Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek o niskiej liczbie komórek do analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) dostarcza szczegółów organizacji i ultrastruktury komórek. Jednak analiza TEM rzadkich populacji komórek, zwłaszcza komórek w zawiesinie, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), pozostaje ograniczona ze względu na wymóg dużej liczby komórek podczas przygotowywania próbki. Istnieje kilka podejść cytospinowych lub jednowarstwowych do analizy TEM z rzadkich próbek, ale podejścia te nie pozwalają uzyskać istotnych danych ilościowych z ograniczonej liczby komórek. W tym miejscu opisano alternatywne i nowatorskie podejście do przygotowania próbek w badaniach TEM dla rzadkich populacji komórek, które umożliwia analizę ilościową.
Stosunkowo niska liczba komórek, tj. 10 000 HSC, została z powodzeniem wykorzystana do analizy TEM w porównaniu do milionów komórek zwykle używanych do badań TEM. W szczególności barwienie Evansa na niebiesko przeprowadzono po utrwaleniu paraformaldehydu i aldehydu glutarowego (PFA-GA) w celu uwidocznienia maleńkiej osadówki komórkowej, co ułatwiło osadzenie w agarozie. W ultracienkich skrawkach obserwowano skupiska licznych komórek. Komórki miały dobrze zachowaną morfologię, widoczne były ultrastrukturalne szczegóły kompleksu Golgiego i kilku mitochondriów. Ten wydajny, łatwy i powtarzalny protokół umożliwia przygotowanie próbki z małej liczby komórek i może być stosowany do jakościowej i ilościowej analizy TEM na rzadkich populacjach komórek z ograniczonych próbek biologicznych.
Wprowadzenie
Szczegóły ultrastrukturalne i sub-organelle komórek zostały głównie ujawnione przez badania z użyciem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) z tkanek lub granulek komórkowych1,2. Stałe fragmenty tkanek można łatwo wykorzystać do badań mikroskopią elektronową. Jednak analizy TEM1,3 na komórkach w zawiesinie pozostają wyzwaniem i wymagają dużej liczby komórek, tj. milionów komórek. Z tego powodu analizy ultrastrukturalne rzadkich populacji komórek w zawiesinie, np. hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), nie są łatwe do oceny. Wielokrotne próby analizy TEM z rzadkich próbek przy użyciu metod cytospinowych lub jednowar....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. zwierząt w Cincinnati Children's Research Foundation. W tym badaniu hematopoetyczne komórki macierzyste wyizolowano ze szpiku kostnego myszy wsobnych C57Bl/6 w wieku 2-4 miesięcy. Sortowanie komórek za pomocą FACS po barwieniu BM z różnymi producentami powierzchni, w tym Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 i CD34, zastosowano do oczyszczania HSC w oparciu o strategię bramkowania Lin-Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 jako standardowy protokół opisany przed8.
UWAGA: Podczas tej procedury używa si....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisano wydajny i spójny protokół przygotowania próbek do analizy TEM z niewielkiej liczby komórek. Barwienie po utrwaleniu błękitem Evansa oraz przeniesienie komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 ml pomogły w wizualizacji niewielkiego osadu komórkowego7. Osmyzacja przy użyciu tetraoksydu osmu w agarozie umożliwiła łatwe wykrycie ciemnego osadu komórkowego podczas dehydratacji i zatapiania.
Przetłocz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta umożliwia analizę TEM przy niskiej liczbie komórek, dzięki zastosowaniu barwienia na niebiesko Evansa i zatapiania agarozy w celu zlokalizowania maleńkiej osadki komórkowej podczas procesów odwadniania, zatapiania żywicy i cięcia. Co ważne, utrzymuje razem klastry komórkowe i zachowuje ultrastrukturę komórki, co jest pożądane w przypadku badania wielu komórek w celu ilościowego określenia danych.
W badaniach TEM często wymagany jest osad komórkowy zawierający miliony komórek, który j.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Instytutowi Badań Patologicznych za pomoc w badaniach nad analizą mikroskopu elektronowego w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati. Prace były wspierane przez NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 do MDF).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyd 20% Wodny roztwór Mikroskopia | elektronowa Sciences | 15713 | UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, używać dygestorium. |
| Aldehyd gluterowy 70% Wodny roztwór Mikroskopia | elektronowa Sciences | 16350 | UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, używać dygestorium. |
| Bufor kakodyladanu | Mikroskopia elektronowa Sciences | 12300 | Przygotować 0,1 M buforu kakodylodanu (pH 7,4) w wodzie destylowanej, przechowywać w temperaturze 4 stopni C. UWAGA Działa drażniąco przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą, nosić rękawice i pracować w dygestorium. |
| Niebieski Evans | Sigma | E-2129 | |
| Agaroza niskotopliwa | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Tetratlenek osmu | Mikroskopia elektronowa Sciences | 19130 | 1 g w 50 ml 0,1 M buforu kakodylodanu do wytworzenia 2% zapasu OsO4, UWAGA Bardzo toksyczny przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą, silny utleniacz, nosić odzież ochronną, ochronę oczu, używać okapu wyciągowego. |
| Zestawy do zatapiania LX-112 (LADD®) | |||
| DDSA (bezwodnik dodecenylusztynowy) | LADD | 21340 | Wymieszaj 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 razem, a następnie dodaj 1,4% DMP-30 |
| NMA (bezwodnik nadic metylu) | LADD | 21350 | |
| Żywice epoksydowe Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | UWAGA Działa toksycznie przez wdychanie, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, odzież ochronną, używać okapu wyciągowego. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetyloaminometylo)fenol) | LADD | 21370 | |
| Cytrynian ołowiu Reynoldsa (EM Stain II) | Leica | UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, unikać kontaktu ze skórą lub oczami. | |
| Octan uranylu (EM Stain I) | Leica | 8072820 | UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, unikać kontaktu ze skórą lub oczami. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | skład: NaCl, NaHCO3, HEPES, glukoza, Ca, Mg, pirogronian sodu etc. Szczegółowe informacje https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Forma do końcówki piramidy | Ted Pella | 10585 | |
| cylindry montażowe | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-mikrotom | (Leica EM UC7) | ||
| Siatki siatkowe 200 (nikil) | Mikroskopia elektronowa Sciences | G-200 Ni | |
| Mikroskop elektronowy | Hitachi model H-7650 | ||
| Oprogramowanie silnika przechwytywania obrazu | AMT-600 | ||
| Plastikowe szalki Petriego 35 mm | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super klej cyjanoakrylany | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72588 | |
| Żyletki | |||
| Szklane fiolki scyntylacyjne | Fisher naukowy | 03-337-14 | |
| Szkiełka szklane | |||
| Narzędzie | |||
| Narzędzie do metalowej pętli |
Bibliografia
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-5....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
