Unikalny model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do badania wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Model ten obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie dostarczenie wątrobowe.
Artykuł metodologiczny
Metoda bezpośredniego segmentalnego dostarczania dowątrobowego przy użyciu modelu klamry Hilar wątroby szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poważna operacja wątroby z niedrożnością dopływu i przeszczepem wątroby, wymaga okresu ciepłego niedokrwienia i okresu reperfuzji prowadzącego do uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) z niezliczonymi negatywnymi konsekwencjami. Potencjalne uszkodzenia I/R w narządach brzeżnych przeznaczonych do przeszczepienia wątroby przyczyniają się do obecnego niedoboru dawców, co jest równoznaczne ze zmniejszonym wskaźnikiem wykorzystania narządów. Istnieje znacząca potrzeba zbadania uszkodzenia I/R wątroby w celu pośredniczenia w jego wpływie na funkcję przeszczepu w przeszczepie. Modele zacisków wnękowych wątroby szczura są wykorzystywane do badania wpływu różnych cząsteczek na uszkodzenie I/R wątroby. W zależności od modelu, cząsteczki te zostały dostarczone za pomocą inhalacji, wlewu zewnątrzoponowego, wstrzyknięcia dootrzewnowego, podania dożylnego lub wstrzyknięcia do obwodowej żyły krezkowej górnej. Model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do wykorzystania w badaniu wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzeń I/R. Opisany model zacisku wnękowego wątroby szczura obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez boczne odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie segmentowe podawanie wątrobowe. Nasze podejście polega na wywołaniu niedokrwienia w lewym płacie bocznym i środkowym przez 60 minut, w tym czasie podawana jest badana substancja. W tym przypadku pegylowana dysmutaza ponadtlenkowa (PEG-SOD), wymiatacz wolnych rodników, jest podawana bezpośrednio do segmentu niedokrwiennego. Ta seria eksperymentów wykazała, że infuzja PEG-SOD chroni przed uszkodzeniem I/R wątroby. Do zalet tego podejścia należy bezpośrednie wstrzyknięcie cząsteczki do segmentu niedokrwiennego, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia objętości dystrybucji i zmniejszenia ogólnoustrojowych skutków ubocznych.
Wprowadzenie
Duża operacja wątroby z niedrożnością dopływu i przeszczepem wątroby, wymaga okresu ciepłego niedokrwienia i okresu reperfuzji prowadzącego do niedokrwienia/uszkodzenia reperfuzyjnego (I/R)1. Konsekwencje uszkodzenia I/R w wątrobie zostały szczegółowo opisane1,2,3. Konsekwencje uszkodzenia I/R szczegółowo opisane w literaturze obejmują: wytwarzanie reaktywnych form tlenu, inicjację kaskady zapalnej, w tym aktywację neutrofili, komórek Kupffera i komórek śródbłonka, aktywację systemu oksygenazy hemowej i aktywację receptorów toll-podobnych, brak równowagi między endoteliną a tlenkiem azotu, aktywację czynnika jądrowego-κB oraz promowanie syntezy cytokin prozapalnych i cząsteczek adhezyjnych1,2,3. Te prozapalne zdarzenia mogą prowadzić do apoptozy, martwicy, dysfunkcji narządów i ostatecznie niewydolności narządów3.
I/R uszkodzenia w organach przeznaczonych do przeszczepu wątroby mogą prowadzić do wczesnej utraty przeszczepu i przyczyniają się do obecnego niedoboru dawców, ponieważ narządy brzeżne są bardziej podatne na uszkodzenia3. Obecnie na liście oczekujących na przeszczep wątroby w Stanach Zjednoczonych znajduje się 15 226 potencjalnych biorców4, a w 2015 roku wykonano tylko 5 950 przeszczepów wątroby5. Ze względu na to ekstremalne ograniczenie dostępności narządów, potrzebne są badania nad uszkodzeniem I/R wątroby w celu optymalizacji funkcji przeszczepu i wykorzystania narządów.
Modele zwierzęce używane do badania uszkodzeń wątroby I/R obejmują modele klamry wnękowej szczura i modele przeszczepu wątroby szczura. Obecnie w użyciu jest wiele modeli zacisków wnękowych dla szczurów. Najczęstszym jest taki, w którym żyła wrotna, tętnica wątrobowa i przewód żółciowy zaopatrujące lewy płat boczny i środkowy są zaciskane za pomocą klipsów mikrochirurgicznych6,7,8,9,10,11,12 przez 30 do 60 min6,7,10,13,14, a następnie okres reperfuzji od 60 min do 24 h7,9,10,13,14 jest dozwolone. Lewy płat boczny i środkowy wątroby szczura stanowi około 70% miąższu wątroby9. Niektóre protokoły opracowane do badania wstępnego kondycjonowania niedokrwiennego obejmują przerywane zaciskanie naczyń wnękowych lub kończyny tylnej przed dłuższym okresem niedokrwienia wywołanym przez zaciśnięcie naczyń wnękowych9,13. Istnieje również kilka modyfikacji opisanych w literaturze. Pierwszym z nich jest zaciśnięcie żyły wrotnej i tętnicy wątrobowej zaopatrującej lewy płat boczny i środkowy, ale z wyłączeniem przewodu żółciowego15. Drugą modyfikacją jest wywołanie całkowitego niedokrwienia wątroby poprzez zaciśnięcie żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i przewodu żółciowego przed ich podziałem16,17,18,19,20. Trzecia modyfikacja polega na zaciśnięciu naczyń wnękowych do prawego płata przez 30 do 60 min8. Dodatkowa modyfikacja polega na zaciśnięciu pęczka naczyniowego w jednej kończynie tylnej w celu wywołania urazu wątroby13,21. Różne podejścia do procedury zacisku wnękowego są zilustrowane w Rysunek 1A-D.
Modele zacisków wnękowych wątroby szczura zostały wykorzystane do zbadania wpływu różnych cząsteczek i związków na I/R wątroby. W zależności od użytego modelu, cząsteczki te zostały dostarczone za pomocą inhalacji11, infuzja zewnątrzoponowa12, iniekcja dootrzewnowa17,18,21,22, podanie dożylne10,14,15,19,23,24 lub wstrzyknięcie do żyły krezkowej górnej obwodowej8.
Model zacisku wnękowego wątroby szczura opisany w tym raporcie obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotu do segmentu niedokrwiennego przez boczne odgałęzienie żyły wrotnej (Rysunek 2), co pozwala na bezpośrednie segmentowe dostarczanie badanej substancji farmakologicznej do wątroby. Nasze podejście polega na wywołaniu niedokrwienia w lewym płacie bocznym i środkowym przez 60 minut, w tym czasie wlew badanej substancji, w tym przypadku pegylowanej dysmutazy ponadtlenkowej, wymiatacza wolnych rodników25, jest podawany bezpośrednio do segmentu niedokrwiennego. Próbki krwi pobiera się przed indukcją niedokrwienia i po 120 minutach od reperfuzji. W tym momencie szczur jest uśmiercany i pobierane są próbki z lewego i środkowego płata. Dodatkowo próbki są pobierane z prawego płata, które służą jako kontrola wewnętrzna.
Istnieje wiele zalet tego podejścia. Przede wszystkim, gdy badana substancja farmakologiczna może być bezpośrednio wstrzyknięta do segmentu niedokrwiennego, objętość dystrybucji jest dość mała w porównaniu z objętością dystrybucji iniekcji do krążenia ogólnoustrojowego lub jamy otrzewnej. Dodatkowo takie podejście zmniejsza, choć nie eliminuje, możliwość wystąpienia ogólnoustrojowych skutków ubocznych.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care oraz National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals (IACUC) i przeszły zatwierdzenie przez komitet IACUC Uniwersytetu Stanowego Ohio.
1. Wstępna konfiguracja
- Ustaw mikroskop chirurgiczny i salę operacyjną (Rysunek 3, Rysunek 4). Włącz wszystkie urządzenia, w tym sprzęt do utrzymywania znieczulenia i monitorowania parametrów życiowych. Włącz aparat elektrochirurgiczny i podkładkę rozgrzewającą. Umieścić pompę infuzyjną w pobliżu stołu operacyjnego.
- Pobrać 10 ml płynnego izofluranu do inhalacji (masa cząsteczkowa 184,5) do strzykawki anestezjologicznej i umieścić ją w jednostce anestezjologicznej.
- Ustaw pojemnik o pojemności 200 ml z ciekłym azotem w pobliżu stołu operacyjnego, a drugi w pobliżu wirówki, w której będą przetwarzane próbki krwi.
- W pobliżu stołu operacyjnego umieść narzędzia chirurgiczne, pleciony jedwabny szew 4-0 i 7-0, sterylne waciki, gąbki z włókniny 4x4, strzykawki 5 ml i strzykawki insulinowe o rozmiarze 27 w pobliżu stołu operacyjnego.
- Przygotować komorę izofuranu i upewnić się, że wystarczająca ilość izofluranu została wkroplona do systemu podawania znieczulenia.
2. Indukcja znieczulenia
- Przed kontaktem ze szczurem należy założyć następujące środki ochrony osobistej (PPE): maskę chirurgiczną, rękawiczki chirurgiczne i jednorazowy fartuch.
- Zważ szczura i zapisz wagę.
UWAGA: Należy użyć szczurów Sprague Dawley. - Umieść szczura w komorze anestezjologicznej i włącz izofluran i tlen. Wywołać znieczulenie za pomocą komory izofluranowej.
- Przytnij włosy na brzuchu zwierzęcia za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia włosów, aby umożliwić czystszą ekspozycję (Rysunek 5).
- Umieść zwierzę z powrotem w komorze izofluranu na dodatkową minutę. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
3. Procedura
- Umieść szczura z nosem zwierzęcia w stożku nosowym i czterema kończynami unieruchomionymi za pomocą pasów lub taśmy na podkładce rozgrzewającej.
- Kontynuować znieczulenie za pomocą systemu podawania znieczulenia, stożka nosowego i izofluranu w znieczuleniu na poziomie 3,6% dla zwierząt o masie ciała od 200 do 250 g i 4% dla zwierząt o masie ciała powyżej 250 g. Potwierdź głębokość znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i uszczypnięcie skóry.
- Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej od łona do mieczykowatego przez skórę za pomocą ostrych nożyczek (Ryc. 6).
- Wykonaj nacięcie w otrzewnej wzdłuż kresy białej od łona do mieczykowatej i wejdź do jamy brzusznej, uważając, aby nie uszkodzić pęcherza moczowego ani jelita. Ponieważ wątroba przylega również do otrzewnej z przodu w pobliżu wyrostka mieczykowatego, upewnij się, że uwalnia się przed nacięciem ściany brzucha w tym obszarze.
- Wykonaj poprzeczne nacięcie przez skórę i otrzewną na poziomie dolnej granicy prawego płata wątroby.
- Zmniejsz znieczulenie do 1,6% dla zwierząt o masie ciała od 200 do 250 g i 2% dla zwierząt o masie ciała powyżej 250 g.
- Cofnij wyrostek mieczykowaty za pomocą zakrzywionego zacisku na komary.
- Umieść zwijacze żeber ciągnąc żebra jak najdalej od linii środkowej (Rysunek 7). Przetnij więzadła sierpowe, przeponowe i żołądkowe. Podnieś wątrobę za pomocą zwilżonych sterylnych wacików.
- W razie potrzeby przetnij dodatkowe więzadła, aby uzyskać dostęp do porta. Wykonaj rotację trzewną za pomocą gazy zwilżonej solą fizjologiczną (Rysunek 7).
- Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą wnękę wrotną za pomocą ostrego lub rozwarstwienia. Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą długość żyły wrotnej.
- Użyj kleszczy, aby przepchnąć luźną tkankę łączną z tyłu do lewej żyły wrotnej, tętnicy i przewodu żółciowego, tworząc okno i umieść szew Pottsa 4-0, ale nie zaciskaj (Ryc. 8).
- Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą tylną gałąź z żyłą wrotną, która znajduje się mniej więcej na poziomie prawej nerki. Ta żyła będzie używana do kaniulacji.
- Pobrać 0,5 ml krwi z żyły głównej dolnej (IVC) za pomocą strzykawki insulinowej (Rycina 9). Umieścić 0,5 ml krwi w małej fiolce, odwirować przy 135 x g przez 12 minut. Spróbuj ściągnąć serum.
- Jeśli nie można dostrzec wyraźnej linii między czerwonymi krwinkami a surowicą, spróbuj odwirować przez dodatkowe 2 - 3 minuty przy 135 x g. Odciągnąć surowicę i umieścić w fiolce z aminotransferazą alaninową (ALT). Zamroź tę próbkę zatrzaskowo, umieszczając ją bezpośrednio w ciekłym azocie.
- Wytnij dwa kawałki szwu 7-0 i umieść w pobliżu żyły, która będzie używana do kaniulacji. Umieść pierwszą pętlę 7-0 wokół tej żyły tak daleko, jak to możliwe. Zawiąż tę pętlę i użyj jej do schowania za pomocą zakrzywionego zacisku na komary (Rysunek 10). Umieść drugą pętlę 7-0 na żyle, która będzie używana do kaniulacji, w pobliżu jej przecięcia z żyłą wrotną i umieść jedną opaskę, ale nie zaciskaj.
- Przygotować pompę infuzyjną za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i 3 ml odczynnika. Zagruntować rurkę.
- Zaciśnij dystalną żyłę wrotną za pomocą zacisku mikrochirurgicznego.
UWAGA: Zmniejszy to krwawienie, gdy żyła zostanie nacięta w celu kaniulacji. - Wytnij otwór 0,5 mm w żyle między szwem podciągowym 7-0 a jego przecięciem z żyłą wrotną za pomocą małych nożyczek mikrochirurgicznych. Użyj cewnika 27-0, aby kaniulować lewy układ żyły wrotnej (Rysunek 11, Rysunek 12). Wprowadzić cewnik za rozwidlenie lewej i prawej żyły wrotnej.
- Sprawdź położenie kaniuli, podając 1 ml soli fizjologicznej i obserwuj, czy lewy boczny i środkowy płat wątroby bledną. Ręcznie upewnij się, że cewnik znajduje się poza startem prawej żyły wrotnej, ale nie poza startem żyły wrotnej zasilającej płat środkowy.
- Zaciśnij szew Potts i rozpocznij czas niedokrwienia. Zaciśnij szew 7-0 wokół żyły i cewnika 27-0, aby utrzymać go na miejscu i usuń zacisk z dystalnej żyły wrotnej.
- Rozpocząć infuzję dysmutazy ponadtlenkowej glikolu polietylenowego (PEG-SOD, 0,00067 g/ml) za pomocą pompy infuzyjnej. Infuzję należy rozpocząć jak najbliżej początku czasu niedokrwiennego.
4. Monitorowanie
- Kontynuuj monitorowanie parametrów życiowych zwierzęcia przez cały czas trwania infuzji. Dostarczyć 2 ml 0,9% soli fizjologicznej lub 2 ml PEG-SOD (0,00067 g/ml) rozpuszczonych w 0,9% soli fizjologicznej przez okres 15 minut.
5. Reperfuzja
- Odczekaj godzinę od początku czasu niedokrwiennego. Jest to 1 godzina ciepłego czasu niedokrwienia.
- Usuń szew Pottsa. Usuń cewnik 27-0. Zaciśnij szew 7-0 wokół żyły. Zanotuj godzinę. To oznacza czas reperfuzji.
6. Kontynuacja próbkowania
- Pobrać 0,5 ml krwi z IVC po 120 minutach po reperfuzji. Pobieraj krew powoli, aby uniknąć lizy czerwonych krwinek. Powoli wlewać krew do fiolki. Upewnij się, że krwawienie z IVC jest kontrolowane po każdym pobraniu krwi.
- Jeśli krwawienie utrzymuje się, delikatnie dociśnij go sterylnym wacikiem lub małym odcinkiem o wymiarach 1 cm na 1 cm wyciętym z gazy.
- Wirować przy 135 x g przez 12 min. Jeśli nie zostanie osiągnięta wystarczająca separacja, spróbuj dodatkowych 2 - 3 minut przy 135 x g.
- Umieścić połowę surowicy w fiolce w celu późniejszego przetworzenia na ALT. Próbki te należy zamrozić na zatrzask.
7. Eutanazja
- Podczas gdy szczur jest nadal pod narkozą, odetnij IVC i żyłę główną górną (SVC) i monitoruj, aż przepływ krwi, oddychanie i bicie serca ustaną.
- Naciąć przeponę i wykonać krótką hepatektomię, nacinając przeponę w kółko i nacinając dodatkową tkankę łączną, która pozostaje łącząca wątrobę z jamą otrzewną. Usuń wątrobę z jamy otrzewnej.
- Pobrać cztery próbki z lewego i środkowego płata wątroby oraz cztery próbki z prawego płata wątroby. Próbki powinny być jak największe, a ich wielkość będzie ograniczona jedynie ilością dostępnej tkanki wątroby. Umieść je w małych, oznakowanych fiolkach i zamroź w ciekłym azocie. Użyj ich do późniejszego przetwarzania w tkankach adenozynotrifosforanu (ADP), dialdehydu malonowego (MDA) i glutationu (GSH).
8. Analiza po eksperymencie
- Oznaczyć aktywność glutationu (GSH), dialdehydu malonowego (MDA) i aminotransferazy alaninowej (ALT) w tkance wątroby i próbkach surowicy za pomocą zestawów diagnostycznych zgodnie z instrukcjami producenta.
- Homogenizować tkankę wątroby za pomocą buforu do lizy i oznaczać ilościowo za pomocą testu Bradforda. Analizuj lizat tkankowy za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu oraz immunoblot przy użyciu przeciwciał przeciwko rozszczepionej kapazie-3 i aktynie. Ilościowe określanie western blot wykonane za pomocą publicznie dostępnego oprogramowania.
Wyniki
Eksperyment przeprowadzono z udziałem 2 grup szczurów, po n = 3 osobników w każdej. Do trzech wątrób szczurzych wstrzyknięto 2 mL soli fizjologicznej (NS) za pomocą pompy infuzyjnej w ciągu 15 min. Do trzech wątrób szczurzych wstrzyknięto 2 mL soli fizjologicznej (NS) zmieszanej z pegylowaną dysmutazą ponadtlenkową (PEG-SOD, 0,00067 g/mL) za pomocą pompy infuzyjnej w ciągu 15 min. Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, pobrano próbki krwi przed zaciskaniem naczyń wnęki oraz 120 min po reperfuzji. Dodatkowo, po zakończeniu 120-minutowej reperfuzji, pobrano cztery próbki tkanki wątroby z płatów lewego i środkowego oraz cztery próbki wątroby z płata prawego wątroby szczura.
Poziom aminotransferazy alaninowej (ALT) w surowicy mierzono przed zastosowaniem zacisku wnęki oraz 120 min po reperfuzji u zwierząt w grupie kontrolnej (NS) i eksperymentalnej (PEG-SOD). Stwierdzono istotną różnicę między poziomem ALT u zwierząt kontrolnych (NS) przed zastosowaniem zacisku a poziomem 120 min po reperfuzji. Odnotowano istotną różnicę między poziomem ALT u zwierząt kontrolnych (NS) a zwierząt eksperymentalnych (PEG-SOD) w 120. minucie (Rysunek 13A). Poziom malonaldehydu (MDA) w tkance mierzono u zwierząt kontrolnych (NS) i eksperymentalnych (PEG-SOD) w prawym i lewym płacie wątroby. W prawym płacie (bez zacisku wnęki) nie wykazano istotnej różnicy poziomu MDA w tkance po wstrzyknięciu soli fizjologicznej (NS) w porównaniu z wstrzyknięciem PEG-SOD. Poziom MDA w tkance lewego płata (po zacisku wnęki i reperfuzji) po wstrzyknięciu kontrolnym (NS) różnił się istotnie od poziomu w prawym płacie (bez zacisku wnęki), p < 0,001. W lewym płacie (po zacisku wnęki i reperfuzji) stwierdzono istotnie różne poziomy MDA w tkance po wstrzyknięciu kontrolnym (NS) w porównaniu z wstrzyknięciem eksperymentalnym (PEG-SOD), p < 0,005 (Rysunek 13B). Zmierzono poziom glutationu (GSH) w tkance; w prawym płacie (bez zacisku wnęki) nie wykazano istotnej różnicy poziomu GSH w tkance po wstrzyknięciu kontrolnym (NS) oraz eksperymentalnym (PEG-SOD). Poziom GSH w tkance lewego płata (po zacisku wnęki i reperfuzji) po wstrzyknięciu kontrolnym (NS) różnił się istotnie od poziomu w prawym płacie (bez zacisku wnęki) po wstrzyknięciu kontrolnym (NS), p < 0,05. W lewym płacie (po zacisku wnęki i reperfuzji) stwierdzono istotnie różne poziomy glutationu w tkance po wstrzyknięciu kontrolnym (NS) w porównaniu z wstrzyknięciem eksperymentalnym (PEG-SOD), p < 0,005 (Rysunek 13C). Wykonano analizę Western blot w celu porównania prawego i lewego płata u zwierząt kontrolnych, co wykazało zwiększony poziom rozszczepionej kaspazy-3 w lewym płacie po zastosowaniu zacisku wnęki i reperfuzji (Rysunek 13D). Przeprowadzono drugą analizę Western blot, porównując lewe płaty zwierząt traktowanych kontrolą oraz PEG-SOD (Rysunek 13E). Wykazano w niej zmniejszony poziom rozszczepionej kaspazy-3 w tkance wątroby zwierząt traktowanych PEG-SOD. Wykonano również densytometrię, która wykazała, że poziom rozszczepionej kaspazy-3 w tkance wątroby jest istotnie wyższy w lewym płacie w porównaniu z prawym płatem u zwierząt kontrolnych (Rysunek 13F). Porównując tkankę lewego płata wątroby zwierząt eksperymentalnych, którym podano PEG-SOD, z tkanką lewego płata zwierząt kontrolnych, którym podano sól fizjologiczną, densytometria wykazała istotnie zmniejszony poziom rozszczepionej kaspazy-3 u zwierząt traktowanych PEG-SOD w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi (Rysunek 13G).
Rycina 1: Ilustracje anatomiczne. A. Ilustracja anatomiczna wątroby szczura. B. Ilustracja anatomiczna wątroby szczura. Pień wrotny do lewego i środkowego płata wątroby jest zaklemowany. Lewy i środkowy płaty są niedokrwione. C. Ilustracja anatomiczna wątroby szczura. Pień wrotny do lewego płata jest zaklemowany. Lewy płat jest niedokrwiony. D. Ilustracja anatomiczna wątroby szczura. Pień wrotny do prawego płata jest zaklemowany, a prawy płat jest niedokrwiony.
Rycina 2: Ilustracje anatomiczne. Ilustracja anatomiczna wątroby szczura z kaniulacją żyły wrotnej poprzez odgałęzienie boczne. Pień wrotny płatów lewego i środkowego wątroby został opasany szwem, a do zaciśnięcia go wokół pęczka naczyniowego użyto klamry do mikronaczyń. Płaty lewy i środkowy znajdują się w stanie niedokrwienia.
Rysunek 3: Przygotowanie instrumentów. Rysunek ten przedstawia sposób przygotowania instrumentów.
Rycina 4: Organizacja sali operacyjnej. Na tej rycinie przedstawiono organizację sali operacyjnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Przycinanie sierści brzusznej. Na tej rycinie przedstawiono sposób przycinania sierści na brzuchu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 6: Unieruchomienie i nacięcie skóry. Ta rycina przedstawia unieruchomienie szczura oraz nacięcie skóry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7: Umieszczenie rozwieraka żeber i ewizceracja. Na rycinie przedstawiono rozmieszczenie rozwieraka żeber oraz proces ewizceracji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Umiejscowienie szwu. Na tej rycinie przedstawiono sposób umiejscowienia szwu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 9: Pobieranie krwi z żyły głównej dolnej. Na tej rycinie przedstawiono sposób pobierania krwi z żyły głównej dolnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 10: Podwiązana i odciągnięta odgałęzienie żyły. Na tym rysunku przedstawiono podwiązane i odciągnięte odgałęzienie żyły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 11: Proces kanulacji. Niniejsza rycina przedstawia proces kanulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 12: Kaniulacja. Na tym rysunku przedstawiono proces kaniulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 13: Reprezentatywne wyniki: Bezpośrednie segmentalne podanie wewnątrz wątrobowe pegylowanej dysmutazy ponadtlenkowej z wykorzystaniem szczurzego modelu zacisku wnęki wątrobowej. NS = sól fizjologiczna. PEG-SOD = pegylowana dysmutaza ponadtlenkowa, ALT = alanin aminotransferaza, MDA = malondialdehyd. A. Poziom alanin aminotransferazy (ALT, mU/mL) w surowicy w porównaniu przed zastosowaniem zacisku wnękowego oraz 120 min po reperfuzji. Istnieje istotna różnica między grupą kontrolną (NS) przed zaciskiem wnękowym a grupą kontrolną (NS) 120 min po reperfuzji (p < 0,001). Istnieje również istotna różnica między grupą kontrolną (NS) a grupą eksperymentalną (PEG-SOD) 120 min po reperfuzji (p < 0,05). Zastosowano test t studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. B. Poziom malondialdehydu w tkance prawego płata (bez zacisku wnękowego) przy wstrzyknięciu kontrolnym (NS) i wstrzyknięciu eksperymentalnym (PEG-SOD) nie wykazuje istotnej różnicy. Poziom malondialdehydu w tkance lewego płata (po zacisku wnękowym i reperfuzji) przy wstrzyknięciu kontrolnym (NS) różni się istotnie od poziomu w prawym płacie (bez zacisku wnękowego) p < 0,001. W lewym płacie (po zacisku wnękowym i reperfuzji) poziomy malondialdehydu w tkance różnią się istotnie przy wstrzyknięciu kontrolnym (NS) w porównaniu do wstrzyknięcia eksperymentalnego (PEG-SOD) p < 0,005. Zastosowano test t studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. C. Poziom glutationu w tkance prawego płata (bez zacisku wnękowego) przy wstrzyknięciu kontrolnym (NS) i wstrzyknięciu eksperymentalnym (PEG-SOD) nie wykazuje istotnej różnicy. Poziom glutationu w tkance lewego płata (po zacisku wnękowym i reperfuzji) przy wstrzyknięciu kontrolnym (NS) różni się istotnie od poziomu w prawym płacie (bez zacisku wnękowego) przy wstrzyknięciu kontrolnym (NS) p < 0,05. W lewym płacie (po zacisku wnękowym i reperfuzji) poziomy glutationu w tkance różnią się istotnie przy wstrzyknięciu kontrolnym (NS) w porównaniu do wstrzyknięcia eksperymentalnego (PEG-SOD) p < 0,005. Zastosowano test t studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. D. Western blot wykazujący zwiększone stężenie aktywnej (cleaved) kaspazy-3 w tkance wątroby lewego płata (po zacisku wnękowym i reperfuzji) w porównaniu do prawego płata (bez zacisku wnękowego) u zwierząt kontrolnych (sól fizjologiczna). E. Western blot wykazujący zmniejszone stężenie aktywnej (cleaved) kaspazy-3 w tkance wątroby zwierząt leczonych PEG-SOD w porównaniu do zwierząt leczonych kontrolnie (sól fizjologiczna). F. Poziom aktywnej (cleaved) kaspazy-3 w tkance wątroby jest istotnie zwiększony u zwierząt po zacisku wnękowym i reperfuzji (p < 0,05). Zastosowano test t studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. G. Porównując tkankę wątroby lewego płata zwierząt eksperymentalnych (podano PEG-SOD) i tkankę wątroby lewego płata zwierząt kontrolnych (podano sól fizjologiczną), stwierdzono istotnie zmniejszone stężenie aktywnej (cleaved) kaspazy-3 u zwierząt leczonych PEG-SOD w porównaniu do zwierząt leczonych kontrolnie (sól fizjologiczna). Zastosowano test t studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.
Dyskusja
Ta seria eksperymentów wykazała, że wstrzyknięcie PEG-SOD do lewego i środkowego płata doprowadziło do znacznego zmniejszenia uwalniania ALT, peroksydacji lipidów błon komórkowych (MDA) i utrzymania glutationu (GSH) w porównaniu z grupą kontrolną (normalna sól fizjologiczna). Aminotransferazy tkankowe wątroby, w tym aminotransferaza alaninowa (AlAT), są ustalonymi markerami uszkodzenia komórek wątrobowych. Zmniejszenie aktywności AlAT po wstrzyknięciu PEG-SOD do lewego płata sugeruje ochronne działanie PEG-SOD. Zwiększone MDA w tkankach wskazuje na zwiększoną peroksydację lipidów i jest uważane za marker stresu oksydacyjnego i uszkodzenia tkanek. Nadprodukcja reaktywnych form tlenu powoduje wzrost produkcji MDA26. Znaczne zmniejszenie tkankowego MDA w lewym i środkowym płacie zwierzęcia po wstrzyknięciu PEG-SOD wykazuje ochronne działanie PEG-SOD. Jest to zgodne z obecnym zrozumieniem, że PEG-SOD chroni komórki przed uszkodzeniami spowodowanymi przez częściowo zredukowane reaktywne formy tlenu27. Dodatkowo, w obecności reaktywnych form tlenu, dwusiarczek glutationu ulega redukcji do glutationu (GSH)28. Utrzymanie się GSH w lewym i środkowym płacie wątroby, do której wstrzyknięto PEG-SOD, dodatkowo wzmacnia ochronne działanie PEG-SOD. Dodatkowo wykazano, że w tkance narażonej na uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne występuje zwiększona rozszczepiona kaspaza-3, produkt apoptozy. Zmniejszenie rozszczepionej kaspazy-3 w lewym płacie podczas leczenia PEG-SOD sugeruje, że PEG-SOD prowadzi do zmniejszenia apoptozy.
Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) jest kluczowym enzymem w detoksykacji reaktywnych form tlenu. Enzym katalizuje przemianę dwóch anionów ponadtlenkowych w nadtlenek wodoru i wodę. Enzym katalaza następnie przekształca nadtlenek wodoru w wodę i tlen, kończąc proces25. Okres półtrwania natywnego SOD ograniczał jego zastosowanie w modelach eksperymentalnych do czasu opracowania sprzężonej dysmutazy ponadtlenkowej glikolu polietylenowego (PEG-SOD). Sprzężenie SOD z glikolem polietylenowym wydłuża jego okres półtrwania z 6 min do 14 h. Nguyen i wsp. wykazali jego zdolność do łagodzenia peroksydacji lipidów w niedokrwieniu wątroby w modelu szczurzym, przy użyciu dostarczania ogólnoustrojowego29.
Istnieje wiele potencjalnych modyfikacji techniki opisanych w tym miejscu, a niektóre z nich zostały już wcześniej opisane w literaturze. W zależności od zastosowanego modelu cząsteczki były dostarczane za pomocą inhalacji11, wlewu zewnątrzoponowego12, iniekcji dootrzewnowej 17,18,21,22, podania dożylnego 10,14,15,19,23,24 lub wstrzyknięcia do obwodowej żyły krezkowej górnej 8.
W tym protokole jest kilka krytycznych kroków. Najważniejsza jest kaniulacja żyły wrotnej. Należy uważać, aby otwór wycięty w żyle nie był zbyt duży. Tkanka jest bardzo elastyczna, a otwór sam się powiększy. Zalecamy zacząć od wycięcia otworu o wielkości 0,5 mm nożyczkami mikrochirurgicznymi. Kaniula może być wprowadzana przez otwór za pomocą instrumentu, co pozwala na większą zwinność niż w przypadku próby wykonania tej części zabiegu ręcznie. Dodatkowo, początkowo zasilając kaniulę, powinna być ona skierowana bezpośrednio w stronę rozwidlenia lewej i prawej żyły wrotnej, aby uniknąć wybicia w tylnej ścianie żyły. Kiedy końcówka kaniuli dotrze do rozwidlenia, może być następnie podawana specjalnie do lewej żyły. Po wprowadzeniu kaniuli do lewej żyły wrotnej, która zaopatruje zarówno lewy, jak i środkowy płat, jej położenie można potwierdzić ręcznie, wyczuwając ją wewnątrz żyły. Jego pozycję można również potwierdzić, wstrzykując niewielką ilość zimnej soli fizjologicznej i obserwując efekt blanszowania na zaopatrywane segmenty wątroby.
Model klamry wnękowej wątroby u szczura stanowi powtarzalną i stabilną platformę do wykazywania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego wątroby. Zmienne modele zacisków wnękowych zostały wykorzystane przez naukowców do badania ochronnego działania przeciwutleniaczy i innych małych cząsteczek 6,7,8,9,10,11,12,13,14. Punkty zmienności obejmują, które naczynia są zaciśnięte, które segmenty są niedokrwione, czy przewód żółciowy jest włączony, czy nie, oraz długość okresu reperfuzji 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Dodatkowo, gdy model ten jest używany do badania wpływu podania cząsteczki, droga podania jest również niejednorodna 8,10,11,12,14,15,17,18,19,21,22,23,24 . Opisane podejście ma kilka zalet. Po pierwsze, bezpośrednia kaniulacja dopływu wrotnego do segmentu niedokrwiennego pozwala na bezpośrednie segmentowe dostarczanie badanej substancji farmakologicznej do wątroby. Pozwala to na wykorzystanie innych płatów wątroby jako kontroli wewnętrznej. Po drugie, segmentowa kaniulacja wątroby pozwala na zmniejszenie objętości dystrybucji badanej cząsteczki. Takie podejście zmniejsza w ten sposób ryzyko wystąpienia ogólnoustrojowych działań niepożądanych, ponieważ substancja jest wstrzykiwana bezpośrednio do interesującego segmentu wątroby. Bezpośrednia kaniulacja odcinka wątrobowego pozwala na dostarczenie substancji przed niedokrwieniem, dokrwiennym lub po niedokrwieniu. Pozwala to na badanie wpływu cząsteczki w dowolnym momencie cyklu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Wraz ze wzrostem czasu niedokrwienia i zwiększonego poziomu uszkodzenia dostępna byłaby dodatkowa możliwość badania regeneracji wątroby.
Istnieją również pewne ograniczenia tego podejścia. Pierwszym z nich jest koszt rozpoczęcia działalności. Zakup mikroskopu chirurgicznego może być znacznym kosztem początkowym dla laboratorium, które jeszcze go nie posiada. Ta technika może być trudna lub niemożliwa bez mikroskopu. Drugi to czas krzywej uczenia się. Chociaż ta procedura jest stosunkowo prosta, wymaga pewnej praktyki i jest prawdopodobne, że nowicjusz będzie wymagał znacznej liczby procedur, aby stać się ekspertem.
Podsumowując, model ten pozwala na stworzenie powtarzalnej, prostej i opłacalnej platformy do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego wątroby. Chociaż w opisanym tutaj protokole zastosowano dysmutazę ponadtlenkową glikolu polietylenowego, wymiatacza wolnych rodników25, model ten można wykorzystać do podawania wielu różnych substancji farmakologicznych w celu oceny ich wpływu na uszkodzenie I/R w wątrobie.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają żadnych ujawnień.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Dennisowi Mathiasowi za jego ilustracyjną pracę. Prace te były wspierane przez NIH T32AI 106704-01A1 oraz T. Flesch Fund for Organ Transplantation, Perfusion, Engineering and Regeneration na Uniwersytecie Stanowym Ohio.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szczur Sprague-Dawley | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 gramów | |
| Mikroskop chirurgiczny | Leica | M500-N z kanistrami na węgiel drzewny OHS | |
| Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | ||
| Izofluran o masie cząsteczkowej 184,5 | Piramal Healthcare | ||
| Pressure-Lok | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Macan | MV-7A | ||
| Braintree Scientific | HHP2 | ||
| SomnoSuite System do znieczulenia małych zwierząt | Kent Scientific | SS-MVG | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Komora izofluranowa | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tlen stołowy | |
| Praxair | 98015 | ||
| 27-0 Mikrokaniula | Braintree Scientific | MC-28 | |
| Zwijacze żeber | Kent Naukowy | ||
| Glikol polietylenowy - dysmutaza ponadtlenkowa (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| GenieTouch | Kent Scientific | ||
| Sól fizjologiczna normalna | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| Gąbki włókninowe 4 x 4 | Kryterium | 104-2411 | |
| Sterylne końcówki Q | Henry Schein Zdrowie zwierząt | 1009175 | |
| U-100 Strzykawka insulinowa o rozmiarze 27 | Terumo | 22-272328 | |
| Strzykawka 5 ml | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Pleciony szew jedwabny | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Pleciony jedwabny szew | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 1,8 ml Arcticle Rurka kriogeniczna | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Instrumenty mikrochirurgiczne | |||
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Małe nożyczki | Roboz | RS-5610 | |
| Duże nożyczki | S& T | Kleszcze SAA-15 | |
| - duże kątowe | S& T | Kleszcze JFCL-7 | |
| - małe kątowe | S& T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Nożyczki - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Kleszcze - prosta końcówka | S& T | FRS-15 RM8TC | |
| Duży klips mikrochirurgiczny | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Mały klips mikrochirurgiczny | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Mały klips mikrochirurgiczny | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Mały klips mikrochirurgiczny | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Inne instrumenty | |||
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Uwagi |
| Małe zaciski na komary | Ogólny | ||
| Analiza | |||
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Uwagi |
| Aminotransferaza alaninowa (ALT) | Test Biovision | K752-100 | |
| Malondialdehye (MDA) | Biblioteka | ab118970 | |
| Test glutationu (GSH) | chemicznej Kajmanów | ||
| - Rozszczepiona kaspaza-3 i aktyna | Technologia sygnalizacji komórkowej Przeciwciało | 9661 | |
| ImageJ Oprogramowanie | Narodowe Instytuty Zdrowia | ||
| Bufor do lizy i ekstrakcji RIPA | Milipory | 10-188 |
Bibliografia
- Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
- Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
- Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
- OPTN. Overall by Organ. Current US Waiting List. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
- OPTN. Transplants in the US by Recipient ABO. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
- Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
- Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
- Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
- Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
- Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
- Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363(2016).
- Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
- Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
- Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
- Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
- Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
- Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
- Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. , 601-607 (2015).
- Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. , 3196431(2016).
- Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
- Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. , (2015).
- Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
- Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
- Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20White%20Paper.pdf 1-14 (2012).
- Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
- Carlberg, I., Mannervik, B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490 (1985).
- Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
