Mysi model ostrego uszkodzenia płuc z otwartą tracheostomią do aspiracji kwasu żołądkowego skutkuje maksymalnym ostrym nieśmiertelnym uszkodzeniem płuc

Podsumowanie

Ten protokół wywołuje ostre uszkodzenie płuc u myszy, która jest bardzo zbliżona do patogenezy kwaśnego zapalenia płuc obserwowanej u ludzi. Generujemy maksymalne ostre, nieśmiertelne uszkodzenie płuc o niskim pH i uwzględniamy różnice w anatomicznej budowie układu oddechowego gryzoń i człowieka za pomocą otwartej tracheostomii w połączeniu ze zwolnieniem ciśnienia obwodowego.

Streszczenie

Kwaśne zapalenie płuc jest główną przyczyną sterylnego ostrego uszkodzenia płuc (ALI) u ludzi. Kwaśne zapalenie płuc obejmuje spektrum kliniczne od zespołu bezobjawowej do ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), charakteryzującego się neutrofilowym zapaleniem pęcherzyków płucnych oraz uszkodzeniem zarówno nabłonka pęcherzyków płucnych, jak i śródbłonka naczyniowego. Klinicznie ARDS definiuje się ostrym początkiem hipoksemii, obustronnymi niejednolitymi naciekami w płucach i niekardiogennym obrzękiem płuc. Badania na ludziach dostarczyły nam cennych informacji na temat fizjologicznych i zapalnych zmian w płucach spowodowanych przez ARDS, co doprowadziło do różnych hipotez na temat leżących u ich podstaw mechanizmów. Niestety, trudności w określeniu etiologii ARDS, a także szeroki zakres patofizjologii spowodowały brak krytycznych informacji, które mogłyby być przydatne w opracowywaniu strategii terapeutycznych.

Translacyjne modele zwierzęce są cenne, gdy ich patogeneza i patofizjologia dokładnie odtwarzają koncepcję sprawdzoną zarówno w warunkach in vitro, jak i klinicznych. Chociaż duże modele zwierzęce (np. owce) mają wspólne cechy anatomii ludzkiego drzewa tchawica-oskrzelowe, modele mysie zapewniają wiele innych zalet, w tym: niski koszt; krótki cykl rozrodczy sprzyja lepszemu pozyskiwaniu danych; dobrze poznany układ immunologiczny; oraz dobrze scharakteryzowany genom prowadzący do dostępności różnych delecji genów i szczepów transgenicznych. Solidny model ARDS indukowanego niskim pH wymaga mysiego ALI, który celuje głównie w nabłonek pęcherzyków płucnych, wtórnie śródbłonek naczyń krwionośnych, a także małe drogi oddechowe prowadzące do pęcherzyków płucnych. Ponadto ważne jest, aby uraz był powtarzalny i występuje duże różnice między różnymi zniewagami powodującymi i niepowodującymi szkody.

Prezentowany tutaj model aspiracji kwasu solnego mysiego wykorzystuje otwartą tracheostomię i odtwarza patogenny scenariusz, który odtwarza uszkodzenie zapalenia płuc o niskim pH u ludzi. Dodatkowo model ten może być wykorzystany do badania interakcji zaburzenia o niskim pH z innymi jednostkami uszkadzającymi płuca (np. cząstkami pokarmu, bakteriami chorobotwórczymi).

Wprowadzenie

ARDS charakteryzuje się rozległym zapaleniem płuc i klinicznie objawia się ostrą dusznością z hipoksemią. Objawy te często występują w czasie krótszym niż 24 godziny od zdarzenia wywołującego, takiego jak uraz, sepsa, reakcje związane z transfuzją krwi lub aspiracja. Charakteryzuje się histopatologicznie neutrofilowym zapaleniem pęcherzyków płucnych (tj. rozległym stanem zapalnym) zlokalizowanym w nabłonku pęcherzyków płucnych i śródbłonku naczyniowym, co prowadzi do wycieku białka, a następnie tworzenia się błony szklistej. Zachłystość jest klasyfikowana jako chemiczne zapalenie płuc lub zachłystowe zapalenie płuc. ¹ Kwaśny składnik aspiracji żołądka przyczynia się zarówno do zapalenia płuc, jak i predylekcji do rozwoju wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc. Zachłystowe zapalenie płuc jest jednym z głównych czynników ryzyka ALI i późniejszego rozwoju ARDS. ²

Aspiracja żołądka to ostre zdarzenie definiowane jako wdychanie materiałów z żołądka z florą ustno-gardłową lub bez niej do dróg oddechowych poza strunami głosowymi. Zawartość aspiratu może zawierać płyn żołądkowy o niskim pH, bakterie, krew lub cząstki pokarmu. Aspiracja żołądka często występuje u pacjentów na oddziale intensywnej terapii (OIOM), którzy zazwyczaj są na czczo i dlatego są podłączeni do inhibitora pompy protonowej w celu ograniczenia aspiracji zakwaszonej treści żołądkowej. Częstość występowania ALI w populacji OIOM w USA jest 2,5 - 5 razy wyższa w porównaniu z ogólną populacją pacjentów. ³ Niestety, te predysponujące warunki często prowadzą do stanu przerostu bakterii w żołądku, co może prowadzić do poważniejszych następstw w płucach po zachłyśnięciu, ponieważ aspiracja żołądka jest niezależnym czynnikiem ryzyka rozwoju wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc (SBP), ALI i ARDS.

Aspiracja żołądkowa składa się z dwóch głównych składników: kwasu solnego i treści żołądkowej, które mogą, ale nie muszą, zawierać bakterie lub cząstki żywności. W modelu gryzoni sam składnik kwasowy aspiracji żołądka wywołuje początkową reakcję zapalną w wyniku bezpośredniego uszkodzenia nabłonka dróg oddechowych o niskim pH. Po tym następuje naciek neutrofilowy i reakcja zapalna po 4 - 6 h.⁴ Te dwa czynniki ostatecznie prowadzą do zniszczenia integralności mikrokrążenia płucnego, prowadząc w ten sposób do wynaczynienia płynu i białek do pęcherzyków płucnych i dróg oddechowych. Aby zrozumieć tę patofizjologię i dalej badać możliwe interwencje terapeutyczne, ważne jest opracowanie i scharakteryzowanie modelu zwierzęcego, który wyjaśnia mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska. Sam kwaśny aspirat musi być obszerny lub o wystarczająco niskim pH, aby ominąć zdolność buforową drzewa oddechowego i dotrzeć do pęcherzyków płucnych. Jeśli tak się nie stanie, dochodzi tylko do przejściowego urazu górnych, przewodzących dróg oddechowych, który z mniejszym prawdopodobieństwem doprowadzi do poważnych następstw ARDS. ⁵

Aby dokładnie naśladować zdarzenie aspiracji z uszkodzonym nabłonkiem pęcherzyków płucnych, ważne jest ominięcie naturalnych mechanizmów obronnych zwierzęcia. Używając mysiego modelu aspiracyjnego do wytworzenia ALI, który naśladuje uszkodzenie kwasu żołądkowego obserwowane u ludzi, należy uwzględnić różnice w drzewie tchawicy i oskrzeli. Technika otwartej tracheostomii wykorzystywana w tej metodzie omija różnice między mysimi a ludzkimi drzewami oddechowymi i modeluje uraz w sposób, który odtwarza ALI zarówno fizjologicznie, jak i histologicznie. Historycznie intubacja dotchawicza była stosowana do generowania ALI, jednak uważa się, że jest trudna do wykonania u myszy bez urazu krtani. W związku z tym metoda ta stanowi potencjalną alternatywę, która przyniosła spójne wyniki u wielu badaczy i przy minimalnej procedurze przypisanej śmiertelności.

Protokół

Wszystkie materiały i sprzęt muszą być zebrane i odpowiednio zorganizowane przed zabiegiem. Procedura ma być przeprowadzana z płynnymi przejściami z jednego kroku do drugiego, aby zapewnić spójne, powtarzalne dane. Protokół ten jest zgodny z zasadami instytucjonalnymi ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Buffalo Veterans Affairs Medical Center.
UWAGA: W tym protokole użyto zarówno samców, jak i samic myszy C57BL/6. Nie ma istotnej różnicy w wycieku albumin między płciami.

1. Przygotowanie kwasu solnego

1. Spraw, aby 56,2 mM HCl było_sterylne, dodając 281 μl 1 N HCl do 4,72 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (SNS). Miareczkować do pH 1,25 za pomocą 1 N HCl (≈ 0 - 50 μL).
2. Przygotuj ten preparat na świeżo przed kontuzją. Ponieważ SNS o niskim pH nie jest buforowany, zapewnia, że uszkodzenie kwasem solnym jest przemijające.

2. Technika znieczulenia i ekspozycji tchawicy

UWAGA: Upewnij się, że procedura urazu jest przeprowadzana w dygestoriach z filtrem węglowym w celu usuwania gazów znieczulających. Utrzymanie sterylnych warunków jest niezbędne, ponieważ jest to operacja przetrwania. Używaj sterylnych rękawiczek i sterylizuj wszystkie narzędzia w sterylizatorze narzędzi chirurgicznych ze szklanymi kulkami przed operacją na każdym zwierzęciu. W celu utrzymania sterylności zaleca się stosowanie obłożeń w celu odizolowania pola operacyjnego. Izofluran należy stosować jako gaz znieczulający, ponieważ zapewnia on stosunkowo niską rozpuszczalność w gazometrii, co pozwala na szybkie wywołanie znieczulenia, a także szybki powrót do zdrowia po urazie.

1. Zacznij od wywołania znieczulenia w komorze z 2,75% izofluranem w tlenie o natężeniu przepływu 2 l/min.
2. Gdy mysz jest odpowiednio znieczulona (nie reaguje na szczypanie palca wystarczająco mocno, aby nie uszkodzić skóry ani nie spowodować głębokiego uszkodzenia tkanek), zawieś mysz za górne siekacze z 15-centymetrowym plecionym jedwabnym szwem o długości 15 cm w pozycji leżącej na desce preparacyjnej o nachyleniu 60^stopni.
3. Upewnij się, że znieczulenie jest utrzymywane przez cały czas operacji, podając izofluran przez stożek nosowy. Nałóż maść weterynaryjną na oko myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
4. Ogolić brzuszną część szyi trymerem elektrycznym i zastosować miejscowy roztwór antyseptyczny (tj. jodowidon). Usuń nadmiar środka antyseptycznego gazą i pozostaw do wyschnięcia (~15 - 30 s).
5. Naciekać linię środkową szyi od wcięcia mostka do dolnej części szczęki za pomocą 100 μl 0,5% bupiwakainy (w celu zapewnienia analgezji przed, około- i pooperacyjnej).
6. Wykonaj podłużne nacięcie linii środkowej na szyi o długości 1 - 1,5 cm za pomocą skalpela lub zakrzywionych cienkich nożyczek. Przeniknąć przez błonę powięziową między gruczołami ślinowymi przez rozwarstwienie za pomocą 2 zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby odsłonić tchawicę (identyfikowaną przez białe pierścienie chrząstki).
7. Nadal używając 2 ząbkowanych kleszczy, chwyć jedną stronę mięśnia przytchawniczego i pociągnij go na bok, jednocześnie preparując między włóknami mięśniowymi wzdłuż tchawicy.
8. Po ustaleniu płaszczyzny rozwarstwienia kontynuuj cofanie mięśnia przytchawiczowego, podczas gdy druga para kleszczy jest obrabiana pod tchawicą. Użyj tych kleszczy, aby umieścić 15 cm pasmo plecionego jedwabnego szwu 1-0 w końcówce kleszczy i przeciągnąć, aby umieścić szew za tchawicą.

3. Procedura wkraplania dotchawiczego

1. Przygotować strzykawkę do wkraplania obrażeń, wypełniając strzykawkę o pojemności 0,5 ml dołączoną do igły 22 G 0,2 ml powietrza, a następnie 3,6 ml/kg kwasu solnego. Powietrze będzie działać w celu pomocy w rozproszeniu pojazdu, a także w manewrze rekrutacji pęcherzyków płucnych dla tych pęcherzyków płucnych, które mogły ulec niedodmie podczas podawania znieczulenia.
   UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC dotyczącymi analgezji pooperacyjnej i skonsultuj się z lokalnym weterynarzem. Należy zachować ostrożność przy stosowaniu jakichkolwiek leków przeciwbólowych o właściwościach przeciwzapalnych przed zastosowaniem tego modelu sterylnego uszkodzenia płuc.
2. Aby zaradzić urazowi, należy najpierw przerwać podawanie izofluranu. Pozwól, aby głębokość znieczulenia myszy wzrosła przez około 10 - 15 sekund, aż zacznie reagować na szczypanie palca u nogi kleszczem.
3. Natychmiast rozpocznij etapy wkraplania urazu. Jeśli głębokość znieczulenia jest zbyt duża, zwierzę nie będzie oddychać spontanicznie po zakropleniu urazu, co jest szczególnie ważne w przypadku urazów zawierających kwas solny.
4. Poproś asystenta, aby ścisnął klatkę piersiową, aby usunąć życiową pojemność.
5. Użyj plecionego jedwabnego szwu 1-0 umieszczonego wcześniej wokół tchawicy, aby zapewnić przyczepność, ciągnąc go wyżej, a następnie włóż igłę strzykawki do tchawicy między 1. a 2. pierścieniem chrzęstnym poniżej krtani. Skos igły powinien być skierowany w stronę chirurga i przesuwać się, aż skos znajdzie się tuż za tchawicą, a igła będzie jak najbardziej równoległa do tchawicy.
6. Zwolnij klatkę piersiową tuż przed podaniem kwasu solnego w bolusie, aby zapewnić dyspersję i osadzanie się w dystalnych drogach oddechowych i pęcherzykach płucnych. Zdeponuj bolus w ciągu około 0,5 - 0,75 s. Trzymać igłę w tchawicy do momentu wykonania pierwszego spontanicznego oddechu, aby upewnić się, że cała objętość bolusa z urazu jest wdychana do płuc.
7. Zamknij nacięcie za pomocą 1-2 zszywek lub szwów skórnych.

4. Odzyskiwanie

1. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml z igłą o sile 26 g wstrzyknąć 1 ml SNS podskórnie w kark szyi w celu resuscytacji płynowej. Chociaż utrata płynów podczas zabiegu jest minimalna, po operacji mysz ma tendencję do niepicia i może potencjalnie się odwodnić. Alternatywnie należy podać SNS we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
2. Umieść mysz w komorze grzewczej w temperaturze 37 °C wypełnionej 100%_O2. Upewnij się, że mysz została odpowiednio odzyskana przed ponownym umieszczeniem w obudowie. W tym czasie należy obserwować zwierzęta i nie pozostawiać ich bez opieki, dopóki nie będą w stanie chodzić i w pełni wyzdrowieć.

5. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i przetwarzanie płuc

1. Wywołać i utrzymać znieczulenie izofluranem zgodnie z opisem w Kroku 2.1 i Kroku 2.2. Potwierdzić odpowiednią płaszczyznę znieczulenia za pomocą metody szczypania palców u nóg opisanej w kroku 2.2.
2. Zabezpiecz w pozycji leżącej na desce preparacyjnej i użyj pętli z plecionego jedwabnego szwu 1-0 zaczepionego na górnych siekaczach, aby przedłużyć szyję. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Po usunięciu zszywek skóry szyi wykonaj nożyczkami podłużne nacięcie w linii środkowej przez skórę od dolnej ściany brzucha przez poprzednie nacięcie szyi do żuchwy.
4. Wykonaj nożyczkami nacięcie w linii środkowej mięśnia otrzewnej i cofnij narządy jamy brzusznej za pomocą gąbek, aby odsłonić przestrzeń zaotrzewnową. Jeśli potrzebna jest krew, pobierz ją w tym momencie z aorty brzusznej lub żyły głównej dolnej.
5. Poddaj zwierzę eutanazji poprzez wykrwawienie przez przecięcie aorty brzusznej i żyły głównej dolnej. Poprzez zastosowanie obustronnej torakotomii w następnym kroku, wtórna potwierdzająca metoda eutanazji zostanie zakończona w sposób humanitarny, zgodnie z wytycznymi IACUC.
6. Wykonaj perforację przepony, aby spowodować zapadnięcie się płuc. Następnie za pomocą nożyczek do cięcia kości odetnij przeponę i przetnij klatkę piersiową równolegle do i po obu stronach mostka. Użyj hemostatu blokującego, aby cofnąć płat mostka, aby ułatwić wstrzyknięcie 5 ml ciepłego (37 °C) zbilansowanego roztworu soli Hanka z wapniem i magnezem do prawej komory w celu przepłukania naczyń płucnych.
   1. Ponieważ krew z aorty jest pobierana w celu oceny poziomu cytokin obwodowych przed procedurą opisaną w tym artykule, należy wykonać małe nacięcie w lewej komorze, aby zapewnić niezbędny odpływ, aby krew opuściła krążenie, aby odpowiednio przepłukać naczynia płucne, jeśli nie uzyskasz krwi.
7. Podeprzyj deskę do rozwarstwiania pod kątem 60° i zastosuj procedurę opisaną w kroku 2.2, aby ułatwić wprowadzenie kaniuli ze stali nierdzewnej 20 G x 1/2" do tchawicy i zabezpieczyć szwem 1-0.
8. Umieść deskę separacyjną poziomo i wykonaj płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL).
   1. Aby wykonać BAL, podłącz dwie strzykawki o pojemności 5 ml do 3-kierunkowego kranu. Napełnić jedną strzykawkę 5 ml SNS i wkręcić w port krana. Podłącz pustą strzykawkę o pojemności 5 ml do^{drugiego portu}, a na koniec podłącz otwarty port kranu do kaniuli dotchawiczej umieszczonej w kroku 5.6. Wkraść 1 ml NS do płuc i przepłukać drugą strzykawką.
   2. Powtórz dla 5 wkropleń NS o łącznej objętości 1 ml, uważając, aby kaniula tchawicy pozostała zabezpieczona i równoległa do tchawicy, aby nie rozerwać tchawicy.
9. Do analizy histologicznej należy kanniulować tchawicę, jak w kroku 5.7. Napraw płuca, wdmuchując 10% neutralną buforowaną formalinę o temperaturze 20 cm H₂O przez 24 godziny.
10. Ostrożnie usuń każdy płat płuca za pomocą nożyczek i kleszczy, przecinając oskrzela w pobliżu wnęki. Umieść każdy płat płuca (w sumie 5) w kasecie histologicznej przed zanurzeniem w parafinie. Wyciąć skrawki tkanki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu i wybarwić hematoksyliną i eozyną przy użyciu standardowych technik histologicznych. ⁶ Morfometria może być również wykonywana na preparatach histologicznych w celu ilościowego określenia ciężkości stanu zapalnego. ⁴
11. Odzyskany BAL przetworzyć przez odwirowanie w stężeniu 1 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Podwielokrotnić bezkomórkowe supernatanty BAL w równoważnych ilościach do probówek mikrowirówek o pojemności 2,0 ml do przyszłej analizy. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
12. Przeanalizować BAL pod kątem stężenia albuminy przez ELISA lub jakikolwiek inny produkt biologiczny będący przedmiotem zainteresowania. ¹¹Granulowane komórki z BAL można policzyć, wygenerować próbki cytoslajdu i wybarwić barwnikiem na bazie Wrighta-Giemsy w celu określenia różnicowej liczby białych krwinek w celu oceny reakcji zapalnej płuc.

Wyniki

Histopatologia płuc w mysim modelu zapalenia płuc po aspiracji kwasu

Myszy zostały poddane urazom zgodnie z powyższym opisem, a płuca usunięto 24 h po ekspozycji na niskie pH, następnie wykonano ich przekroje i barwienie H&E (Rysunek 1). Wyraźnie widoczne są komórki nekrotyczne, utrata architektury miąższu płuca, obecność komórek i debris w przestrzeniach powietrznych oraz znaczna infiltracja PMN. Podobnie jak ...

Dyskusja

Celem było opracowanie modelu zwierzęcego ALI wykorzystującego aspirację kwasu żołądkowego, który bardzo przypomina patofizjologię zachodzącą u ludzi podczas rozwoju kwaśnego zapalenia płuc i późniejszego ARDS. Opracowując model, wybraliśmy gatunek zwierząt, który oferuje wysoką przepustowość pozyskiwania danych ze względu na niski koszt, krótki cykl rozrodczy i dobrze poznany system immunologiczny z dużą ilością narzędzi badawczych (tj. przeciwciała monoklonalne, szczepy transgeniczne).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
strzykawka, 1 cc	309628		Becton Dickinson
, 5 cc			Becton Dickinson
, 22 G x 1 1/2"	Igła 305159
, 26 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Pleciony jedwabny szew	Aparat Harvard	517730
3" Zakrzywiony kleszcze ząbkowane tkankowe	Fine Science Tools	11065-07
3-calowe "ząbkowane" kleszcze tkankowe, 1 x 2 zęby	Fine Science Tools	11067-07
4-calowe zakrzywione nożyczki do mikro preparowania	Fine Science Tools	14061-10
nożyczki sprężynowe do cięcia kości	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" zakrzywiony hemostat blokujący	Fine Science Tools	13021-12
Jednorazowy zszywacz do skóry	3M	DS-25
(adapter rurki ze stali nierdzewnej 20 x 1/2 ")	Becton Dickinson	408210
Deska
0,5% Izofluran bupiwakainy
Betadine i bawełniany aplikator

Strzykawka Igła 309646 Becton Dickinson Kaniula tchawicy do rozwarstwiania o nachyleniu 60 stopni "Q-tip"