Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Podsumowanie

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Streszczenie

Badania oparte na transferze energii rezonansu (FRET) stają się coraz bardziej powszechne w badaniach nad sygnalizacją GPCR. Nasza grupa badawcza opracowała wewnątrzcząsteczkowy czujnik FRET do wykrywania interakcji między podjednostkami Gα a GPCR w żywych komórkach po stymulacji agonistycznej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wykrywania zmian w FRET między receptorem 2-adrenergicznym β a peptydem C-końca Gαs po leczeniu chlorowodorkiem izoproterenolu 100 μM, jak wcześniej scharakteryzowano¹. Nasz czujnik FRET jest pojedynczym polipeptydem składającym się szeregowo z GPCR o pełnej długości, fluoroforu akceptorowego FRET (mCitrine), łącznika ER / K SPAT (systematyczna modulacja siły powinowactwa do białek), fluoroforu donorowego FRET (mCerulean) i peptydu C-końcowego Gα. Protokół ten szczegółowo opisze przygotowanie komórek, warunki transfekcji, konfigurację sprzętu, wykonanie testu i analizę danych. Ten eksperymentalny projekt wykrywa niewielkie zmiany w FRET wskazujące na interakcje białko-białko, a także może być wykorzystany do porównania siły oddziaływania między ligandami i parami białek GPCR-G. Aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu w naszych pomiarach, protokół ten wymaga zwiększonej precyzji na wszystkich etapach i jest prezentowany tutaj, aby umożliwić powtarzalne wykonanie.

Wprowadzenie

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) to receptory siedmioma transbłonowymi. Sam ludzki genom zawiera około 800 genów kodujących GPCR, które są aktywowane przez różne ligandy, w tym światło, substancje zapachowe, hormony, peptydy, leki i inne małe cząsteczki. Prawie 30% wszystkich farmaceutyków dostępnych obecnie na rynku jest ukierunkowanych na GPCR, ponieważ odgrywają one dużą rolę w wielu stanach chorobowych². Pomimo dziesięcioleci szeroko zakrojonych prac nad tą rodziną receptorów, nadal istnieją istotne nierozstrzygnięte pytania w tej dziedzinie, szczególnie w odniesieniu do mechanizmów molekularnych, które napędzają interakcje GPCR-efektor. Do tej pory opublikowano tylko jedną strukturę krystaliczną o wysokiej rozdzielczości, która dostarcza informacji na temat interakcji między receptorem_{β 2-adrenergicznym} (β_2-AR) a białkiem Gs³. Wraz z szeroko zakrojonymi badaniami prowadzonymi w ciągu ostatnich trzech dekad, potwierdza to jeden konkretny składnik strukturalny, który ma kluczowe znaczenie w tej interakcji: C-koniec podjednostki Gα. Struktura ta jest ważna zarówno dla aktywacji białka G przez GPCR⁴, jak i selekcji białka G^5-6. W związku z tym C-koniec Gα stanowi kluczowe ogniwo między stymulacją liganda GPCR a selektywną aktywacją białka G.

Badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady sugerują, że GPCR zaludniają szeroki krajobraz konformacyjny, z podzbiorami konformacji GPCR wiążącymi ligandy. Chociaż dostępnych jest kilka technik, w tym krystalografia, NMR i spektroskopia fluorescencyjna oraz spektrometria mas do badania krajobrazu konformacyjnego GPCR, brakuje podejść do wyjaśnienia ich funkcjonalnego znaczenia w doborze efektorów⁷. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na rezonansowym transferze energii Fӧrster (FRET) do wykrywania selektywnych konformacji GPCR w białku G. FRET opiera się na bliskości i równoległej orientacji dwóch fluoroforów o nakładających się widmach emisji (donor) i wzbudzenia (akceptor)⁸. W miarę zbliżania się do siebie fluoroforów donorowych i akceptorowych w wyniku zmiany konformacyjnej białka lub interakcji białko-białko, FRET między nimi wzrasta i można go zmierzyć przy użyciu szeregu metod⁸. Bioczujniki oparte na FRET są szeroko stosowane w dziedzinie GPCR⁹. Zostały one wykorzystane do badania zmian konformacyjnych w GPCR poprzez wstawienie donora i akceptora do trzeciej pętli wewnątrzkomórkowej i C-końca GPCR; czujniki zostały zaprojektowane do badania interakcji GPCR i efektorowych poprzez oddzielne znakowanie GPCR i efektora (podjednostek/aresztsyn białka G) za pomocą pary FRET¹⁰; niektóre czujniki wykrywają również zmiany konformacyjne w białku G¹¹. Te bioczujniki umożliwiły tej dziedzinie zadanie wielu nierozstrzygniętych pytań, w tym zmian konformacyjnych w GPCR i efektorze, kinetyki interakcji GPCR-efektor i ligandów allosterycznych¹². Nasza grupa była szczególnie zainteresowana stworzeniem bioczujnika, który mógłby wykrywać konformacje GPCR specyficzne dla białka G w warunkach zależnych od agonistów. Ten bioczujnik opiera się na niedawno opracowanej technologii o nazwie SPASM (systematic protein affinity strength modulation)¹³. SSKURCZ polega na wiązaniu oddziałujących domen białkowych za pomocą łącznika ER/K, który kontroluje ich efektywne stężenia. Otoczenie łącznika parą fluoroforów FRET tworzy narzędzie, które może raportować stan interakcji między białkami¹². Poprzednio¹ moduł SPASM był używany do wiązania C-końca Gα z GPCR i monitorowania ich interakcji z fluoroforami FRET, mCytryną (określaną w tym protokole przez jej powszechnie znany wariant, Żółte Białko Fluorescencyjne (YFP), szczyt wzbudzenia/emisji przy 490/525 nm) i mCerulean (określany w tym protokole przez powszechnie znany wariant Cyan Fluorescent Protein (CFP), szczyt wzbudzenia/emisji 430/475 nm). Od końca N do C, ten genetycznie kodowany pojedynczy polipeptyd zawiera: GPCR o pełnej długości, akceptor FRET (mCitrine/YFP), łącznik ER/K 10 nm, donor FRET (mCerulean/CFP) oraz peptyd Gα C-końcowy. W tym badaniu czujniki są w skrócie określane jako peptyd GPCR-linker length-Gα. Wszystkie komponenty są oddzielone nieustrukturyzowanym linkerem (Gly-Ser-Gly)₄, który umożliwia swobodną rotację każdej domeny. Szczegółowa charakterystyka takich czujników została wcześniej przeprowadzona przy użyciu dwóch prototypowych GPCR: β_2-AR i opsin¹.

Ten czujnik jest przejściowo transfekowany do komórek HEK-293T, a eksperymenty na żywych komórkach oparte na fluorometrze mierzą widma fluorescencji pary FRET w dowolnych jednostkach zliczeń na sekundę (CPS) w obecności lub braku ligandu. Pomiary te służą do obliczenia stosunku FRET między fluoroforami (YFP_max/CFP_max). Zmianę FRET (ΔFRET) oblicza się następnie poprzez odjęcie średniego stosunku FRET próbek niepoddanych działaniu substancji od współczynnika FRET próbek poddanych działaniu liganda. ΔFRET można porównać między konstruktami (β peptyd 2-AR-10 nm-Gαs w porównaniu z peptydem_2-AR-10 nm-no β). W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół ekspresji tych czujników w żywych komórkach HEK-293T, monitorowania ich ekspresji oraz konfiguracji, wykonywania i analizy pomiaru FRET na żywych komórkach opartego na fluorometrze w stanach nieleczonych w porównaniu z lekami. Chociaż protokół ten jest specyficzny dla czujnika peptydowego_β 2-AR-10 nm-Gαs poddanego działaniu dwuwinianu izoproterenolu 100 μM, można go zoptymalizować dla różnych par i ligandów GPCR-Gα.

Protokół

1. Przygotowanie DNA

1. Zaprojektuj konstrukty sensorowe, stosując modularny schemat klonowania. Należy odnieść się do projektu sensora β₂-AR opisanego wcześniej¹.
2. Przygotuj DNA zgodnie z protokołem komercyjnego zestawu do miniprepu i eluuj w 2 mM roztworze Tris-HCl, pH 8, przy stężeniu ≥ 750 ng/µl, A₂₆₀/A₂₈₀ w zakresie 1,7 - 1,9 oraz A₂₆₀/A₂₃₀ w zakresie 2,0 - 2,29.

2. Przygotowanie hodowli komórkowej

1. Hodować komórki HEK-293T-Flp-n w medium DMEM zawierającym 4,5 g/L D-glukozy, uzupełnionym o 10% FBS (inaktywowany ciepłem) (v/v), 1% suplement L-glutaminy, 20 mM HEPES, pH 7,5 w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej z 5% CO₂. W kolejnych etapach manipulować komórkami w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Pozostawić komórki do momentu uzyskania konfluencyjnej monowarstwy przed przeniesieniem do płytek sześcio-dołkowych. Czas osiągnięcia konfluencji zależy od początkowej gęstości wysiewu. Do wysiewu w płytkach sześcio-dołkowych należy używać płytek, które osiągają konfluencję w ciągu 1 - 2 dni od wysiewu. Konfluencyjna płytka hodowlana o średnicy 10 cm ma gęstość komórek wynoszącą około 4 x 10⁶ komórek/ml. Obraz wzrostu hodowli komórkowej przedstawiono na Rysunku 1.
3. Przemyć komórki 10 ml PBS i poddać trypsynizacji przy użyciu 0,25% trypsyny (patrz Dyskusja, akapit 2). Wysiać 8 x 10⁵ komórek/dołek w 2 ml medium w płytkach sześcio-dołkowych przeznaczonych do hodowli tkanek i pozostawić do adhezji na 16 - 20 h.

3. Warunki transfekcji

1. Zastosuj przesunięcie czasowe transfekcji dla konstruktów, które mogą wymagać różnych przedziałów czasowych w celu osiągnięcia optymalnej ekspresji (między 20 a 36 h). Zsynchronizuj warunki w celu ujednolicenia czasu trwania eksperymentu. Przygotuj również kontrolną studzienkę z komórkami nietransfekowanymi o analogicznej gęstości, która posłuży do odjęcia szumu tła i rozproszenia podczas analizy.
2. Doprowadzić odczynniki do transfekcji do temperatury pokojowej: pożywkę z obniżoną zawartością surowicy, DNA oraz odczynnik do transfekcji.
3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznym) połączyć odczynniki w sterylnej probówce do mikrocentryfugi w następującej kolejności: wymieszać 2 µg DNA z 100 µl pożywka z obniżoną zawartością surowicy. Spike 6 µl odczynnika do transfekcji do mieszaniny pożywki i DNA, nie dotykając powierzchni mieszaniny ani ścianek probówki. Przygotować jedną reakcję transfekcji na każdą studzienkę. Warunki transfekcji można zoptymalizować (1 - 4 µg DNA, 3 - 6 µl odczynnika do transfekcji) w celu uzyskania spójnych poziomów ekspresji. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania bardziej zoptymalizowanych proporcji.
4. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 15–30 min. Nie używać mieszaniny reakcyjnej, jeśli czas inkubacji przekroczył 30 min.
5. Dodaj odczynnik do komórek w postaci kropel w obrębie studzienki i delikatnie wstrząśnij płytką sześciostudzienkową, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Dodaj jedną porcję odczynnika na każdą studzienkę.
6. Po 20 godzinach ekspresji należy monitorować fluorescencję za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu do hodowli tkankowych. Ekspresję w populacji należy ocenić przy użyciu obiektywu 10X, a lokalizację białka w komórce przy użyciu obiektywu 40X. Należy obserwować ekspresję białka w błonie plazmatycznej (PM). Jeśli stwierdzono znaczną internalizację, należy monitorować transfekcję do momentu wykrycia istotnej ekspresji w błonie plazmatycznej.

4. Przygotowanie odczynników i sprzętu

1. Przygotować 10 mM zapasy leku i przechowywać w temperaturze -80 °C: bitartrat izoproterenolu (10 mM w dH₂O zawierającej 30 mM kwasu askorbinowego). Przygotować na lodzie/w pomieszczeniu chłodniczym i natychmiast zamrozić szokowo. Alikwoty można przygotować i przechowywać do jednego roku.
2. Przygotować bufor komórkowy (~ 2 ml na warunek) i przechowywać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przygotowywać świeżą porcję każdego dnia. Składniki buforu komórkowego znajdują się w Tabeli 2.
3. Przygotować bufor lekowy (10 ml) i przechowywać w temperaturze pokojowej. Składniki buforu lekowego znajdują się w Tabeli 2.
4. Przemyć kuwety kwasem, używając stężonego HCl. Zneutralizować słabą zasadą (1 M KOH), a następnie dokładnie wypłukać kuwety wodą dH₂O.
5. Przygotować stanowisko pracy wokół fluorometru, wyposażając je w kilka pudełek końcówek do pipet o pojemności 10, 20 i 100 µl, minutnik ustawiony na 10 min, dostępną linię próżniową z końcówkami do czyszczenia kuwet, chusteczki do zadań precyzyjnych oraz butelkę z wodą ultraczystą H₂O.
6. Nagrzać zewnętrzną kąpiel wodną dla fluorometru oraz blok grzewczy do 37 °C.
7. Włączyć fluorometr; ustawić program detekcji fluorescencji dla CFP na wzbudzenie 430 nm, pasmo przepustowości 8 nm; zakres emisji 450 nm - 60 nm, pasmo przepustowości 4 nm. Dla detekcji YFP, służącej wyłącznie jako kontrola sensora (patrz Dyskusja), ustawić wzbudzenie na 490 nm, pasmo przepustowości 8 nm, zakres emisji 50 - 60 nm, pasmo przepustowości 4 nm. Ustawienia detekcji CFP zostaną wykorzystane do uzyskania widma FRET w tym eksperymencie.
8. Umieścić dwanaście probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w bloku grzewczym, jak pokazano na Rysunku 2 poniżej. Probówki te służą jako uchwyty dla probówek z alikwotami komórek (probówki do mikrocentryfugi 50 µl). W uchwytach 1 i 7 umieścić niewielki kawałek tkanki, aby zamortyzować umieszczone tam kuwety.
   Uwaga: Należy używać osobnych kuwet dla warunku nieleczonego i warunku z lekiem, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.

Rysunek 2. Przygotowanie probówek do mikrowirówki i referencyjne rozmieszczenie w bloku grzewczym. Kuweta dla próbek niepoddanych działaniu leku znajduje się w pozycji 1; probówki z alikwotami komórek znajdują się w pozycjach 2–6. Kuweta dla próbek poddanych działaniu leku znajduje się w pozycji 7; probówki z alikwotami komórek znajdują się w pozycjach 8–12. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

9. Napełnić uchwyty 2 - 6 oraz 8 - 12 około 750 µl wody, aby stworzyć miniaturową kąpiel wodną o temperaturze 37 °C.
10. Umieścić dziesięć probówek do mikrocentryfugi o pojemności 50 µl z alikwotami komórek w miniaturowych kąpielach wodnych (uchwyty 2 - 6, 8 - 12). Każda probówka będzie stanowić pojedynczy powtórzenie danej warunków (5 nieleczonych, 5 leczonych lekiem).
11. Monitorować ekspresję w komórkach (patrz krok 3.6).

5. Eksperyment i zbieranie danych

Rysunek 3. Schemat doświadczenia. Szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania i przeprowadzenia eksperymentu. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Bibliografia Rysunek 3 do schematu doświadczalnego. Gdy komórki będą gotowe do zebrania, na podstawie ekspresji białka wykrytej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz Dyskusja, akapit 4): w komorze z laminarnym przepływem powietrza delikatnie usunąć ok. 1 ml pożywki, resuspender komórki w ich hodowli za pomocą końcówki P1 0 i przenieść resuspensję do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
   Uwaga: Należy unikać stosowania trypsyny, ponieważ może ona strawić koniec N-końcowy i/lub kieszeń wiążącą sensora GPCR.
2. Policz komórki, aby upewnić się, że w zawiesinie uzyskano odpowiednią gęstość komórek. Zoptymalizuj objętość resuspensji dla 4 x 10⁶ komórek/ml
3. Wirować komórki w wirówce z koszykami wahadłowymi w temperaturze pokojowej przy 290 x g przez 3 min. Po wirowaniu usunąć nadfiltr.
4. DELIKATNIE resuspendować komórki w 1 ml buforu do komórek (przechowywanego w 37 °C) i powtórz krok 5.3. Podczas drugiego wirowania pobierz alikwot 10 mM roztworu zapasu leku z -80 °CPrzygotować rozcieńczenie 1:100 w buforze do leku (Drug Buffer), aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 1 mM, i przechowywać w temperaturze pokojowej.
5. Po drugim wirowaniu należy usunąć nadkład i ostrożnie resuspenderować komórki w 1 ml buforu do komórek (4 x 10⁶ komórek/ml). Zmierzyć OD₆₀₀ próbki w spektrofotometrze, używając 1 ml komórek, a w ramach próbki zerowej (blank) 1 ml buforu do komórek (Cell Buffer). Należy przenieść komórki do jednorazowej plastikowej kuwety, a bezpośrednio po pomiarze spektrofotometrycznym przenieść je z powrotem do probówki do mikrocentryfugi.
6. W celu uzyskania widma kontrolnego dla komórek nietransfekowanych, delikatnie resuspender komórki nietransfekowane w 1 ml buforu do komórek (Cell Buffer) za pomocą pipety P10, dodać 90 µl komórek do kuwety i zarejestruj widmo FRET przy wzbudzeniu 430 nm, pasmie przepustowym 8 nm, emisji 450–60 nm, pasmie przepustowym 4 nm. Pobierz 3–5 powtórnych widm z nowej 90 µl komórek. Przechowywać zapas komórek w 37 °C pomiędzy pomiarami delikatnie resuspender za pomocą pipety P10 pomiędzy każdą alikwotą próbki, a kuwetę przepłukać wodą ultraczystą H2O₂O pomiędzy próbkami.
7. W zależności od warunków eksperymentalnych, odmierzyć aликwoty 90 µl transfekowanych komórek do każdej z 500 µl probówki w uchwytach 2–6 oraz 8–12 w bloku grzewczym. Między każdą alikwotacją delikatnie resuspendować zapas komórek za pomocą pipety P10.
8. Po rozdzieleniu komórek na aliquoty należy dodać 10 µl buforu do leku do probówek 2–6 dla próbek w warunkach nieleczonych.
9. Rozpocząć eksperyment poprzez dodanie 10 µl do probówki 8 1 mM roztworu leku, uruchomić timer z odliczaniem od 10 min i delikatnie wymieszać zawartość probówki za pomocą pipety P20. Zamknąć probówkę i zwrócić do 37 °C blok grzejny
10. Bezzwłocznie pobrać probówkę 2, delikatnie wymieszać za pomocą pipety P200 (używając nowej końcówki), dodać 90 µl zawiesiny komórkowej do kuwety z warunkiem kontrolnym (niepoddanym działaniu), a następnie umieść w fluorometrze.
11. Należy zarejestrować widmo FRET przy wzbudzeniu 430 nm, szerokości pasma 8 nm oraz emisji 450–60 nm, szerokości pasma 4 nm.
12. W czasie 9 min – 10 s do probówki 9 należy dodać 10 µl do 1 mM roztworu leku, delikatnie wymieszać za pomocą pipety P20 (używając nowej końcówki), a następnie umieścić probówkę z powrotem w bloku grzewczym.
13. Powtórzyć kroki 5.10–5.1 dla probówki 3 oraz krok 5.12 dla probówki 10.
14. Powtórz kroki 5.10 – 5.13 w odstępach 1 min (08:10, 07:10, itd.), aż do momentu zebrania widm dla wszystkich próbek w warunkach bez leku oraz dodania leku do wszystkich próbek w warunkach z lekiem. Podczas każdego etapu pipetowania należy używać nowej końcówki, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
15. W czasie 5 min - 10 s należy rozpocząć delikatne mieszanie zawartości probówki 8 (warunki z lekiem) za pomocą pipety P20, a następnie dodać 90 µl przenieść zawiesinę komórkową do oddzielnej kuwety dla próbki poddanej działaniu leku i umieścić w fluorometrze.
16. Należy zarejestrować widmo FRET (patrz krok 5.1 w celu zapoznania się z ustawieniami).
17. Powtórz kroki 5.15 – 5.16 w odstępach 1-minutowych (04:10, 03:10, itp.) dla pozostałych próbek w warunkach podania leku (probówki 9–12).
18. Po zakończeniu eksperymentu należy zapisać pliki projektu i dokładnie umyć kuwety wodą ultraczystą H2O₂O, a następnie uzupełnij zapas probówek dla kolejnego stanu. Należy zadbać o to, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej podczas etapu płukania. Wymień końcówkę w H₂W butelce, a także w linii próżniowej pomiędzy kolejnymi etapami przemywania.

6. Analiza danych

1. Zapisz i wyeksportuj pliki danych w formacie SPC do późniejszej analizy. Programy analityczne są dostępne do pobrania ze strony publikacji Laboratorium Sivaramakrishnan.
2. Utwórz pliki ścieżek dla oprogramowania analitycznego, które zawierają programy analizy (v9, v15), pliki próbek nietransfekowanych (patrz krok 5.6 w sekcji zbierania widm komórek nietransfekowanych), plik danych wyjściowych (OUTPUT) oraz pliki wartości rozdzielonych przecinkami (CSV) do wprowadzania danych.
3. Wprowadź następujące informacje do pliku CSV (patrz przykład w Tabeli 3) i przypisz odpowiednie warunki dla każdej próbki, w tym:
   Nazwa pliku – poszczególne pliki wykresów SPC
   Receptor – określ, który konstrukt GPCR został przebadany (np. Β2)
   Łącznik (Binder) – określ, który wariant peptydowy konstruktu został przebadany (np. S)
   Agonista – określ warunki nieleczone (N) lub leczone lekiem (D)
   Katalog – folder ze ścieżką, w którym zapisano pliki SPC, zazwyczaj zorganizowany według daty
   OD – zarejestrowana gęstość optyczna próbki z spektrofotometru
4. Wprowadź nazwy plików dla próbek nietransfekowanych (krok 5.6), aby odjąć tło buforu i szum rozproszony od próbek.
5. Wprowadź warunki do programu analitycznego.
6. Uruchom programy w celu analizy próbek w ramach poszczególnych warunków (v9) oraz pomiędzy warunkami (v15).
7. Wyklucz pliki próbek, które są ewidentnymi wartościami odstającymi w zestawie danych, lub dostosuj odejmowanie poprzez zwiększenie lub zmniejszenie wartości OD poszczególnych plików.
8. Wyeksportuj dane do pliku OUTPUT w celu uzyskania dostępu do obliczonych stosunków FRET (525 nm/475 nm).
9. Oblicz ΔFRET, odejmując średni stosunek FRET dla warunku nieleczonego od poszczególnych stosunków FRET dla warunków leczonych (lekiem).

Wyniki

Uogólniony schemat konfiguracji i przebiegu eksperymentu szczegółowo przedstawiono na Ryc. 3.

Aby wykryć zmianę FRET w wąskim zakresie dynamicznym sensora, kluczowe jest przestrzeganie niuansów systemu. Jakość komórek ma fundamentalne znaczenie zarówno dla ekspresji białek, jak i spójności pobieranych próbek. Rysunek 1 przedstawia obrazy hodowlanych komórek rosnących w jednolitej warstwie (10X), co jest optymalne dla wysiewu na płytki sześciodołkowe i transfek...

Dyskusja

Wąski zakres dynamiki pomiarów FRET w tym systemie wzmacnia konieczność czułej kontroli jakości na każdym etapie tego protokołu. Najważniejszymi krokami zapewniającymi udany eksperyment FRET są: 1) hodowla komórek, 2) transfekcja, 3) ekspresja białek oraz 4) terminowa, precyzyjna koordynacja podczas wykonywania testu.

Zdrowie komórek i jakość konserwacji/posiewu mogą mieć znaczący wpływ na stosunek sygnału do szumu w systemie eksperymentalnym, a zły stan komórek może uniemożliwić wykrycie jaki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B2-AR-10 nm-Czujnik peptydowy gazu	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Zestaw miniprep plazmidu	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Elute w 2 mM Bufor elucyjny Tris
Komórki HEK-293T-Flp-n	Life Technologies	R78007
Trypsyna (0,25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- wysoki poziom glukozy	Life Technologies	11960-044	Ciepły w  37 ° C kąpiel wodna przed użyciem
FBS, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie amerykańskie	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Zredukowane podłoża surowicy; Przynieś do RT przed użyciem
XtremeGene HP transfection reagenet	Roche	6366236001	Wysoce zalecane ze względu na jego konsystencję. Przynieś do RT przed użyciem
FluoroMax 4	Horiba		Użyj z oprogramowaniem FluorEssence V3.8
Kuweta kwarcowa o długości ścieżki 3 mm	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	Może wymagać uchwytu/adaptera kuwety do użytku z fluorometrem, dostępny w Starna
Sc100-S3 Podgrzewana pompa do kąpieli cyrkulacyjnej Fisher	Scientific	13-874-826	Ciepła do 37 & stopni; C przed użyciem
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Ciepły do 37 & stopni; C przed użyciem
Ultraczysta woda wolna od DNA/RNAzy	Life Technologies	10977015	Stosować w RT
D(+)-glukoza, bezwodna aprotynina	Sigma	G5767
z płuc bydlęcych	Sigma	A1153
hemisulfian leupeptyny	EMD	10-897
Kwas L-askorbinowy, klasa odczynnika	Sigma	A0278
(-)- izoproterenol (+)-dwuwinian	Sigma	I2760	Użyj świeżej porcji w każdym eksperymencie