Artykuł metodologiczny

Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54724

⸱

12 października 2016

 , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children’s Research Foundation

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek o niskiej liczbie komórek do analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Streszczenie

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) dostarcza szczegółów organizacji i ultrastruktury komórek. Jednak analiza TEM rzadkich populacji komórek, zwłaszcza komórek w zawiesinie, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), pozostaje ograniczona ze względu na wymóg dużej liczby komórek podczas przygotowywania próbki. Istnieje kilka podejść cytospinowych lub jednowarstwowych do analizy TEM z rzadkich próbek, ale podejścia te nie pozwalają uzyskać istotnych danych ilościowych z ograniczonej liczby komórek. W tym miejscu opisano alternatywne i nowatorskie podejście do przygotowania próbek w badaniach TEM dla rzadkich populacji komórek, które umożliwia analizę ilościową.

Stosunkowo niska liczba komórek, tj. 10 000 HSC, została z powodzeniem wykorzystana do analizy TEM w porównaniu do milionów komórek zwykle używanych do badań TEM. W szczególności barwienie Evansa na niebiesko przeprowadzono po utrwaleniu paraformaldehydu i aldehydu glutarowego (PFA-GA) w celu uwidocznienia maleńkiej osadówki komórkowej, co ułatwiło osadzenie w agarozie. W ultracienkich skrawkach obserwowano skupiska licznych komórek. Komórki miały dobrze zachowaną morfologię, widoczne były ultrastrukturalne szczegóły kompleksu Golgiego i kilku mitochondriów. Ten wydajny, łatwy i powtarzalny protokół umożliwia przygotowanie próbki z małej liczby komórek i może być stosowany do jakościowej i ilościowej analizy TEM na rzadkich populacjach komórek z ograniczonych próbek biologicznych.

Wprowadzenie

Szczegóły ultrastrukturalne i sub-organelle komórek zostały głównie ujawnione przez badania z użyciem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) z tkanek lub granulek komórkowych1,2. Stałe fragmenty tkanek można łatwo wykorzystać do badań mikroskopią elektronową. Jednak analizy TEM1,3 na komórkach w zawiesinie pozostają wyzwaniem i wymagają dużej liczby komórek, tj. milionów komórek. Z tego powodu analizy ultrastrukturalne rzadkich populacji komórek w zawiesinie, np. hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), nie są łatwe do oceny. Wielokrotne próby analizy TEM z rzadkich próbek przy użyciu metod cytospinowych lub jednowarstwowych nie pozwalają uzyskać istotnych danych ilościowych z ograniczonej liczby komórek. W związku z tym wymóg wysokiej liczby komórek ogranicza użycie tego potężnego narzędzia do zrozumienia subkomórkowych szczegółów ultrastrukturalnych rzadkich populacji komórek.

Kluczowym ograniczeniem dla badań TEM z ograniczoną liczbą komórek w zawiesinie jest lokalizacja komórek do przetwarzania, a zatem badania TEM z ograniczonych komórek o szczególnie małych rozmiarach pozostają wyzwaniem. Aby przeciwdziałać temu ograniczeniu, przyjęto kilka alternatywnych podejść: polimeryzacja zawiesiny komórkowej za pośrednictwem BSA/bisakryloamidu (BSA-BA), barwienie komórek barwnikiem w celu uwidocznienia ich na cienkim podłożu, w tym szkiełkach nakrywkowych, oraz analizy TEM z preparatów cytospinowych4-6. Sukces ten został jednak osiągnięty w bardzo ograniczonym stopniu, ponieważ w skrawkach po ultrasekcji znaleziono bardzo niewiele komórek. Kluczowe wyzwanie związane z identyfikacją rzadkich komórek utrzymuje się, ponieważ monowarstwa komórek pozostaje w większości niewidoczna w zestalonym żelu do podziału. Ponadto przygotowanie komórek cytospinowych może zmienić ich organizację komórkową ze względu na rozprzestrzenianie się komórek i kruchość struktury komórkowej. W związku z tym te nieodłączne wady uzasadniają nowatorskie podejście do przeprowadzania badań TEM na rzadkich populacjach komórek z większą spójnością. Aby przezwyciężyć ten problem, opisaliśmy nowatorską i alternatywną metodę przygotowania próbek do badań TEM z rzadkich populacji komórek7.

Tutaj raportujemy efektywny protokół przygotowania próbki do wykonania TEM z rzadkich próbek biologicznych z spójnymi wynikami jakościowymi i ilościowymi. Barwienie Evansa na niebiesko przeprowadzono po utrwaleniu w celu zlokalizowania maleńkiego osadu komórkowego z komórek o niskiej liczbie, tj. 10 000 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego, które w przeciwnym razie pozostałyby niewidoczne, a osad osadzano w agarozie przed procesami odwadniania i zatapiania żywicy. Metoda ta grupuje komórki razem i umożliwia efektywną analizę ultrastruktury i organizacji subkomórkowej hematopoetycznych komórek macierzystych (identyfikowanych jako Lin-Sca-1+ c-Kit+ Flt3- CD34-; HSC), rzadka populacja komórek 0,2 - 0,5% w szpiku kostnym. Ten eksperymentalny protokół może być przydatny do przeprowadzania badań ultrastrukturalnych i uzyskiwania wyników ilościowych na wielu rzadkich, ale bardzo ważnych populacjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. zwierząt w Cincinnati Children's Research Foundation. W tym badaniu hematopoetyczne komórki macierzyste wyizolowano ze szpiku kostnego myszy wsobnych C57Bl/6 w wieku 2-4 miesięcy. Sortowanie komórek za pomocą FACS po barwieniu BM z różnymi producentami powierzchni, w tym Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 i CD34, zastosowano do oczyszczania HSC w oparciu o strategię bramkowania Lin-Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 jako standardowy protokół opisany przed8.

UWAGA: Podczas tej procedury używa się kilku wysoce toksycznych substancji chemicznych. Są one toksyczne w przypadku wdychania i kontaktu ze skórą. Prosimy o noszenie rękawic i odzieży ochronnej. Pracuj w dygestoriach podczas pracy z tymi chemikaliami.

1. Komórki, utrwalanie, barwienie i wstępne osadzanie

  1. Sortowanie 10 000 hematopoetycznych komórek macierzystych (przy użyciu strategii bramkowania Lin-Sca-1+ c-Kit+ Flt3-CD34-; populacji LT-HSC) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 μl zmodyfikowanej pożywki Dulbecco (IMDM) firmy Iscove z 10% płodową surowicą bydlęcą przy użyciu FACS.
  2. Odwirowywać posortowane HSC w ilości 1 000 x g przez 10 minut w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą wirówki z odchylanymi wiadrami. Usunąć pożywkę przez delikatne zasysanie i pozostawić 200 μl pożywki w probówkach na każdym etapie. Na tym etapie osad komórkowy pozostaje niewidoczny w tubie.
  3. Utrwalić komórki, dodając 0,2 ml 2x roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę1,9.
    1. Roztwór utrwalający należy przygotować na świeżo przed użyciem. Przy 1x roztwór składa się z 3% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym.
  4. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C za pomocą wirówki z odchylanymi wiadrami.
  5. Przemyć komórki 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego za pomocą wirowania i pozostawić 200 μl buforu w probówce po odwirowaniu.
  6. Wybarwić utrwalone komórki, dodając 200 μl roztworu 2 mg/ml błękitu Evansa w buforze kakodylowym i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Komórki będą pokolorowane na niebiesko.
  7. Przemyć komórki 3 razy 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego za pomocą wirowania i za każdym razem pozostawić 200 μl buforu w probówce.
  8. Ponownie zawiesić komórki w buforze o objętości 200 μl i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 0,5 ml. Wirować przy 1 000 x g przez 10 minut za pomocą wirówki stołowej. Delikatnie usunąć bufor, nie naruszając widocznego teraz osadu o drobnych komórkach, i pozostawić 50 μl buforu w probówce.
  9. Dodać 200 mg niskotopliwej agarozy do 5 ml 0,1 M buforu kakodylowego w probówce o pojemności 15 ml w celu uzyskania 4% roztworu agarozy. Rozpuść agarozę, przenosząc probówkę do wrzącej wody w szklanej butelce o pojemności 100 ml i utrzymuj ją w letnim miejscu do momentu użycia.
  10. Dodać 200 μl 4% niskotopliwej agarozy rozpuszczonej w 0,1 M buforze kakodylowym do zawiesiny komórek w probówce o pojemności 0,5 ml i natychmiast odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C za pomocą wirówki stołowej.
  11. Po upewnieniu się, że komórki granulowane na dnie probówki o pojemności 0,5 ml do półstałej agarozy po odwirowaniu, natychmiast przenieść probówkę do temperatury 4 °C lub lodu na 20 minut w celu zestalenia agarozy. Ten krok jest bardzo krytyczny, ponieważ mała widoczna osadka komórkowa na tym etapie powoduje dobre skupisko komórek pod mikroskopem elektronowym.
  12. Ostrożnie przenieść zestaloną agarozę zawierającą osad komórkowy z probówki na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą bufor za pomocą igły3,10 o średnicy 27 G.
  13. Zestaloną agarozę zawierającą osad komórkowy przyciąć skalpelem na jeden kawałek o grubości około 1 - 2 mm. Przenieść kawałek agarozy zawierający osad komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  14. Przemyć 2 - 3 razy przy użyciu 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego, dodając i usuwając bufor za pomocą pipety bez wirowania. Użyj tego kawałka agarozy zawierającego osad komórkowy do następnego kroku. Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc przed przejściem do następnego etapu.

2. Osmyfikacja, Odwodnienie, Osadzanie

  1. Usunąć bufor kakodylowy z 1,5 ml probówki z osadem komórkowym zawierającym agarozę za pomocą pipety. Dodać 1,0 ml 1% roztworu tetratlenku osmu (OsO4) do dygestorium i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  2. Przemyć trzykrotnie 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego i przenieść próbkę do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml z nakrętką.
  3. Próbkę należy przetworzyć w celu odwodnienia, infiltracji i zatopienia w żywicy (np. LX-112) z seryjną wymianą następujących roztworów na płytce 6-dołkowej. Przesuń kawałek agarozy z granulkami komórkowymi za pomocą kleszczy.
    1. Zanurzyć próbkę w 25% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    2. Zanurzyć próbkę w 50% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    3. Zanurzyć próbkę w 75% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    4. Zanurzyć próbkę w 95% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    5. Zanurzyć próbkę w 100% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut, dwukrotnie.
    6. Zanurzyć próbkę w etanolu: żywica (3:1) w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    7. Zanurzyć próbkę w etanolu: żywica (1:1) w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    8. Zanurzyć próbkę w etanolu: żywica (1:3) w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    9. Zanurzyć próbkę w czystej żywicy w temperaturze pokojowej na 60 minut, dwukrotnie.
  4. Ostrożnie przenieś próbkę na dno gumowej formy w kształcie końcówki piramidy za pomocą kleszczy i dodaj więcej czystej żywicy na wierzchu próbki, aby wypełnić formę. Inkubować próbkę w temperaturze 60 °C przez 72 godziny w celu polimeryzacji żywicy.
  5. Usuń piramidę z żywicy spolimeryzowanej z form, przekręcając gumową formę. Małe czarne skupisko komórek powinno być widoczne w piramidzie spolimeryzowanej żywicy, jak opisano wcześniej7. Przymocuj piramidę z żywicy polimeryzowanej do cylindra montażowego za pomocą cyjanoakrylanu.

3. Przekrojowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa

  1. Przytnij blok piramidy za pomocą żyletki i noża diamentowego po zamontowaniu bloku na ultramikrotomie. Wykonaj krótki, szeroki kształt trapezu z górną i dolną częścią bloku równoległymi do siebie i równomiernie ustawionymi bokami. Taki kształt piramidy pomaga w szeregowym cięciu.
  2. Ponadto przytnij blok wokół granulki komórki za pomocą noża diamentowego i usuń plastikowe sekcje wokół kawałka agarozy z granulki komórki.
  3. Wytnij odcinki 1 μm za pomocą ultramikrotomu. Przenieś sekcje 1 μm z łodzi wodnej na szklane szkiełko za pomocą narzędzia do rzęs i metalowego narzędzia do pętelki, jak wcześniej opisano7. Przenieś sekcje na szkiełkach i przenieś szkiełka na płytę grzejną (37 °C) w celu wysuszenia.
  4. Dodać kroplę roztworu błękitu toluidynowego do skrawków za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr 0,22 μm i inkubować przez 3 minuty. Opłukać szkiełka wodą destylowaną i pozostawić skrawki do wyschnięcia. Sprawdź za pomocą mikroskopu świetlnego, aby określić położenie komórek.
  5. Ciąć ultracienkie odcinki (70 - 100 nm) za pomocą noża diamentowego. Przenieś 2-3 sekcje na siatkach o oczkach 200 z łodzi wodnej na szklaną szalkę Petriego za pomocą narzędzia do rzęs.
  6. Przenieść szklaną szalkę Petriego zawierającą kratki z sekcjami na płytę grzejną w temperaturze 30 °C w celu wysuszenia sekcji przez 30 minut.
  7. Zabarwić siatki kroplami 1% octanu uranylu w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie spłukać w wodzie destylowanej 6 - 8 razy. Plamić cytrynianem ołowiu Reynoldsa w temperaturze pokojowej przez 5 minut i spłukać w wodzie destylowanej 6 - 8 razy. Przenieść szklaną płytkę Petriego zawierającą ruszty na płytę grzejną w temperaturze 37 °C w celu wysuszenia sekcji.
  8. Przeanalizuj skrawki za pomocą mikroskopu elektronowego przy napięciu 80 kV7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisano wydajny i spójny protokół przygotowania próbek do analizy TEM z niewielkiej liczby komórek. Barwienie po utrwaleniu błękitem Evansa oraz przeniesienie komórek do probówki do mikrowirówki o pojemności 0.5 ml pomogły w wizualizacji niewielkiego osadu komórkowego7. Osmowanie przy użyciu tetraoksydy osmu w agarozie umożliwiło łatwe wykrycie ciemnego osadu komórkowego podczas odwodnienia i zatapiania.

Przekroje pół...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda ta umożliwia analizę TEM przy niskiej liczbie komórek, dzięki zastosowaniu barwienia na niebiesko Evansa i zatapiania agarozy w celu zlokalizowania maleńkiej osadki komórkowej podczas procesów odwadniania, zatapiania żywicy i cięcia. Co ważne, utrzymuje razem klastry komórkowe i zachowuje ultrastrukturę komórki, co jest pożądane w przypadku badania wielu komórek w celu ilościowego określenia danych.

W badaniach TEM często wymagany jest osad komórkowy zawierający miliony komórek, który j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Instytutowi Badań Patologicznych za pomoc w badaniach nad analizą mikroskopu elektronowego w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati. Prace były wspierane przez NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 do MDF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Paraformaldehyd 20% Wodny roztwór Mikroskopiaelektronowa Sciences15713UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, używać dygestorium.
Aldehyd gluterowy 70% Wodny roztwór Mikroskopiaelektronowa Sciences16350UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, używać dygestorium.
Bufor kakodyladanu Mikroskopia elektronowa Sciences12300Przygotować 0,1 M buforu kakodylodanu (pH 7,4) w wodzie destylowanej, przechowywać w temperaturze 4 stopni C. UWAGA Działa drażniąco przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą, nosić rękawice i pracować w dygestorium.
Niebieski Evans SigmaE-2129
Agaroza niskotopliwa Sigma AldrichA-5030
Tetratlenek osmuMikroskopia elektronowa Sciences191301 g w 50 ml 0,1 M buforu kakodylodanu do wytworzenia 2% zapasu OsO4, UWAGA Bardzo toksyczny przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą, silny utleniacz, nosić odzież ochronną, ochronę oczu, używać okapu wyciągowego.
Zestawy do zatapiania LX-112 (LADD®)
DDSA (bezwodnik dodecenylusztynowy)LADD21340Wymieszaj 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 razem, a następnie dodaj 1,4% DMP-30
NMA (bezwodnik nadic metylu)LADD21350
Żywice epoksydowe Epon 812 (LX-112)LADD21310UWAGA Działa toksycznie przez wdychanie, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, odzież ochronną, używać okapu wyciągowego.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetyloaminometylo)fenol)LADD21370
Cytrynian ołowiu Reynoldsa (EM Stain II)LeicaUWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, unikać kontaktu ze skórą lub oczami.
Octan uranylu (EM Stain I)Leica8072820UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, unikać kontaktu ze skórą lub oczami.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ATCC30-2005skład: NaCl, NaHCO3, HEPES, glukoza, Ca, Mg, pirogronian sodu etc. Szczegółowe informacje https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Forma do końcówki piramidy Ted Pella10585
cylindry montażoweTed Pella10580
Ultra-mikrotom (Leica EM UC7)
Siatki siatkowe 200 (nikil)Mikroskopia elektronowa SciencesG-200 Ni
Mikroskop elektronowyHitachi model H-7650 
Oprogramowanie silnika przechwytywania obrazuAMT-600 
Plastikowe szalki Petriego 35 mmFisher scientific
Quick Bond Super klej cyjanoakrylany Mikroskopia elektronowa Sciences72588
Żyletki
Szklane fiolki scyntylacyjne Fisher naukowy 03-337-14
Szkiełka szklane 
Narzędzie
Narzędzie do metalowej pętli 
do rzęs

Bibliografia

  1. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
  2. Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
  3. Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
  4. Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
  5. Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
  6. Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
  7. Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
  8. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
  9. Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
  10. Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
  11. Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hematopoetyczne kom rki macierzystebarwienie b kitem Evansazatapianie w agarozieczwartotlenek osmuci cie ultramikrotomembarwienie octanem uranylubarwienie cytrynianem o owiu

Powiązane artykuły