Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54652

⸱

23 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy przygotowanie i użycie sondy opartej na aktywności (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu), która pozwala na wykrycie i ilościowe określenie aktywnej formy prozapalnego enzymu amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA), zarówno in vitro, jak i ex vivo.

Streszczenie

Profilowanie białek oparte na aktywności (ABPP) to metoda identyfikacji interesującego enzymu w złożonym proteomie za pomocą sondy chemicznej, która celuje w miejsca aktywne enzymu. Znacznik reporterowy wprowadzony do sondy pozwala na wykrycie znakowanego enzymu za pomocą skanowania fluorescencyjnego w żelu, plamy białkowej, mikroskopii fluorescencyjnej lub chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i zastosowanie związku ARN14686, sondy opartej na aktywności chemicznej (CC-ABP), która selektywnie rozpoznaje enzym amidazę kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA). NAAA to hydrolaza cysteiny, która sprzyja stanom zapalnym poprzez dezaktywację endogennych receptorów aktywowanych przez proliferatory peroksysomów (PPAR)-alfa-agonistów, takich jak palmitoiloetanoloamid (PEA) i oleoiloetanoloamid (OEA). NAAA jest syntetyzowany jako nieaktywny proenzym o pełnej długości, który jest aktywowany przez autoproteolizę w kwaśnym pH lizosomu. Badania lokalizacyjne wykazały, że NAAA ulega ekspresji głównie w makrofagach i innych komórkach pochodzących z monocytów, a także w limfocytach B. Podajemy przykłady, w jaki sposób można ARN14686 wykorzystać do wykrywania i ilościowego oznaczania aktywnego NAAA ex vivo w tkankach gryzoni za pomocą mikroskopii białkowej i fluorescencyjnej.

Wprowadzenie

Powszechnie stosowane metody badania wzorców ekspresji, interakcji i funkcji białek, w tym platformy chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy shotgun1,2, metody dwuhybrydowe drożdży3,4 oraz testy in vitro, są ograniczone, ponieważ nie są w stanie ocenić aktywności białek w ich naturalnym stanie. Do wypełnienia tej luki można wykorzystać profilowanie białek oparte na aktywności (ABPP). W tym podejściu sondy małocząsteczkowe zdolne do kowalencyjnego wiązania się z miejscem aktywnym enzymu będącego przedmiotem zainteresowania są sprzężone z grupą reporterową, która pozwala na wykrycie celu. Korzystając z chemii kliknięć (CC), reporter może być zintegrowany z sondą lub może być wprowadzony po zazębieniu się celu5,6. Ta ostatnia procedura wymaga użycia sond zawierających odpowiednie grupy chemiczne, takie jak końcowy alkin lub azydek, które mogą być modyfikowane za pomocą szeregu odczynników reporterowych poprzez reakcje bioortogonalne, takie jak katalizowana Cu(I) cykloaddycja Huisgen [3+2]7-9 lub ligacja Staudingera10,11.

Niedawno ujawniliśmy, że związek ten ARN14686 jako pierwszy ABP do wykrywania hydrolazy cysteinowej in vitro i in vivo, NAAA12. NAAA katalizuje hydrolityczną dezaktywację nasyconych i jednonienasyconych FAE, w tym oleoiloetanoloamidu (OEA) i palmitoiloetanoloamidu (PEA), które są endogennymi agonistami przeciwzapalnego receptora jądrowego PPAR-alfa13-15. NAAA ulega ekspresji głównie w makrofagach i innych komórkach pochodzących z monocytów, a także w limfocytach B14,16, co sugeruje rolę w regulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Enzym jest syntetyzowany w szorstkiej retikulum endoplazmatycznym w postaci nieaktywnej i jest aktywowany w kwaśnych przedziałach komórki przez mechanizm autoproteolityczny17. Rozszczepienie autoproteolityczne generuje nową N-końcową cysteinę (C131 u myszy i szczurów, C126 u ludzi), która jest nukleofilem odpowiedzialnym za hydrolizę FAE18,19. Farmakologiczne hamowanie aktywności NAAA zmienia równowagę syntezy/degradacji FAE na korzyść zwiększonych poziomów komórkowych FAE16,20,21. Wykazano, że kilka pochodnych β-laktonu i β-laktamu hamuje aktywność NAAA z dużą siłą działania i selektywnością16,22-26. Inhibitory te działają poprzez S-acylowanie katalitycznej cysteiny16,27,28.

Związek ARN14686 został zaprojektowany w oparciu o strukturę chemiczną ogólnoustrojowo aktywnego, pochodzącego z seryny inhibitora NAAA β-laktamu, ARN726 (4-cykloheksylobutyl-N-[(S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu)16. Grupa 4-butylocykloheksylowa ARN726 została zastąpiona nasyconym łańcuchem alifatycznym C9 z końcowym znacznikiem alkinowym do późniejszej koniugacji CC ze znacznikiem reporterowym zawierającym azydek. Zdecydowaliśmy się zaprojektować dwuetapowy ABP, aby minimalnie zmienić strukturę oryginalnego rusztowania, zachowując w ten sposób powinowactwo sondy do NAAA. Co więcej, unikając wprowadzania nieporęcznych znaczników, taka sonda może być bardziej odpowiednia do leczenia in vivo niż bezpośrednia ABP. ARN14686 hamuje NAAA z dużą siłą działania (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM) poprzez tworzenie kowalencyjnego adduktu z katalityczną cysteiną enzymu12. Eksperymenty na żywych szczurach wykazały, że sonda jest selektywna w wychwytywaniu NAAA wyrażonego w płucach. Kwaśna ceramidaza, inna amidaza cysteinowa, która ma 33-34% identyczności z NAAA, została również zidentyfikowana jako cel o niskim powinowactwie przy użyciu wysokich stężeń sondy (10 μM in vitro, 10 mg / ml dożylnie, dożylnie)12. Wykorzystaliśmy również ARN14686 do zbadania obecności aktywnego NAAA w tkankach szczura objętych stanem zapalnym po podaniu pełnego adiuwanta Freunda (CFA)29.

Tutaj przedstawiamy protokół przygotowania ARN14686 (Rysunek 1) i jego zastosowania do badania aktywacji NAAA ex vivo. Jako przykład opisujemy eksperymentalną procedurę wizualizacji NAAA w łapach szczurów po podaniu CFA. W tym eksperymencie białka są ekstrahowane z tkanki łapy po wstrzyknięciu dożylnym sondy, a proteom znakowany ABP jest poddawany CC z azydkiem biotyny. Próbki biotynylowane są wzbogacane za pomocą kulek streptawidyny i wykonywane są bloty białkowe. W innym zastosowaniu opisujemy lokalizację aktywnego NAAA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w płucach myszy od myszy leczonych sondą. W tym przypadku tkanka jest cięta, a skrawki są poddawane CC w celu dodania rodaminy. Schemat przepływu pracy przedstawiono na rysunku 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wszystkie reakcje chemiczne powinny być przeprowadzane w wentylowanym dygestorializmie i przy użyciu fartucha laboratoryjnego, rękawic i okularów ochronnych. Reakcje powinny być również przeprowadzane w środowisku azotowym.

Oświadczenie etyczne: Nasze zabiegi na zwierzętach są wykonywane zgodnie z włoskimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych (D.M. 116192) oraz przepisami Europejskiej Wspólnoty Gospodarczej (Dz.U. E.C. L 358/1 12/18/1986).

UWAGA: Synteza octanu [(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]amonu jest opisana dla plonów na dużą skalę (50 g N-Cbz-L-seryny), ale można ją łatwo zmniejszyć.

1. Synteza

UWAGA: Patrz rysunek 1, aby zapoznać się ze schematem reakcji syntezy.

  1. Przygotowanie węglanu 2-pirydylu undec-10-ynylu i 1-karboksylanu 2-oksopirydyny undec-10-ynylu
    1. W kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml rozpuścić 350 mg undec-10-yn-1-olu w 3,5 ml suchego dichlorometanu.
    2. Do roztworu opisanego w ppkt 1.1.1 dodać 25 mg 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) i 530 mg węglanu 2-dipirydylu (DPC). Mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 16 godzin.
    3. Dodać 20 ml dichlorometanu.
    4. Przenieść mieszaninę do rozdzielacza. Dodaj 15 ml wody, wstrząśnij i pozwól obu fazom się rozdzielić.
    5. Otwórz zawór odcinający, zbierz fazę organiczną (na dole), a następnie zamknij kran. Dodać 15 ml nasyconego roztworu NaHCO3. Potrząśnij rozdzielaczem i pozwól obu fazom się rozdzielić. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
    6. Wysuszyć warstwę organiczną za pomocą Na2SO4, przefiltrować przez bawełnę do kolby okrągłodennej (najpierw tarować) i odparować do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa).
    7. Zważyć kolbę i otrzymać 600 mg oleju, który jest mieszaniną węglanu 2-pirydyloundec-10-ynylu i 1-karboksylanu undec-10-ynylo-2-oksopirydyny w stosunku 1,7:1,
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) składowa główna δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2,18 - 2,11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) składowa mniejsza δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30 - 6,25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2,18 - 2,11 (m, 2H), 1,77 - 1,60 (m, 2H), 1,52 - 1,20 (m, 12H).
    8. Używaj oleju bez dalszej separacji lub oczyszczania.
  2. Przygotowanie octanu [(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]amonu
    1. Preparat N-[(S)-1-(hydroksymetylo)-2-[(4-metoksyfenylo)amino]-2-oksoetylo]karbaminianu.
      1. W 4-litrowej kolbie okrągłodennej rozpuścić 141,5 g p-anizydyny w 1,5 l tetrahydrofuranu i 0,5 l dichlorometanu.
      2. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
      3. Dodać 50,0 g N-Cbz-L-seryny i 43,9 g chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu.
      4. Mieszać mieszaninę za pomocą pręta magnetycznego w temperaturze 0 °C przez 30 minut.
      5. Wyjąć roztwór z łaźni lodowej i mieszać za pomocą pręta magnetycznego w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.
      6. Odparować rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa).
      7. Dodać 400 ml cykloheksanu/octanu etylu w stosunku 1:1, wymieszać szpatułką i zdekantować.
      8. Powtórz krok 1.2.1.7 jeszcze dwa razy.
      9. Rozpuścić żelkowatą pozostałość w 500 ml octanu etylu i przemyć 400 ml 0,1 M roztworu HCl (10 razy), 400 ml nasyconego roztworuNaHCO3 (2 razy) i 400 ml solanki.
      10. Wysuszyć warstwę organiczną za pomocą Na2SO4, przefiltrować roztwór przez bawełnę do kolby okrągłodennej (najpierw tarować) i odparować do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa).
      11. Zważyć kolbę i otrzymać 61,4 g białej substancji stałej.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H), 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
    2. Preparat N-[(S)-1-(4-metoksyfenylo)-2-okso-azetydyno-3-ylo]karbaminianu benzylu.
      1. Rozpuścić 58,6 g N-[(S)-1-(hydroksymetylo)-2-[(4-metoksyfenylo)amino]-2-okso-etylo]karbaminianu w 1,6 l N,N-dimetyloformamidu.
      2. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
      3. Dodać 50,6 g 1,1'-sulfonylidolidiimidazolu i mieszać za pomocą pręta magnetycznego przez 30 min.
      4. Schłodzić roztwór do temperatury -20 °C w kąpieli lodowej/NaCl i dodać porcjami 10,2 g wodorku sodu (60% w oleju mineralnym).
      5. Mieszać mieszaninę w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę, a następnie zalać 2 ml metanolu i 1 litrem wody.
      6. Przefiltrować osad próżniowo, przemyć 200 ml wody i wysuszyć w próżni.
      7. Otrzymać 42,2 g białej substancji stałej.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 (ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H), 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Otrzymywanie N-[(S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu benzylu.
      1. Zawiesić 9,0 g N-[(S)-1-(4-metoksyfenylo)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu benzylu w 500 ml acetonitrylu i 400 ml wody.
      2. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
      3. Dodać 45,4 g azotanu cerowo-amonowego porcjami przez 45 minut i mieszać prętem magnetycznym w temperaturze 0 °C przez 15 minut.
      4. Ostrożnie dodać 500 ml nasyconego roztworu NaHCO3, a następnie dodać 500 ml octanu etylu.
      5. Przefiltrować osad i przemyć 200 ml octanu etylu.
      6. Oddzielić roztwór dwufazowy i przemyć warstwę wodną 200 ml octanu etylu (3 razy).
      7. Wysuszyć warstwę organiczną za pomocą Na2SO4, dodać 5 g węgla aktywnego, przefiltrować przez podkładkę z krzemionki okrzemkowej i odparować do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa).
      8. Dodaj eter dietylowy i wymieszaj szpatułką.
      9. Przefiltrować ciało stałe i uzyskać 4,85 g ciała stałego o barwie białawej.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7,42- 7,30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
    4. Przygotowanie octanu [(S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]-amonu.
      1. Rozpuścić 0,93 ml kwasu octowego w 245 ml octanu etylu. Oznacz to jako "rozwiązanie do zalewkowania".
      2. Rozpuścić 3,28 g benzylo-N-[(R)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu benzylu w 298 ml etanolu.
      3. Dodać 14,1 ml cykloheksadienu i 3,27 g 10% palladu na węgiel.
      4. Mieszać zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin, a następnie przefiltrować przez krótką podkładkę z ziemią okrzemkową. Wlać ciecz eluującą bezpośrednio do roztworu pułapkowego.
      5. Odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa), utrzymując temperaturę poniżej 35 °C.
      6. Otrzymaną substancję stałą rozcierać tetrahydrofuranem i otrzymać 1,72 g białego ciała stałego.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3Hz).
  3. Przygotowanie undec-10-ynylo-N-[(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu
    1. W kolbie okrągłodennej o pojemności 10 ml rozpuścić 60 mg octanu [(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]amonu w 2 ml suchego dichlorometanu.
    2. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej i dodać kroplami 81 μl N,N-diizopropyloetyloaminy.
    3. Rozpuścić 350 mg surowej mieszaniny zawierającej 1-karboksylan undec-10-ynylo-2-oksopirydyny w 2 ml suchego dichlorometanu, dodać do roztworu i mieszać w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Odparować rozpuszczalnik do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa).
    4. Oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy) przy użyciu zautomatyzowanego aparatu do chromatografii kolumnowej:
      1. Wchłonąć próbkę na żel krzemionkowy, zrównoważyć kolumnę cykloheksanem i załadować próbkę do wkładu.
      2. Eluować cykloheksanem/octanem etylu od 100:0 do 0:100 i zbierać piki na probówkach.
      3. Odparować rozpuszczalnik frakcji odpowiadających związkowi do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa) i otrzymać 40 mg białego ciała stałego.

2. Przygotowanie odczynników CC

  1. Przygotowanie 5 mM roztworu podstawowego cząsteczek tag-azydku
    1. Rozpuścić 1,5 mg Azide-PEG3-Fluor 545 w 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Porcje należy rozlać do mikroprobówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Rozpuścić 1,1 mg Azide-PEG3-Biotyny w 0,5 ml DMSO. Porcje należy rozlać do mikroprobówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotowanie 50 mM roztworu podstawowego tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP)
    1. Rozpuść 14,3 mg TCEP w 1 ml wody i za każdym razem spraw, aby był świeży.
  3. Przygotowanie 50 mM roztworu CuSO4·5H2O
    1. W szklanej fiolce rozpuścić 12,48 mg CuSO4·5H2O w 1 ml wody. Przechowywać w sklepie RT przez okres do jednego miesiąca.
  4. Przygotowanie 83,5 mM roztworu podstawowego tris[(1-benzylo-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminy (TBTA)
    1. W szklanej fiolce rozpuścić 8,85 mg TBTA w 200 μl DMSO. Przechowywać w sklepie RT przez okres do jednego miesiąca.
  5. Przygotowanie 1,7 mM roztworu roboczego TBTA (bezpośrednio przed użyciem)
    1. Dodać 20 μl 83,5 mM TBTA do szklanej fiolki i rozcieńczyć 180 ml DMSO.
    2. Dodać 800 μl tert-butanolu i odwirować.

3. Analiza ekspresji NAAA w tkance łapy szczurów leczonych CFA

UWAGA: Używaj samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 175-200 g i wykonuj wszystkie procedury zgodnie z wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt. Szczury domowe w wentylowanych klatkach w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i zapewnij im swobodny dostęp do pożywienia i wody. Aby zapoznać się z protokołem leczenia CFA, zapoznaj się z artykułem opublikowanym przez Bonezzi i wsp.29 Wykorzystanie zwierząt 7 dni po podaniu CFA.

  1. Dożylne podawanie ARN14686
    1. Rozpuścić ARN14686 w podłożu (15% PEG i 15% roztwór soli fizjologicznej). Obliczyć stężenie roztworu w zależności od masy ciała szczura (dawka 3 mg/kg, objętość wstrzyknięcia 5 ml/kg).
    2. Kontynuuj wstrzyknięcia dożylne trzem szczurom nieleczonym i trzem szczurom leczonym CFA. Umieść każdego szczura w odpowiednim plastikowym urządzeniu przytrzymującym. Następnie umieść ogon szczura w ciepłej wodzie na 2-4 minuty, aby umożliwić rozszerzenie naczyń krwionośnych, i wstrzyknij związek dożylnie przez żyłę ogonową.
    3. Trzem szczurom (nieleczonym i leczonym CFA) wstrzyknąć dożylnie tylko nośnik.
  2. Pobieranie i rozwarstwianie łap
    1. Złożyć szczury w ofierze przez wdychanie CO2 4 godziny po podaniu sondy lub pojazdu i zebrać ich łapy, przecinając je 0,5 cm powyżej stawu kolanowego za pomocą skalpela.
    2. Ostrożnie usuń skórę przez rozwarstwienie wspomagane nożyczkami i wypreparuj tkanki miękkie, zeskrobując je z kości. Wyrzuć kości i zbierz tkanki miękkie łap. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Homogenizacja łap i lizosomalny preparat białkowy
    UWAGA: Unikaj stosowania detergentów i zawierających aminy, ponieważ mogą one hamować reakcję CC.
    1. Połączyć tkankę łapy od 3 szczurów (otrzymaną w sposób opisany w sekcji 3.2.1) i homogenizować je w 4 ml 320 mM sacharozy w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS, pH 7,4) i koktajlu inhibitorów proteazy (patrz tabela materiałów/odczynników); użyć wysokowydajnego przyrządu dyspergującego (patrz tabela materiałów/odczynników).
    2. Odwirować homogenat tkankowy przez 20 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C; zachować supernatant.
    3. Dodać 2 ml 320 mM sacharozy w PBS i koktajl inhibitorów proteazy do osadu tkankowego i ponownie homogenizować.
    4. Wirować przez 20 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C i dodać supernatant do supernatantu z kroku 3.3.2.
    5. Odwirować zebrane supernatanty przez 30 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    6. Zważyć osad i ponownie zawiesić w dwóch objętościach PBS (tj. 200 μl na każde 100 mg osadu). Przenieść do probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i zamrażać w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.
    7. Rozmrozić próbki i ponownie zamrozić na 1 godzinę w temperaturze -80 °C.
    8. Powtórz cykl zamrażania/rozmrażania jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Ten etap ma na celu rozpuszczenie białka. W razie potrzeby zamrozić na noc.
    9. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, który zawiera rozpuszczalne białka lizosomalne, i wyrzucić osad. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast przystąpić do oznaczania ilościowego białka.
    10. Określ ilościowo zawartość białka za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania białka BCA30 (patrz tabela materiałów/odczynników), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    11. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  4. CC z Azide-PEG3-Biotin
    UWAGA: Protokół wzbogacania kulek CC i streptawidyny (kroki 3.4-3.6) jest nieznacznie zmodyfikowany w stosunku do protokołu opublikowanego przez Speers i Cravatt31.
    1. Przygotować 500 μl (1 mg/ml, w PBS) białek lizosomalnych od szczurów leczonych sondą i nośnikiem (szczury wcześniej nieleczone i leczone CFA).
    2. Próbki należy wstępnie oczyścić 40 μl 50% zawiesiny agarozy streptawidyny (przed użyciem przemyć trzykrotnie 1 ml PBS) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wirować przez 4 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C i pobrać supernatant.
    3. Dodać 11,3 μl 5 mM zapasu Azide-PEG3-Biotyny i odwirować.
    4. Dodać 11,3 μl 50 mM zapasu świeżo przygotowanego TCEP i odwirować.
    5. Wstępnie wymieszać 34 μl świeżo przygotowanego roztworu roboczego 1,7 mM TBTA z 11,3 μl 50 mM CuSO4·5H2O.
    6. Dodać 45,3 ml wstępnie zmieszanego roztworu TBTA/CuSO4·5H2O i odwirować.
    7. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 2 godziny (dłuższy czas inkubacji nie ma wpływu na reakcję). Na tym etapie obserwuj wytrącanie się białka. Wymieszać po pierwszej godzinie inkubacji.
  5. Usuwanie nadmiaru odczynników CC
    1. Odwirować próbki przez 4 minuty przy 6 500 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    2. Dodać 750 μl zimnego metanolu i ponownie zawiesić za pomocą sonikacji (5 sekund za pomocą sonikatora z sondą).
    3. Odwirowywać próbki przez 4 minuty przy 6 500 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą strzykawki i igły.
    4. Powtórzyć krok 3.5.2 dwa razy (sonikacja nie jest wymagana).
    5. Po ostatnim przemyciu dodać 325 μl dodecylosiarczanu sodu (SDS) 2,5% w PBS do granulki białkowej i sonikować 3x przez 5 sekund.
    6. Podgrzewać próbki przez 5 minut w temperaturze 65 °C i ponownie poddać sonikacji.
    7. Wirować przez 5 minut przy 6 500 x g w temperaturze pokojowej i zachować supernatant.
    8. Dodać 1,4 ml PBS, aby rozcieńczyć stężenie SDS do 0,5%. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub kontynuować wzbogacanie streptawidyną.
  6. Wzbogacanie streptawidyny
    1. W przypadku PBS doprowadzić objętość próbek otrzymanych w kroku 3.5.8 do 4,2 ml. Dodać 40 μl 50% zawiesiny agarozy streptawidyny za pomocą końcówki z odciętym końcem (przed użyciem przemyć trzykrotnie 1 ml PBS).
    2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją, a następnie wirować przez 2 minuty przy 1 400 x g.
    3. Usunąć supernatant bez suszenia granulek kulek i użyć pozostałego supernatantu do przeniesienia kulek do kolumny wirowej o pojemności 1 ml (patrz tabela materiałów/odczynników).
    4. Przemyć grawitacyjnie 3x 1 ml 1% SDS (w PBS), 3x 1 ml 6 M mocznika (w PBS) i 4x 1 ml PBS.
    5. Użyć 2x 500 μl PBS, aby przenieść kulki do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 2 minuty przy 1 400 x g przy wilgotności względnej. Delikatnie odessać supernatant za pomocą strzykawki i igły.
    6. Eluować białka związane z żywicą, dodając 25 μl buforu elucyjnego (6 M mocznika, 2 M tiomocznik, 2% SDS i 6 mM biotyny, wszystkie w PBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 15 minut w temperaturze 95 °C32.
  7. Białko Blot
    1. Dodać 5 μl 6x buforu Laemmli (dla 9 ml: 0,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml 20% SDS, 5 mg błękitu bromofenolowego, 3 ml glicerolu iH2Odo 9 ml) i dodać 5% β-merkaptoetanolu bezpośrednio przed użyciem. Krótko odwirować próbki o masie 2 000 x g, aby osadzać żywicę i załadować 25 μl otrzymanego supernatantu do 4-12% żelu poliakrylamidowego.
    2. Wykonać elektroforezę żelową i transfer białek na błonie bibułkowej zgodnie z instrukcjami producenta33.
    3. Nasycić błonę bibuły przez 1 godzinę 10 ml buforu blokującego (patrz tabela materiałów/odczynników) zawierającego 0,1% Tween-20. Unikaj używania mleka, ponieważ może to zwiększyć tło.
    4. Przemyć membranę 10 ml 0,05% Tween-20 w PBS i dodać 10 μl fluorescencyjnej streptawidyny (patrz tabela materiałów/odczynników) rozpuszczonych w 10 ml buforu blokującego plus 0,1% Tween-20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj 4 razy 0,05% Tween-20 w PBS i raz samym PBS (10 min każdy).
    6. Użyj skanera obrazu (patrz Tabela materiałów/odczynników). Włącz instrument i podłączony komputer. Poczekaj, aż będziesz gotowy.
    7. Uruchom program akwizycji i wybierz tryb fluorescencji. Wybierz obszar membrany i wybierz folder docelowy dla zapisanych plików.
    8. Ustaw następujące parametry akwizycji: długość wzbudzenia 680 nm, filtr BPFR700, wartość lampy fotopowielacza 1 000 V (PMT) (kanał 2) i rozmiar piksela 25 μm. Uzyskaj obraz.

4. Lokalizacja katalitycznie aktywnego NAAA w płucach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: Używaj samców myszy w wieku od 8 do 10 tygodni i wykonuj wszystkie procedury zgodnie z wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt. Trzymaj myszy w wentylowanych klatkach w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i zapewnij im swobodny dostęp do jedzenia i wody.

  1. Dożylne podawanie ARN14686 myszom
    1. Rozpuścić ARN14686 w podłożu: 15% PEG i 15% roztwór soli fizjologicznej Tween-20. Obliczyć stężenie roztworu w zależności od masy ciała myszy (dawka 3 mg/kg, objętość wstrzyknięcia 5 ml/kg).
    2. Kontynuuj wstrzyknięcie dożylne 3 myszom. Umieść każdą mysz w odpowiednim plastikowym urządzeniu przytrzymującym. Następnie umieść ogon myszy w ciepłej wodzie na 2-4 minuty, aby umożliwić rozszerzenie naczyń krwionośnych i wstrzyknij związek dożylnie przez żyłę ogonową.
    3. Wstrzyknąć 3 myszy dożylnie tylko z nośnikiem.
  2. Pobieranie płuc i przygotowanie plastrów
    Ostrzeżenie: Z paraformaldehydem należy obchodzić się ostrożnie w dygestoriach i nosić rękawiczki!
    1. Znieczulić myszy hydratem chloralu (400 mg/kg). Potwierdź znieczulenie szczyptą palca u nogi. Wykonaj perfuzję przezsercową w następujący sposób:
      1. Powierzchownie przeciąć skórę brzuszną nożyczkami i odsłonić powierzchnie błony piersiowej i otrzewnej.
      2. Powierzchownie przeciąć błonę otrzewną nożyczkami, tuż poniżej wyrostka ksylifoidalnego i odsłonić przeponę i narządy trzewne. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnego znaczącego układu naczyniowego.
      3. Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę od jednego bocznego aspektu do drugiego.
      4. Wprowadzić igłę 25 G podłączoną do automatycznej pompy strzykawkowej i wlać 20 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej, a następnie 60 ml 4% PFA do buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,4).
    2. Po zakończeniu perfuzji pociągnij serce za pomocą kleszczy i ostrożnie je wypreparuj. Chwyć tchawicę kleszczami i przetnij ją całkowicie nożyczkami. Delikatnie pociągnij tchawicę do góry i wyjmij płuca z klatki piersiowej. Wypreparuj tkankę, aby oddzielić prawe płuco od lewego.
    3. Utrwalić tkankę w paraformaldehydzie 4% przez 1 godzinę, zamrozić próbki w zimnym 2-metylobutanie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    4. Zbierz skrawki 40 μm za pomocą kriostatu, zamontuj je natychmiast na szkiełkach (jeden co piąty) i przetwórz je do immunohistochemii, jak opisano poniżej.
  3. Przenikanie i blokowanie plastrów tkanek
    1. Płukać PBS (2x przez 5 min) i przepuszczać 0,1% Triton X-100 PBS przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyć PBS (2x przez 5 min) i zablokować 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 30 min w RT.
    3. Umyć PBS (2x przez 5 min) i kontynuować CC.
  4. CC z Azide-PEG3-Fluor 545 na wycinkach tkanek
    1. Przygotować roztwór, mieszając odczynniki CC przygotowane w sposób opisany w punkcie 2. Na 1 ml roztworu dodać: 2 μl Azide-PEG3-Fluor 545 (5 mM zapasu), 20 μl TCEP (świeżo przygotowany zapas 50 mM), 58,8 μl TBTA (świeżo przygotowany roztwór roboczy 1,7 mM), 20 μl CuSO4·5H2O (50 mM zapas) i 900 μl PBS.
    2. Dodać około 400 μl mieszanki CC do wycinków tkanki, które zostały przygotowane zgodnie z sekcją 4.2. Zwróć uwagę, aby wybrana objętość mieszanki CC była wystarczająca do przykrycia plastrów. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    3. Przemyć PBS (1x przez 5 min), zimnym metanolem (1x przez 5 min), roztworem 1% Tween-20 i 0,5 mM EDTA w PBS (3x przez 2 min) i PBS (1x przez 5 min).
    4. Wysuszyć na powietrzu, dodać kroplę środka zapobiegającego blaknięciu za pomocą DAPI (patrz tabela materiałów/odczynników), zamknąć szkiełkami nakrywkowymi (unikając tworzenia się pęcherzyków) i uszczelnić pastą. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
  5. Akwizycja obrazu
    1. Używaj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w lasery wzbudzające 546 nm i 450 nm (patrz tabela materiałów/odczynników) zgodnie z instrukcją obsługi.
    2. Wybierz soczewkę obiektywową 60X o NA = 1,40, upewniając się, że podgląd szkiełka przechodzi przez okulary i skupia się na obszarze zainteresowania.
    3. Określ parametry akwizycji zgodnie z próbką i cechami sprzętu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Związek ARN14686 został zaprojektowany w oparciu o strukturę inhibitora NAAA, ARN726. Grupę 4-butylocykloheksylową w ARN726 zastąpiono nasyconym łańcuchem alifatycznym C9 z terminalną znacznikową grupą alkinową (Rysunek 1). Znacznik alkinowy wprowadzono w celu umożliwienia zastosowania dwuetapowej procedury znakowania, pozwalającej na dołączenie fluoroforu lub cząsteczki biotyny poprzez reakcję CC. Ta cecha sprawia, że ARN14686 jest bardzo wszechstronnym narzędziem do bad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aktywność enzymu jest precyzyjnie regulowana na różnych poziomach, w tym transkrypcji RNA, syntezy białek, translokacji białek, modyfikacji potranslacyjnej i interakcji białko-białko. Często sama ekspresja enzymu nie odpowiada za jego aktywność. ABPP został opracowany w celu badania aktywności białek w ich stanie naturalnym. Wymagane są dwie funkcje: sonda chemiczna, która kowalencyjnie wiąże się z miejscem aktywnym enzymu będącego przedmiotem zainteresowania oraz znacznik reporterowy do wykrywania enzymu znakowanego son...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Centrum Obrazowania Nikon w Istituto Italiano di Tecnologia, Genua, Włochy (NIC@IIT).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,1'-sulfonyldiimidazol Sigma Aldrich367818Szkodliwy
węglan 2-dipyrydyluFluorochem11331Szkodliwy
2-metylobutanSigma AldrichM32631Łatwopalny, toksyczny, niebezpieczny dla środowiska wodnego
4-(dimetyloamino)pirydynaSigma Aldrich107700Toksyczny
kwas octowySigma Aldrich695092Łatwopalny,
Acetonitryl Sigma Aldrich34998Łatwopalny, toksyczny
węgiel aktywnySigma Aldrich161551
Chlorek amonuSigma AldrichA9434Szkodliwy
Azide-PEG3-BiotynaJena BiosciencesCLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Fisher Scientific23227
Kolumny Bio-spinBiorad732-6204
BiotynaSigma AldrichB4501
Bufor blokującyLi-Cor Biosciences927-40000
β-merkaptoetanolSigma AldrichM6250Wysoce toksyczna
albumina surowicy Bovin (BSA)Sigma AldrichA7030
Błękit bromofenolowySigma AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
CeliteSigma Aldrich419931Zagrożenie dla zdrowia
Azotan cerowo-amonowy Sigma Aldrich22249Utleniający, szkodliwy
hydrat chloraluSigma AldrichC8383Wysoce toksyczny
CuSO4.5H2O Sigma Aldrich209198Toksyczny
cykloheksadienSigma Aldrich125415Łatwopalny, Zagrożenie dla zdrowia
CykloheksanSigma Aldrich34855Łatwopalny, Szkodliwy, Zagrożenie dla zdrowia, Zagrożenie dla środowiska
DichlorometanSigma Aldrich34856Szkodliwy, Zagrożenie dla zdrowia
Eter dietylowySigma Aldrich296082Łatwopalny, Szkodliwy
dimetylosulfotlenek (DMSO)Acros Organics348441000
Dimetylosulfotlenek d6 (DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
EtanolSigma Aldrich2860Łatwopalny, Szkodliwy
octan etyluSigma Aldrich34858Łatwopalny, Szkodliwy
glicerolSigma AldrichG5516
Irdye 680-LT StreptavidinLi-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT Streptawidyna Licor925-68031Krótko odwirować przed użyciem w celu wytrącenia kompleksów białkowych
MetanolSigma Aldrich34966Wysoce toksyczny
metanolSigma Aldrich34860Łatwopalny, toksyczny, zagrożenie dla zdrowia
N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′ -etylokarbodiamid chlorowodorekSigma AldrichE7750Szkodliwy,
N,N-diizopropyloetyloaminaSigma AldrichD125806Łatwopalny,, toksyczny
N,N-dimetyloformamidSigma Aldrich227056Łatwopalny, Szkodliwy, Zagrożenie dla zdrowia
N-Cbz-L-serynaFluorochemM03053Szkodliwa
mikroskopia konfokalna Nikon A1NikonPrzeczytaj instrukcję obsługi
NuPAGE 4-12% żel Bis-TrisThermo Fisher ScientificNP0335BOX
Pallad na węgluSigma Aldrich330108
p-anizydynaSigma AldrichA88255Toksyczny, Zagrożenie dla zdrowia, Zagrożenie
dla środowiskaParaformaldehydsigma Aldrich441244Toksyczny, szkodliwy dla dróg oddechowych,, falmowalny
Poli(glikol etylenowy) Mocowanie przeciwblaknięcie Sigma AldrichP3265
ProLong Gold z DAPI Thermo Fisher ScientificP36931Unikaj tworzenia się pęcherzyków
Koktajl inhibitorów proteazySigma AldrichP8340
Wodorowęglan soduSigma AldrichS6014
Dodecylosiarczan sodu (SDS) Sigma AldrichL3771Toksyczny,, falmowalny
Wodorek sodu Sigma Aldrich452912Łatwopalny
siarczan soduSigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 skaner immageFUJIFILMPrzeczytaj  instrukcję obsługi
Streptawidyna agarozaThermo Fisher Scientific20349
SacharozaSigma AldrichS7903
Tert-butanolSigma Aldrich360538Toksyczny, łatwopalny
TetrahydrofuranSigma Aldrich186562Łatwopalny, szkodliwy, zagrożenie dla zdrowia
TiomocznikAcros Organics424542500Toksyczny, ciepły w 50 & stopni; C do rozpuszczenia
TrisSigma AldrichRDD008
Tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Sigma AldrichC4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)Sigma Aldrich678937
Triton-x100Sigma AldrichX100Toksyczny
Tween-20Sigma AldrichP9416
Tween-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 podstawowy homogenizator tkankowyIKA
Undec-10-yn-1-olFluorochem13739
Szkodliwy mocznikSigma AldrichU5378Toksyczny, ciepły w temperaturze 50 &; C, aby rozpuścić

Bibliografia

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chemia klikwestern blottingmikroskopia fluorescencyjnawzbogacanie streptawidynskrawki tkanekaktywacja enzymutkanki gryzonisynteza sondy

Powiązane artykuły