada współczynnikowi powiększenia 1,5x), wprowadź 3 w polu średnich klatek i kliknij przycisk Time-Lapse i wprowadź 10 w polu Poklatkowym.
      UWAGA: Te ustawienia będą pobierać 1 klatkę co 3 sekundy.
    2. W przypadku obrazowania mozaikowego kliknij przycisk Timing Signals i wprowadź współczynnik powiększenia 1.5 V (odpowiednik współczynnika powiększenia 4X), wprowadź 3 w liczbie średnich klatek i kliknij przycisk Time-Lapse i wprowadź 10 w polu opóźnienia poklatkowego.
      UWAGA: Te ustawienia będą pobierać 1 klatkę co 3 sekundy.
  17. Włącz tryby obrazowania wielopunktowego, z-stack i t-lapse, klikając ich przyciski.
  18. Naciśnij przycisk nagrywania, aby pobrać images.
    UWAGA: Tkanka płucna jest bardzo delikatna i podatna na fotouszkodzenia. Jeśli po obrazowaniu poklatkowym przepływ krwi w obrazowanym polu ustanie, laser najprawdopodobniej jest zbyt wysoki i kolejne obrazowanie innych pól musi być wykonane przy mniejszej mocy.
  19. Co 30-45 minut powoli wstrzykiwaj 50 μl PBS lub soli fizjologicznej, aby utrzymać nawodnienie zwierzęcia.

6. Eutanazja

  1. Zwiększyć stężenie izofluranu do 5%.
  2. Utrzymać zwierzę w ilości poniżej 5% izofluranu do 30 sekund po zaprzestaniu oddychania i usunąć zwierzę ze sceny.
  3. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić całkowitą eutanazję.

7. Analiza obrazu

  1. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem pojedynczych komórek:
    1. Załaduj obrazy na Fidżi i sformatuj je jako Hyperstack.
    2. Dla każdego wycinka z w Hyperstack odtwórz film poklatkowy i poszukaj szczątkowego ruchu x-y. Jeśli zostanie znaleziony szczątkowy ruch x-y, zastosuj wtyczkę o nazwie StackReg 36 do stosu, aby wyeliminować ruch.
  2. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem mozaikowym:
  3. Załaduj obrazy do Fidżi i zszyj je ze sobą, otwierając makro Mosaic Stitching (plik kodu uzupełniającego Mosaic Stitching) i wprowadzając informacje o obrazach, takie jak katalog, nazwa podstawowa pliku, liczba pól x i y w mozaice oraz liczba wycinków i punktów czasowych.
    UWAGA: Ze względu na sposób, w jaki Java interpretuje katalogi, nazwy folderów muszą mieć dwa ukośniki odwrotne jako separatory podfolderów. Ze względu na ograniczenia we wbudowanej wtyczce Pairwise Stitching, podstawowe nazwy plików nie mogą zawierać żadnych myślników.
  4. Aby uzyskać wyraźny widok granic układu krwionośnego, należy uśrednić wszystkie punkty czasowe kanału krwionośnego w jednym obrazie, a następnie powtórzyć ten obraz jako tło dla każdej klatki filmu innych kanałów.
    UWAGA: Odbywa się to po prostu poprzez uruchomienie makra Wykonaj uśrednianie krwi (plik kodu uzupełniającego Wykonaj uśrednianie krwi).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zaprezentować rodzaj wyników, jakie można osiągnąć za pomocą tej metody, wstrzykiwano komórki nowotworowe E0771-LG znakowane białkiem fluorescencyjnym Clover do żyły ogonowej myszy MacBlue 44 w różnych odstępach czasu przed operacją. Po zabiegu dożylnie podano dekstran znakowany rodaminą 155 kD w celu oznakowania naczyń krwionośnych, a następnie wykonano obrazowanie time-lapse.

Podczas obrazowania myszy 24 h po in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie optyczne in vivo o wysokiej rozdzielczości w połączeniu ze znakowanymi fluorescencyjnie znacznikami funkcjonalnymi, takimi jak białka i przeciwciała, znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat kaskady przerzutów. Umożliwiło to bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację parametrów jednokomórkowych i subkomórkowych w komórkach nowotworowych, komórkach gospodarza i ich mikrośrodowisku. To obrazowanie w obrębie guza pierwotnego doprowadziło na przykład do odkrycia dyskretnych mikrośrodowisk, które sprzyjaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute's Cancer Center grant grant, P30CA013330, R01CA172451 dla JWP i Integrated Imaging Program. Technologia ta została opracowana w Centrum Biofotoniki Gruss-Lipper oraz w Programie Zintegrowanego Obrazowania w Albert Einstein College of Medicine. Wyrażamy uznanie dla wsparcia tych Centrów w tej pracy. Autorzy dziękują Mike'owi Rottenkolberowi, Ricardo Ibagonowi i Anthony'emu Leggiadro z warsztatu mechanicznego Einsteina za ich umiejętne i terminowe wykonanie, laboratorium Matthew Krummela za hojne podzielenie się rysunkami projektów okien, Kevinowi Elicieriemu i Jeremy'emu Bredfeldtowi za ich wiedzę w zakresie mikroskopii i rekomendacje dotyczące wzmacniaczy oraz Allison Harney i Bojanie Gligorijevic za pouczające dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niklowany mosiężny regulator podciśnienia 1/8 NPT żeński, z manometrem, 0 - 20" Hg VacuumMcMaster Carr4172K12 Regulator podciśnienia
Mosiężny adapter do węża z zadziorami do węża 1/4 "ID X 1/8" NPTF Rura męskaMcMaster Carr5346K13Adapter węża regulatora podciśnienia
Kolby filtrujące marki Pyrex z rurką; Szyjka obrabiana do korka gumowego nr 4; Pojemność: 50 mlCorning Life Sciences Glass5360-50Kolba próżniowa
Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe Grubość #1,5, 0,16 - 0,19 mm Średnica 10 mm Ted Pella, Inc.260368Szkiełka nakrywkowe Jednorazowe
cewniki dożylne Exel Safelet; 22 g x 1 cal. Exel International26746Cewnik dotchawiczy
PERMA-HAND Czarne plecione jedwabne szwy, ETHICON LIGAPAK Szpula dozująca Rozmiar 2-0VWR95056-992Sznurek
Super Glue w płynie, przezroczysty, 0.14 uncjiHendel Corp.LOC1647358Klej cyjano-akrylowy
Izotiocyjanian tetrametylorodaminy– DextranSigma-AldrichT1287-500MG155 kD
Laboratoryjne przezroczyste rurki PVC Tygon, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Grubość ścianki, 25 stóp długościMcMaster Carr5155T12Cienkie rurki i Rurka do
rurek polietylenowych odpornych na pękanie Luer, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Grubość ścianki, Biała, 50 ft. Długość McMaster Carr5181K24 Grube rurki
Balsam depillacyjnyNair-Micro
Rurki medyczne 95 Twardość LDPEScientific Commodities Inc.BB31695-PE/1Rurka do cewnika do żył ogonowych
30 G x 1 cal. Igła BD PrecisionGlideBD305128Igły do cewnika do żył ogonowych
Puritan Niesterylne waciki z końcówką bawełnianą Fisher Scientific867WCNOGLUE
Przezroczysta rura z zadziorem z poliwęglanu, redukcyjna prosta do rury 3/32" x 1/16" IDMcMaster Carr5117k51Łączniki między rurkami
Jednootworowe gumowe korkiFisher Scientific14-135FKorek do termosu
SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-100, 100 i mikro; lDenville Scientific Inc.P1125Końcówka do pipet
Taśma laboratoryjnaFisher Scientific159015R
PuralubeHenry Schein Zdrowie zwierząt008897Maść okulistyczna
Gemini AparatHarvard726067Długopis do kauteryzacji
Graefe Micro kleszcze preparacyjne; Ząbkowane; Niewielka krzywa; 0.8 mm Szerokość końcówki; Długość 4 "Roboz SurgicalRS-5135 Kleszcze
Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjne 4 "proste ostre/ostre 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Ostre nożyczki
do mikro preparacji 4" proste /Roboz ChirurgiczneRS-5980nożyczki
Fisher Scientific06-666-A uprząż
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteVitals Monitor
1 ml Strzykawka z tuberkuliną Końcówka poślizgowaBD309659
Zszywkicyjanu akrylanuLOC1647358Klej nakrywkowy
Wazelina FisherScientific19-086291bariery wodnej
Luer Cannulla 1,5 - 2,2 mmAparat Harvard734118Złącze cewnika
PhysioSuite MouseSTAT pulsoksymetrKent ScientificPulsoksymetr
Isoethesia (izofluran)Henry Schein Animal Health50033250 ml
OxygenTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
Zawór kulowy PVC, wciskany do podłączenia, 1/4 calaGraingerZawór próżniowy 3CGJ7
Wentylator dla małych zwierzątAparat Harvard683Alternatywa jest dostępna w Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Zredukowana surowicaMedium ThermoFisher Scientific31985062 
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/JMyszy Jackson Laboratory026051 
Mikroskop wielofotonowyOlympusFluoview FV1000Alternatywa dla niestandardowego zakresu
Obudowa środowiskowaPrecyzyjna komora z tworzywa sztucznegodla FV1000Alternatywa dla niestandardowej obudowy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher Scientific14190136
Laserowy miernik mocyCoherentFieldMaxIITOP
Głowica miernika mocy laseraKoherentnyPM10
pcDNA3-Koniczyna Fluorescencyjny wektor białkowyAddgene40259
G418 Siarczan Selektywny antybiotykThermoFisher Scientific10131027
MoFlo Fluorescencyjno-aktywowany sorter komórek Beckman CoulterXDP
Trypsyna EDTA 1xCorning25-052-CL
40 &mikro; m MeshFalcon352235
96 Płytka dołkowaCostar3599
60 mm Naczyniehodowlane Corning430196
10 cm Naczynie hodowlaneCorning353003
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4503
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1xCorning21-031-CV
C57BL/6J MyszJackson Laboratory000664 
Kim WycieraFisher Scientific06-666-A 
z Adapter

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124(2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483(2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112(2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562(2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042(2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7(2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie p ucokno stabilizowane pr nioworozdzielczo pojedynczej kom rkiwysiew kom rek nowotworowychobrazowanie time lapseperfuzja naczyniowarekonstrukcja stosu Zznakowanie dekstranem fluorescencyjnymanaliza zmian przerzutowych

Powiązane artykuły