Artykuł metodologiczny

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/54625

⸱

21 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów embrionów myszy. Ten ulepszony protokół wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przygotowania tkanek w celu zwiększenia penetracji barwnika fluorescencyjnego, umożliwiając w ten sposób analizę morfometryczną zarówno małych, jak i dużych próbek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości (HREM) umożliwia szybkie pozyskiwanie cyfrowych danych wolumetrycznych i trójwymiarowych (3D) o wysokiej rozdzielczości. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół obrazowania całego zarodka myszy. Protokół składa się z czterech głównych sekcji: przygotowanie próbki, osadzanie, akwizycja obrazu i wreszcie wizualizacja 3D. Technologia wymaga, aby próbki były barwione barwnikiem fluorescencyjnym, co może być problematyczne w przypadku dużych lub gęstych próbek. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, ulepszyliśmy istniejący protokół, aby zwiększyć penetrację tkanki barwnika poprzez wstępne potraktowanie próbki roztworem zawierającym mocznik i dodecylosiarczan sodu. W protokole wykorzystuje się wyłącznie rutynowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki, co ułatwia adaptację w standardowych warunkach laboratoryjnych. Pokazujemy, że uzyskane obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości wiernie odwzorowują szczegółowe cechy morfologiczne narządów wewnętrznych zarodków myszy, umożliwiając w ten sposób analizy morfometryczne. Wspólnie prezentujemy szczegółowy i ulepszony protokół wykorzystujący standardowy sprzęt laboratoryjny do pozyskiwania obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości małych i dużych próbek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się technologii obrazowania 3D otworzyło możliwość systemowej analizy szczegółowych cech morfologicznych podczas rozwoju płodu. Obecnie dostępnych jest wiele metod obrazowania 3D, w tym obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (mikrorezonans magnetyczny), mikrotomografia komputerowa, ultradźwięki wysokiej częstotliwości, optyczna tomografia koherentna, optyczna tomografia projektowa i mikroskopia episkopowa1-4. Każda modalność ma swoje unikalne cechy w zakresie rozdzielczości, kontrastu, szybkości, kosztów, możliwości in utero i dostępności.

Episkopowe przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych (EFIC) i mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) są metodami obrazowania mikroskopii episkopowej4. W tym przypadku obrazy seryjne o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w sposób ciągły z powierzchni bloku, a nie z odcinków tkanki. Uzyskane obrazy wiernie odwzorowują szczegółowe cechy morfologiczne przy minimalnych lub zerowych zniekształceniach tkanek. Pozyskane dane wolumetryczne można łatwo przekształcić w obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości, które nadają się do dokładnej analizy morfometrycznej. Ze względu na stosunkowo niski koszt i wysoką rozdzielczość, HREM i EPIC stały się lepszą alternatywą dla systemowej oceny mysich modeli wad wrodzonych u ludzi2,4-8.

Zarówno metody EFIC, jak i HREM wymagają osadzenia próbek w odpowiednim podłożu. EFIC wykrywa autofluorescencję emitowaną przez osadzoną tkankę. Z tego powodu jest ograniczony do próbek emitujących wysoki poziom autofluorescencji, ale nie do tych o stosunkowo słabej autofluorescencji, takich jak zarodki we wczesnym stadium9. Aby przezwyciężyć zależność od autofluorescencji, próbki barwi się barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak eozyna, do obrazowania HREM. Wybór barwników i metod barwienia sprawia również, że HREM jest bardziej kompatybilny z wykrywaniem sygnałów molekularnych w kontekście architektury i morfologii tkanek4,10.

W tym artykule prezentujemy ulepszony protokół HREM, odpowiedni do oceny całego ciała zarodków myszy w późnym stadium rozwoju. Aby ułatwić barwienie, dołączamy etap obróbki wstępnej w celu zwiększenia penetracji tkanek, umożliwiając w ten sposób obrazowanie HREM starszych zarodków myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zastosowania zwierząt są zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie.

1. Przygotowanie próbki

  1. Krycie czasowe
    1. Umieść samca i samicę C57Bl6 typu dzikiego razem w tej samej klatce.
    2. Sprawdź, czy nie tworzy się korek współpracujący wcześnie następnego ranka. Zatyczka współpracująca (inaczej czop dopochwowy lub kopulacyjny) to stwardniałe galaretowate osadzanie, które blokuje pochwę.
    3. Ustaw datę zatyczenia na dzień embrionalny 0,5 (e0,5).
  2. Izolacja zarodków myszy
    1. Eutanazja ciężarnych samic przez uduszenie CO2 .
    2. Połóż myszy na wznak na podkładce chłonnej i spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.
    3. Podnieś skórę i wykonaj początkowe nacięcie 5 mm w ogonowej okolicy brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wytnij i usuń skórę brzucha, aby w pełni odsłonić narządy wewnętrzne
    4. Wytnij w pobliżu pochwy, aby usunąć całą macicę.
    5. Przeciąć między miejscami implantacji wzdłuż rogu macicy. Każdy segment lub zarodek powinien mieć w środku tylko jeden zarodek.
    6. Przechowuj segmenty macicy w 1x lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Rozwarstwienie zarodków
    1. Umieść każdą koncepcję w osobnym naczyniu z lodowatym PBS pod stereoskopem.
    2. Usuń kolejno tkanki macicy, łożysko, a następnie błony płodowe za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych.
    3. Przenieś wypreparowany zarodek do probówki o pojemności 50 ml z 1x lodowatym PBS za pomocą dużej pipety transferowej. Unikaj pobierania zarodka bezpośrednio kleszczami, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek.
  4. Utrwalenie
    1. Utrwalić wypreparowane zarodki w 10% obojętnym buforowym roztworze formaliny w temperaturze 4 °C przez ponad 24 godziny z co najmniej 10 objętościami utrwalacza.
  5. Wstępnej obróbki
    1. Przygotuj roztwór czyszczący: 4 M mocznik, 10% glicerol, 4% dodecylosiarczan sodu (SDS) w wodzie podwójnie destylowanej.
    2. Zastąp utrwalacz roztworem czyszczącym.
    3. Delikatnie obracaj próbkę na bujaku w temperaturze pokojowej przez 1 - 2 tygodnie. Wymień Rozwiązanie Rozliczeniowe raz drugiego i trzeciego dnia. Próbka powoli staje się przezroczysta i półprzezroczysta.
    4. Zastąp roztwór czyszczący 10% formaliną i pozostaw na bujaku na 2 dni.
  6. odwodnienie
    1. Próbki poddane wstępnej obróbce należy przemyć 1x PBS 3 razy przez 5 minut każda.
    2. Odwodnić próbki w rosnącej serii etanolu w temperaturze pokojowej na delikatnym bujaku. W przypadku zarodków E15,5 należy użyć rosnącej serii etanolu obejmującej 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% i 100% etanolu, 2 godziny każdy krok. W przypadku starszych zarodków należy wydłużyć czas inkubacji.
  7. Barwienia
    1. Przygotuj roztwór barwiący: dodaj 0,1375 grama soli disodowej eozyny i 0,0275 grama soli hemi (chlorek) w kolorze pomarańczy akrydynowej do 50 ml 100% etanolu. Mieszaj przez 2 godziny. Przefiltruj bibułą filtracyjną. Przechowywać w temperaturze pokojowej i unikać światła, przykrywając folią aluminiową.
    2. Przenieś próbkę do roztworu barwiącego na 1 godzinę.
    3. Zastąp świeżym roztworem barwiącym i bejcuj przez noc.
  8. naciek
    1. Przygotuj roztwór infiltracyjny: połącz 100 ml roztworu A z zestawu do osadzania JB-4, 1,25 g katalizatora C, 0,275 g soli disodowej eozyny i 0,055 g soli hemi (chlorku) w kolorze pomarańczy akrydynowej. Mieszaj do wymieszania (200 obr./min) w wiaderku z lodem przez 2 godziny, a następnie przefiltruj bibułą filtracyjną.
    2. Roztwór rozsączający należy przechowywać w temperaturze 4 °C i unikać światła, przykrywając folią aluminiową.
    3. Przenieść zarodki do roztworu naciekającego: roztworu barwiącego (1:1) i inkubować przez co najmniej 3 godziny na kołysce w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieś zarodki do roztworu infiltracyjnego i inkubuj przez 3 godziny na kołysce w chłodnym pomieszczeniu.
    5. Roztwór rozsączający należy wymieniać raz dziennie i pozostawić w chłodnym pomieszczeniu na delikatnym bujaku na kolejne trzy dni.

2. Osadzanie

  1. Roztwór B i roztwór infiltracyjny należy przechowywać na lodzie.
  2. Przygotuj roztwór do zatapiania (1:25 roztworu B i roztwór infiltracyjny) bezpośrednio przed osadzeniem.
  3. Zorientuj próbkę w formie do zatapiania, a następnie delikatnie wlej zimny roztwór do zatapiania do formy do zatapiania. W razie potrzeby zmień orientację za pomocą szpilki.
  4. Użyj szpilki, aby sprawdzić, czy roztwór do osadzania jest zestalony. Wypchnij blok próbki i przytnij go w razie potrzeby.
  5. Zmień orientację bloku próbki za pomocą oddzielnej formy, aby uzyskać orientację krzyżową.
  6. Umieść uchwyt blokowy na wierzchu formy do zatapiania. Delikatnie wlej roztwór do zatapiania do formy, aż forma i uchwyt bloku zostaną zanurzone w roztworze do zatapiania.
  7. Próbkę należy przechowywać w pojemniku wtórnym i pozostawić na lodzie na 3-4 godziny w dygestorium.
  8. Zestalone próbki przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Oderwij formę do zatapiania. Umieść blok pod mikroskopem stereoskopowym z ukośnym oświetleniem, aby sprawdzić położenie próbki w bloku. Na powierzchni bloku zaznacz linie siatki wokół próbki.
  10. Przytnij blok, aby usunąć ilość materiału do osadzania, używając zaznaczonych linii siatki jako odniesień.

3. Akwizycja obrazu

  1. Zacisnąć blok próbki na mikrotomie i uzyskać świeżą powierzchnię cięcia. Ustaw grubość przekroju (np. e9,5-10,5, 1,5 μm; e11,5-12,5, 2,0 μm; e13,5-15,5, 2,5 μm; e16,5-starsze, 3 μm). Utrzymuj próbkę/blok w pozycji wyjściowej mikrotomu.
  2. Zamontuj mikroskop stereoskopowy z zoomem poziomo skierowany w stronę powierzchni bloku próbki.
  3. Włącz komputer i mikroskop, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.
  4. Wizualizuj i ustawiaj ostrość optyki na powierzchni bloku w trybie "podglądu na żywo" w oprogramowaniu do obrazowania.
  5. W razie potrzeby ustaw mikroskop i mikrotom tak, aby blok znajdował się na środku wizjera.
  6. Dostosuj powiększenie tak, aby cała powierzchnia bloku znajdowała się w wizjerze.
  7. Wybierz filtr białka zielonej fluorescencji (GFP) (wzbudzenie 470 ± 20 nm, dichroiczne 495 nm, emisja 525 ± 25 nm) i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.
  8. Zmierz i ustaw czas ekspozycji ręcznie (np. 80 - 400 mini sec).
  9. Pobieraj obrazy powierzchni bloku po każdym nowym cięciu i zapisuj obrazy automatycznie, jeśli to możliwe.
  10. Rejestruj ważne parametry, takie jak rozdzielczość, grubość przekroju i powiększenie.
  11. Po wykończeniu całej próbki wyeksportuj i w razie potrzeby przekonwertuj wszystkie pliki graficzne do formatu JPEG.
  12. Odwróć wszystkie oryginalne obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i dostosuj jasność i kontrast.
  13. Zapisz wszystkie przetworzone obrazy w osobnym folderze.

4. 3D Wizualizacja

  1. Prześlij wszystkie przetworzone obrazy do oprogramowania do wizualizacji 3D, postępując zgodnie z instrukcjami.
  2. Wprowadź rozdzielczość i grubość przekroju, aby przekonwertować wszystkie obrazy na dane wolumetryczne (tj. rozmiar woksela) i zapisać plik 3D.
  3. Wyrównaj wszystkie obrazy w trybie automatycznym. W razie potrzeby dostosuj poszczególne obrazy ręcznie.
  4. Zapisz wyrównany obraz pod nową nazwą pliku.
  5. Analizuj cechy morfometryczne próbki za pomocą oprogramowania do wizualizacji 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgłosiliśmy wysokiej jakości obrazy zarodków myszy w HREM między e9.5 a e13.58. Jakość obrazu zarodków w późnym stadium rozwoju jest jednak znacznie obniżona ze względu na ograniczoną penetrację tkanek przez barwnik fluorescencyjny eozynę. Aby zwiększyć wydajność barwienia, przetestowaliśmy kilka metod obróbki wstępnej, które są kompatybilne z obrazowaniem fluorescencyjnym11. W szczególności zarodki myszy e15.5 traktowano albo Sca/e A212, albo Whole-Body C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowany protokół wykorzystujący rutynowy sprzęt laboratoryjny do pozyskiwania seryjnych obrazów HREM, które są kompatybilne z szybką wizualizacją 3D i analizą morfometryczną złożonych struktur. Ponieważ obrazy o wysokiej rozdzielczości są wykonywane bezpośrednio z powierzchni bloku, a nie z pojedynczych sekcji, drobne cechy morfologiczne są zachowywane i szybko rekonstruowane cyfrowo w programie do wizualizacji 3D.

Obrazowanie 3D oferuje znaczące korzyści w wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy doktorom Yichen Huang, Chunming Guo i Zhenfang Zhou za ich wsparcie techniczne. Badania te zostały sfinansowane przez NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) i American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MyszyThe Jackson LaboratoryC57BL6
Alkohol etylowyPharmco-Aaper111000200200 Proof, absolutny, ACS / USP / koszerny
formalinSigmaHT501128-4L
MocznikSigmaU5128Roztwór czyszczący
GlycerolFisher scientificG33-4Roztwór
czyszczącyDodecylosiarczan soduInvitrogen15525-017Roztwór oczyszczający
Sól disodowa eozyny YFisher scientificBP241925Roztwór infiltracyjny
Sól pomarańczy akrydynowej hemi (chlorek)SigmaA6014Roztwór infiltracyjny
Papier WhatmanGE3030-153
Zestaw do osadzania JB-4 - Solution APolysciences, Inc.0226A-800Roztwór infiltracyjny
JB-4 Zestaw do osadzania - Rozwiązanie BPolysciences, Inc.0226B-30Rozwiązanie do zatapiania
JB-4  Zestaw do osadzania - CatalystPolysciences, Inc.02618-12Roztwór infiltracyjny
do osadzania formPolysciences, Inc.23185-116 x 8 mm
Odklejana ostra forma do osadzaniaPolysciences, Inc.18986-1Kwadrat 22 mm x 22 mm, ścięty do 12 mm x 12 mm
JB-4  Plastikowe uchwytyblokowe Polysciences, Inc.15899
Jednorazowe rury transferowe z podziałkąVWR414004-014
Szalka PetrlaVWR25384-088Kleszcze do preparowania zarodków
Końcówka Inox  ROBOZRS-5015Sekcja zarodków
Graefe Kleszczyk do tkanek  ROBOZRS-5153rozwarstwiania zarodków
  ROBOZRS-6700Dyssekcja zarodków
14 ml Polipropylenowe probówki z okrągłym dnemFalcon352059
50 ml Polipropylenowe probówki stożkoweFalcon352098
Wiadro na lódMagic Touch Iceware International Corp.R19-343
100 ml (3.4 uncji) Antystatyczne łodzie wagowe z polistyrenuVWR89106-766
330 ml (11.2 uncji) Antystatyczne łodzie wagowe z polistyrenuVWR89106-770
Chlorek soduMP Biomedicals102892Roztwór PBS
Chlorek potasuSigmaP0662Roztwór PBS
Fosforan potasu jednozasadowySigmaP5405PBS
Roztwór fosforanu sodu dwuzasadowego siedmiowodnegoSigma-AldrichS9390PBS Solution
Aparat cyfrowyHamamatsu PhotonicsC11440-10C
MikrotomLeicaRM2265
OświetlaczCarl ZeissHXP 200C
Fluorescencyjny mikroskop stereo zmiennoogniskowyCarl ZeissAxio Zoom.V16
stereoskopowyOlympusSZX16
Światłowodowe źródło światłaLeicaKL 1500 LCD
Jednorazowe ostrze mikrotomoweVWR95057-832
Dozownik jednokrawędziowyPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D SoftwareVisage Imaging5.4
KomputerDell T7600, dysk twardy SAS 2x900 GB i 64 GB pamięci
Wytrząsarki z platformą kołyszącąVWR40000-304
Standardowe mieszadło z płytą grzejnąVWR12365-382
Waga analitycznaMettler ToledoAB54-S
Delikatna nożyczki operacyjne do Mikroskop DDR3 RDIMM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe pozyskiwanie obraz wobrazowanie zarodk w myszyprzygotowanie pr bekutrwalanie i przezrocznienie tkanekbarwienie fluorescencyjneodwodnienie etanolemprocedura zatapianiakrojenie mikrotomemwizualizacja 3D

Powiązane artykuły