Artykuł metodologiczny

Metoda bezpośredniego segmentalnego dostarczania dowątrobowego przy użyciu modelu klamry Hilar wątroby szczura

DOI:

10.3791/54729

⸱

2 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Lab, Division of Transplant, Department of Surgery, Comprehensive Transplant Center, The Ohio State University Wexner Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unikalny model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do badania wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Model ten obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie dostarczenie wątrobowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poważna operacja wątroby z niedrożnością dopływu i przeszczepem wątroby, wymaga okresu ciepłego niedokrwienia i okresu reperfuzji prowadzącego do uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) z niezliczonymi negatywnymi konsekwencjami. Potencjalne uszkodzenia I/R w narządach brzeżnych przeznaczonych do przeszczepienia wątroby przyczyniają się do obecnego niedoboru dawców, co jest równoznaczne ze zmniejszonym wskaźnikiem wykorzystania narządów. Istnieje znacząca potrzeba zbadania uszkodzenia I/R wątroby w celu pośredniczenia w jego wpływie na funkcję przeszczepu w przeszczepie. Modele zacisków wnękowych wątroby szczura są wykorzystywane do badania wpływu różnych cząsteczek na uszkodzenie I/R wątroby. W zależności od modelu, cząsteczki te zostały dostarczone za pomocą inhalacji, wlewu zewnątrzoponowego, wstrzyknięcia dootrzewnowego, podania dożylnego lub wstrzyknięcia do obwodowej żyły krezkowej górnej. Model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do wykorzystania w badaniu wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzeń I/R. Opisany model zacisku wnękowego wątroby szczura obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez boczne odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie segmentowe podawanie wątrobowe. Nasze podejście polega na wywołaniu niedokrwienia w lewym płacie bocznym i środkowym przez 60 minut, w tym czasie podawana jest badana substancja. W tym przypadku pegylowana dysmutaza ponadtlenkowa (PEG-SOD), wymiatacz wolnych rodników, jest podawana bezpośrednio do segmentu niedokrwiennego. Ta seria eksperymentów wykazała, że infuzja PEG-SOD chroni przed uszkodzeniem I/R wątroby. Do zalet tego podejścia należy bezpośrednie wstrzyknięcie cząsteczki do segmentu niedokrwiennego, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia objętości dystrybucji i zmniejszenia ogólnoustrojowych skutków ubocznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duża operacja wątroby z niedrożnością dopływu i przeszczepem wątroby, wymaga okresu ciepłego niedokrwienia i okresu reperfuzji prowadzącego do niedokrwienia/uszkodzenia reperfuzyjnego (I/R)1. Konsekwencje uszkodzenia I/R w wątrobie zostały szczegółowo opisane1,2,3. Konsekwencje uszkodzenia I/R szczegółowo opisane w literaturze obejmują: wytwarzanie reaktywnych form tlenu, inicjację kaskady zapalnej, w tym aktywację neutrofili, komórek Kupffera i komórek śródbłonka, aktywację systemu oksygenazy hemowej i aktywację receptorów toll-podobnych, brak równowagi między endoteliną a tlenkiem azotu, aktywację czynnika jądrowego-κB oraz promowanie syntezy cytokin prozapalnych i cząsteczek adhezyjnych1,2,3. Te prozapalne zdarzenia mogą prowadzić do apoptozy, martwicy, dysfunkcji narządów i ostatecznie niewydolności narządów3.

I/R uszkodzenia w organach przeznaczonych do przeszczepu wątroby mogą prowadzić do wczesnej utraty przeszczepu i przyczyniają się do obecnego niedoboru dawców, ponieważ narządy brzeżne są bardziej podatne na uszkodzenia3. Obecnie na liście oczekujących na przeszczep wątroby w Stanach Zjednoczonych znajduje się 15 226 potencjalnych biorców4, a w 2015 roku wykonano tylko 5 950 przeszczepów wątroby5. Ze względu na to ekstremalne ograniczenie dostępności narządów, potrzebne są badania nad uszkodzeniem I/R wątroby w celu optymalizacji funkcji przeszczepu i wykorzystania narządów.

Modele zwierzęce używane do badania uszkodzeń wątroby I/R obejmują modele klamry wnękowej szczura i modele przeszczepu wątroby szczura. Obecnie w użyciu jest wiele modeli zacisków wnękowych dla szczurów. Najczęstszym jest taki, w którym żyła wrotna, tętnica wątrobowa i przewód żółciowy zaopatrujące lewy płat boczny i środkowy są zaciskane za pomocą klipsów mikrochirurgicznych6,7,8,9,10,11,12 przez 30 do 60 min6,7,10,13,14, a następnie okres reperfuzji od 60 min do 24 h7,9,10,13,14 jest dozwolone. Lewy płat boczny i środkowy wątroby szczura stanowi około 70% miąższu wątroby9. Niektóre protokoły opracowane do badania wstępnego kondycjonowania niedokrwiennego obejmują przerywane zaciskanie naczyń wnękowych lub kończyny tylnej przed dłuższym okresem niedokrwienia wywołanym przez zaciśnięcie naczyń wnękowych9,13. Istnieje również kilka modyfikacji opisanych w literaturze. Pierwszym z nich jest zaciśnięcie żyły wrotnej i tętnicy wątrobowej zaopatrującej lewy płat boczny i środkowy, ale z wyłączeniem przewodu żółciowego15. Drugą modyfikacją jest wywołanie całkowitego niedokrwienia wątroby poprzez zaciśnięcie żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i przewodu żółciowego przed ich podziałem16,17,18,19,20. Trzecia modyfikacja polega na zaciśnięciu naczyń wnękowych do prawego płata przez 30 do 60 min8. Dodatkowa modyfikacja polega na zaciśnięciu pęczka naczyniowego w jednej kończynie tylnej w celu wywołania urazu wątroby13,21. Różne podejścia do procedury zacisku wnękowego są zilustrowane w Rysunek 1A-D.

Modele zacisków wnękowych wątroby szczura zostały wykorzystane do zbadania wpływu różnych cząsteczek i związków na I/R wątroby. W zależności od użytego modelu, cząsteczki te zostały dostarczone za pomocą inhalacji11, infuzja zewnątrzoponowa12, iniekcja dootrzewnowa17,18,21,22, podanie dożylne10,14,15,19,23,24 lub wstrzyknięcie do żyły krezkowej górnej obwodowej8.

Model zacisku wnękowego wątroby szczura opisany w tym raporcie obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotu do segmentu niedokrwiennego przez boczne odgałęzienie żyły wrotnej (Rysunek 2), co pozwala na bezpośrednie segmentowe dostarczanie badanej substancji farmakologicznej do wątroby. Nasze podejście polega na wywołaniu niedokrwienia w lewym płacie bocznym i środkowym przez 60 minut, w tym czasie wlew badanej substancji, w tym przypadku pegylowanej dysmutazy ponadtlenkowej, wymiatacza wolnych rodników25, jest podawany bezpośrednio do segmentu niedokrwiennego. Próbki krwi pobiera się przed indukcją niedokrwienia i po 120 minutach od reperfuzji. W tym momencie szczur jest uśmiercany i pobierane są próbki z lewego i środkowego płata. Dodatkowo próbki są pobierane z prawego płata, które służą jako kontrola wewnętrzna.

Istnieje wiele zalet tego podejścia. Przede wszystkim, gdy badana substancja farmakologiczna może być bezpośrednio wstrzyknięta do segmentu niedokrwiennego, objętość dystrybucji jest dość mała w porównaniu z objętością dystrybucji iniekcji do krążenia ogólnoustrojowego lub jamy otrzewnej. Dodatkowo takie podejście zmniejsza, choć nie eliminuje, możliwość wystąpienia ogólnoustrojowych skutków ubocznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care oraz National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals (IACUC) i przeszły zatwierdzenie przez komitet IACUC Uniwersytetu Stanowego Ohio.

1. Wstępna konfiguracja

  1. Ustaw mikroskop chirurgiczny i salę operacyjną (Rysunek 3, Rysunek 4). Włącz wszystkie urządzenia, w tym sprzęt do utrzymywania znieczulenia i monitorowania parametrów życiowych. Włącz aparat elektrochirurgiczny i podkładkę rozgrzewającą. Umieścić pompę infuzyjną w pobliżu stołu operacyjnego.
    1. Pobrać 10 ml płynnego izofluranu do inhalacji (masa cząsteczkowa 184,5) do strzykawki anestezjologicznej i umieścić ją w jednostce anestezjologicznej.
    2. Ustaw pojemnik o pojemności 200 ml z ciekłym azotem w pobliżu stołu operacyjnego, a drugi w pobliżu wirówki, w której będą przetwarzane próbki krwi.
    3. W pobliżu stołu operacyjnego umieść narzędzia chirurgiczne, pleciony jedwabny szew 4-0 i 7-0, sterylne waciki, gąbki z włókniny 4x4, strzykawki 5 ml i strzykawki insulinowe o rozmiarze 27 w pobliżu stołu operacyjnego.
  2. Przygotować komorę izofuranu i upewnić się, że wystarczająca ilość izofluranu została wkroplona do systemu podawania znieczulenia.

2. Indukcja znieczulenia

  1. Przed kontaktem ze szczurem należy założyć następujące środki ochrony osobistej (PPE): maskę chirurgiczną, rękawiczki chirurgiczne i jednorazowy fartuch.
  2. Zważ szczura i zapisz wagę.
    UWAGA: Należy użyć szczurów Sprague Dawley.
  3. Umieść szczura w komorze anestezjologicznej i włącz izofluran i tlen. Wywołać znieczulenie za pomocą komory izofluranowej.
  4. Przytnij włosy na brzuchu zwierzęcia za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia włosów, aby umożliwić czystszą ekspozycję (Rysunek 5).
  5. Umieść zwierzę z powrotem w komorze izofluranu na dodatkową minutę. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.

3. Procedura

  1. Umieść szczura z nosem zwierzęcia w stożku nosowym i czterema kończynami unieruchomionymi za pomocą pasów lub taśmy na podkładce rozgrzewającej.
  2. Kontynuować znieczulenie za pomocą systemu podawania znieczulenia, stożka nosowego i izofluranu w znieczuleniu na poziomie 3,6% dla zwierząt o masie ciała od 200 do 250 g i 4% dla zwierząt o masie ciała powyżej 250 g. Potwierdź głębokość znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i uszczypnięcie skóry.
  3. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej od łona do mieczykowatego przez skórę za pomocą ostrych nożyczek (Ryc. 6).
  4. Wykonaj nacięcie w otrzewnej wzdłuż kresy białej od łona do mieczykowatej i wejdź do jamy brzusznej, uważając, aby nie uszkodzić pęcherza moczowego ani jelita. Ponieważ wątroba przylega również do otrzewnej z przodu w pobliżu wyrostka mieczykowatego, upewnij się, że uwalnia się przed nacięciem ściany brzucha w tym obszarze.
  5. Wykonaj poprzeczne nacięcie przez skórę i otrzewną na poziomie dolnej granicy prawego płata wątroby.
  6. Zmniejsz znieczulenie do 1,6% dla zwierząt o masie ciała od 200 do 250 g i 2% dla zwierząt o masie ciała powyżej 250 g.
  7. Cofnij wyrostek mieczykowaty za pomocą zakrzywionego zacisku na komary.
  8. Umieść zwijacze żeber ciągnąc żebra jak najdalej od linii środkowej (Rysunek 7). Przetnij więzadła sierpowe, przeponowe i żołądkowe. Podnieś wątrobę za pomocą zwilżonych sterylnych wacików.
  9. W razie potrzeby przetnij dodatkowe więzadła, aby uzyskać dostęp do porta. Wykonaj rotację trzewną za pomocą gazy zwilżonej solą fizjologiczną (Rysunek 7).
  10. Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą wnękę wrotną za pomocą ostrego lub rozwarstwienia. Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą długość żyły wrotnej.
  11. Użyj kleszczy, aby przepchnąć luźną tkankę łączną z tyłu do lewej żyły wrotnej, tętnicy i przewodu żółciowego, tworząc okno i umieść szew Pottsa 4-0, ale nie zaciskaj (Ryc. 8).
  12. Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą tylną gałąź z żyłą wrotną, która znajduje się mniej więcej na poziomie prawej nerki. Ta żyła będzie używana do kaniulacji.
  13. Pobrać 0,5 ml krwi z żyły głównej dolnej (IVC) za pomocą strzykawki insulinowej (Rycina 9). Umieścić 0,5 ml krwi w małej fiolce, odwirować przy 135 x g przez 12 minut. Spróbuj ściągnąć serum.
    1. Jeśli nie można dostrzec wyraźnej linii między czerwonymi krwinkami a surowicą, spróbuj odwirować przez dodatkowe 2 - 3 minuty przy 135 x g. Odciągnąć surowicę i umieścić w fiolce z aminotransferazą alaninową (ALT). Zamroź tę próbkę zatrzaskowo, umieszczając ją bezpośrednio w ciekłym azocie.
  14. Wytnij dwa kawałki szwu 7-0 i umieść w pobliżu żyły, która będzie używana do kaniulacji. Umieść pierwszą pętlę 7-0 wokół tej żyły tak daleko, jak to możliwe. Zawiąż tę pętlę i użyj jej do schowania za pomocą zakrzywionego zacisku na komary (Rysunek 10). Umieść drugą pętlę 7-0 na żyle, która będzie używana do kaniulacji, w pobliżu jej przecięcia z żyłą wrotną i umieść jedną opaskę, ale nie zaciskaj.
  15. Przygotować pompę infuzyjną za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i 3 ml odczynnika. Zagruntować rurkę.
  16. Zaciśnij dystalną żyłę wrotną za pomocą zacisku mikrochirurgicznego.
    UWAGA: Zmniejszy to krwawienie, gdy żyła zostanie nacięta w celu kaniulacji.
  17. Wytnij otwór 0,5 mm w żyle między szwem podciągowym 7-0 a jego przecięciem z żyłą wrotną za pomocą małych nożyczek mikrochirurgicznych. Użyj cewnika 27-0, aby kaniulować lewy układ żyły wrotnej (Rysunek 11, Rysunek 12). Wprowadzić cewnik za rozwidlenie lewej i prawej żyły wrotnej.
  18. Sprawdź położenie kaniuli, podając 1 ml soli fizjologicznej i obserwuj, czy lewy boczny i środkowy płat wątroby bledną. Ręcznie upewnij się, że cewnik znajduje się poza startem prawej żyły wrotnej, ale nie poza startem żyły wrotnej zasilającej płat środkowy.
  19. Zaciśnij szew Potts i rozpocznij czas niedokrwienia. Zaciśnij szew 7-0 wokół żyły i cewnika 27-0, aby utrzymać go na miejscu i usuń zacisk z dystalnej żyły wrotnej.
  20. Rozpocząć infuzję dysmutazy ponadtlenkowej glikolu polietylenowego (PEG-SOD, 0,00067 g/ml) za pomocą pompy infuzyjnej. Infuzję należy rozpocząć jak najbliżej początku czasu niedokrwiennego.

4. Monitorowanie

  1. Kontynuuj monitorowanie parametrów życiowych zwierzęcia przez cały czas trwania infuzji. Dostarczyć 2 ml 0,9% soli fizjologicznej lub 2 ml PEG-SOD (0,00067 g/ml) rozpuszczonych w 0,9% soli fizjologicznej przez okres 15 minut.

5. Reperfuzja

  1. Odczekaj godzinę od początku czasu niedokrwiennego. Jest to 1 godzina ciepłego czasu niedokrwienia.
  2. Usuń szew Pottsa. Usuń cewnik 27-0. Zaciśnij szew 7-0 wokół żyły. Zanotuj godzinę. To oznacza czas reperfuzji.

6. Kontynuacja próbkowania

  1. Pobrać 0,5 ml krwi z IVC po 120 minutach po reperfuzji. Pobieraj krew powoli, aby uniknąć lizy czerwonych krwinek. Powoli wlewać krew do fiolki. Upewnij się, że krwawienie z IVC jest kontrolowane po każdym pobraniu krwi.
    1. Jeśli krwawienie utrzymuje się, delikatnie dociśnij go sterylnym wacikiem lub małym odcinkiem o wymiarach 1 cm na 1 cm wyciętym z gazy.
  2. Wirować przy 135 x g przez 12 min. Jeśli nie zostanie osiągnięta wystarczająca separacja, spróbuj dodatkowych 2 - 3 minut przy 135 x g.
  3. Umieścić połowę surowicy w fiolce w celu późniejszego przetworzenia na ALT. Próbki te należy zamrozić na zatrzask.

7. Eutanazja

  1. Podczas gdy szczur jest nadal pod narkozą, odetnij IVC i żyłę główną górną (SVC) i monitoruj, aż przepływ krwi, oddychanie i bicie serca ustaną.
  2. Naciąć przeponę i wykonać krótką hepatektomię, nacinając przeponę w kółko i nacinając dodatkową tkankę łączną, która pozostaje łącząca wątrobę z jamą otrzewną. Usuń wątrobę z jamy otrzewnej.
  3. Pobrać cztery próbki z lewego i środkowego płata wątroby oraz cztery próbki z prawego płata wątroby. Próbki powinny być jak największe, a ich wielkość będzie ograniczona jedynie ilością dostępnej tkanki wątroby. Umieść je w małych, oznakowanych fiolkach i zamroź w ciekłym azocie. Użyj ich do późniejszego przetwarzania w tkankach adenozynotrifosforanu (ADP), dialdehydu malonowego (MDA) i glutationu (GSH).

8. Analiza po eksperymencie

  1. Oznaczyć aktywność glutationu (GSH), dialdehydu malonowego (MDA) i aminotransferazy alaninowej (ALT) w tkance wątroby i próbkach surowicy za pomocą zestawów diagnostycznych zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Homogenizować tkankę wątroby za pomocą buforu do lizy i oznaczać ilościowo za pomocą testu Bradforda. Analizuj lizat tkankowy za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu oraz immunoblot przy użyciu przeciwciał przeciwko rozszczepionej kapazie-3 i aktynie. Ilościowe określanie western blot wykonane za pomocą publicznie dostępnego oprogramowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten eksperyment został przeprowadzony na 2 grupach po n = 3 szczury każda. Trzem wątrobom szczurów wstrzyknięto 2 ml soli fizjologicznej (NS) za pomocą pompy infuzyjnej przez okres 15 minut. Trzem wątrobom szczurów wstrzyknięto 2 ml soli fizjologicznej (NS) zmieszanej z dysmutazą ponadtlenkową pegylowaną (PEG-SOD, 0,00067 g/ml) za pomocą pompy infuzyjnej przez okres 15 minut. Jak opisano w powyższym protokole, próbki krwi pobrano przed klamrą wnękową i po 120 minutach po reperfuzji. Dodatkowo, po zakończeniu 120-minutowej reperfuzji, pobrano cztery próbki tkanki wątroby z lewego i środkowego płata oraz cztery próbki wątroby z prawego płata wątroby szczura.

Aminotransferaza alaninowa (ALT) w surowicy została zmierzona przed zaciskiem wnękowym i po 120 minutach po reperfuzji u zwierząt kontrolnych (NS) i eksperymentalnych (PEG-SOD). Stwierdzono istotną różnicę między poziomem kontroli ALT (NS) u zwierząt przed zaciskiem wnękowym i po 120 minutach po reperfuzji. Stwierdzono istotną różnicę między poziomem kontroli ALT (NS) a zwierzętami doświadczalnymi (PEG-SOD) po 120 minutach (Rysunek 13A). Tkankowy aldehyd malonowy (MDA) mierzono u zwierząt kontrolnych (NS) i doświadczalnych (PEG-SOD) zarówno w prawym, jak i lewym płacie wątroby. Tkankowe MDA w prawym płacie (klamra niewnękowa) z iniekcją kontrolną (NS) i iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) nie wykazują istotnej różnicy. Tkanka MDA lewego płata (klamra po wnęce i reperfuzji) z iniekcją kontrolną (NS) istotnie różni się od prawego płata (klamra niewnękowa) p < 0,001. Lewy płat (zacisk po wnęce i reperfuzja) ma znacząco różne poziomy tkankowego MDA z iniekcją kontrolną (NS) w porównaniu z iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) p < 0,005 (Figura 13B). Zmierzono glutation tkankowy (GSH), a glutation tkankowy w prawym płacie (klamra niewnękowa) z iniekcją kontrolną (NS) i iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) nie wykazał istotnej różnicy. Tkanka lewego płata (klamra po wnęce i reperfuzja) GSH z iniekcją kontrolną (NS) istotnie różni się od prawego płata (klamra bez wnęki) z iniekcją kontrolną (NS) p < 0,05. Lewy płat (zacisk po wnęce i reperfuzja) ma znacząco różne poziomy glutationu tkankowego z iniekcją kontrolną (NS) w porównaniu z iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) p < 0,005 (Rysunek 13C). Western blot porównano prawy i lewy płat zwierząt kontrolnych i wykazano zwiększoną rozszczepioną kaspazę-3 w lewym płacie po zacisku wnękowym i reperfuzji (Ryc. 13D). Przeprowadzono drugi western blot porównując lewe płaty zwierząt leczonych kontrolą i PEG-SOD (Ryc. 13E). Świadczy to o zmniejszeniu ilości rozszczepionej kaspazy-3 w tkance wątroby zwierząt leczonych PEG-SOD. Przeprowadzono również densytometrię, która wykazała, że poziom rozszczepionej kaspazy-3 w tkance wątroby jest znacznie zwiększony w lewym i prawym płacie zwierząt kontrolnych (Ryc. 13F). Porównując tkankę wątroby lewego płata zwierząt doświadczalnych, którym podawano PEG-SOD, i tkankę wątroby lewego płata zwierząt kontrolnych, podawaną roztworem soli fizjologicznej, densytometria wykazała znacznie zmniejszoną rozszczepioną kaspazę-3 u zwierząt leczonych PEG-SOD w porównaniu ze zwierzętami leczonymi kontrolą (Figura 13G).

Diagram anatomii wątroby; szczegółowa żyła wrotna, tętnica wątrobowa, gałęzie dróg żółciowych; wykształcenie medyczne.
Rysunek 1: Ilustracje anatomiczne. Anatomiczna ilustracja wątroby szczura. Ur. Anatomiczna ilustracja wątroby szczura. Szypułka wrotna po lewej stronie i środkowe płaty wątroby są zaciśnięte. Płat lewy i środkowy są niedokrwienne. C. Anatomiczna ilustracja wątroby szczura. Szypułka wrotna do lewego płata jest zaciśnięta. Lewy płat jest niedokrwienny. D. Anatomiczna ilustracja wątroby szczura. Szypułka wrotna do prawego płata jest zaciśnięta, a prawy płat jest niedokrwienny.

Schemat perfuzji wątroby z kaniulą do badania naczyniowego, ilustrujący budowę anatomiczną.
Rysunek 2: Ilustracje anatomiczne. Anatomiczna ilustracja wątroby szczura z żyłą wrotną kaniulowaną przez boczną gałąź. Szypułka wrotna po lewej stronie i środkowe płaty wątroby są otoczone szwem, a zacisk mikronaczyniowy został użyty do zaciśnięcia wokół pęczka naczyniowego. Płat lewy i środkowy są niedokrwienne.

Konfiguracja narzędzi chirurgicznych; narzędzia: nożyczki, kleszcze, skalpel. Widoczny sprzęt do sterylizacji.
Rysunek 3: Konfiguracja przyrządu. Ten rysunek przedstawia konfigurację przyrządu.

Zestaw mikroskopu chirurgicznego do prac precyzyjnych; widoczny mikroskop, panel sterowania, narzędzia stołu warsztatowego.
Rysunek 4: Konfiguracja sali operacyjnej. Rysunek ten przedstawia konfigurację sali operacyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Eksperyment laboratoryjny; badacz zajmujący się gryzoniami do badań; biologiczna procedura badawcza.
Rycina 5: Przycinanie włosów na brzuchu. Ten rysunek pokazuje przycinanie włosów na brzuchu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zabieg chirurgiczny pod mikroskopem; sterylna technika w warunkach laboratoryjnych do badań medycznych.
Rycina 6: Unieruchomienie i nacięcie skóry. Ten rysunek pokazuje unieruchomienie szczura i nacięcie skóry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Chirurgiczna sekcja szczurów, badanie anatomiczne, konfiguracja eksperymentu, prezentacja narządów wewnętrznych i analiza tkanek.
Rysunek 7: Umiejscowienie i patroszenie retraktora żeber. Rysunek ten przedstawia umiejscowienie i patroszenie retraktora żeber. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sekcja zwierząt, zabieg chirurgiczny, odsłonięcie narządów wewnętrznych, badanie anatomiczne, badania edukacyjne.
Rycina 8: Umieszczenie szwu. Ten rysunek pokazuje umiejscowienie szwu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zabieg chirurgiczny na szczurze laboratoryjnym do badań eksperymentalnych, narzędzia preparacyjne, precyzyjna technika.
Rycina 9: Pobieranie krwi z żyły głównej dolnej. Rysunek ten pokazuje pobranie krwi z żyły głównej dolnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sekcja zwłok zwierząt pokazująca narządy wewnętrzne; Konfiguracja eksperymentu z biologią edukacyjną.
Rycina 10: Gałąź żyły związana i cofnięta. Ten rysunek pokazuje gałąź żyły związaną i cofniętą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zabieg chirurgiczny na szczurze laboratoryjnym; zestaw preparacyjny do badań anatomicznych i biomedycznych.
Rysunek 11: Proces kaniulacji. Rysunek ten przedstawia proces kaniulacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sekcja zwłok na szczurach pokazująca narządy wewnętrzne; widoczne narzędzia chirurgiczne; studium anatomii.
Rysunek 12: Kanelacja. Ta liczba pokazuje kaniulację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Badanie niedokrwienia wątroby i reperfuzji; wykresy słupkowe, immunoblotting; ALT, MDA, poziom glutationu; PEG-SOD.
Rycina 13: Reprezentatywne wyniki: Bezpośrednie segmentowe dowątrobowe dostarczanie pegylowanej dysmutazy ponadtlenkowej przy użyciu modelu zacisku Hilar szczura. NS = sól fizjologiczna zwykła. PEG-SOD = pegylowana dysmutaza ponadtlenkowa, ALT = aminotransferaza alaninowa, MDA = dialdehyd malonowy. ZA. Aminotransferaza alaninowa w surowicy (ALT, mU/ml) w porównaniu między zaciskiem przed wnęką a 120-minutowym po reperfuzji. Istnieje znacząca różnica między kontrolą (NS) zaciskiem przedwnękowym a kontrolą (NS) po 120 minutach po reperfuzji (p < 0,001). Istnieje również istotna różnica między grupą kontrolną (NS) a grupą eksperymentalną (PEG-SOD) po 120 minutach po reperfuzji (p < 0,05). Wykorzystano test T studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Ur. Dialdehyd malonowy tkankowy w prawym płacie (klamra niewnękowa) z iniekcją kontrolną (NS) i iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) nie wykazuje istotnej różnicy. Dialdehyd malonowy tkankowy lewego płata (klamra po wnęce i reperfuzja) z iniekcją kontrolną (NS) znacznie różni się od prawego płata (klamra bez wnęki) p < 0,001. Lewy płat (zacisk po wnęce i reperfuzja) ma istotnie różne poziomy tkankowego aldehydu malonowego z iniekcją kontrolną (NS) w porównaniu z iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) p < 0,005. Wykorzystano test T studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. C. Glutation tkankowy w płacie prawym (klamra niewnękowa) z iniekcją kontrolną (NS) i iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) nie wykazuje istotnej różnicy. Glutation tkankowy lewego płata (klamra po wnęce i reperfuzja) z iniekcją kontrolną (NS) różni się istotnie od prawego płata (klamra bez wnęki) z iniekcją kontrolną (NS) p < 0,05. Lewy płat (klamra po wnęce i reperfuzja) ma istotnie różne poziomy glutationu tkankowego z iniekcją kontrolną (NS) w porównaniu z iniekcją eksperymentalną (PEG-SOD) p < 0,005. Wykorzystano test T studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. D. Western blot wykazujący zwiększoną rozszczepioną kaspazę-3 w tkance wątroby lewego płata (klamra po wnęce i reperfuzja) w porównaniu z prawym płatem (klamra bez wnęki) zwierząt kontrolnych (sól fizjologiczna normalna). E. Western blot wykazujący zmniejszenie rozszczepionej kaspazy-3 w tkance wątroby zwierząt leczonych PEG-SOD w porównaniu ze zwierzętami leczonymi kontrolą (sól fizjologiczna normalna). Fot. Poziom rozszczepionej kaspazy-3 w tkance wątroby jest znacznie zwiększony u zwierząt po klamrze wnękowej i reperfuzji (p < 0,05). Wykorzystano test T studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. G. Porównując tkankę wątroby lewego płata zwierząt doświadczalnych (podawaną w infuzji PEG-SOD) i tkankę wątroby lewego płata zwierząt kontrolnych (podawaną w infuzji soli fizjologicznej), stwierdzono znacznie zmniejszoną rozszczepioną kaspazę-3 u zwierząt leczonych PEG-SOD w porównaniu ze zwierzętami leczonymi kontrolą (sól fizjologiczna normalna). Wykorzystano test T studenta. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta seria eksperymentów wykazała, że wstrzyknięcie PEG-SOD do lewego i środkowego płata doprowadziło do znacznego zmniejszenia uwalniania ALT, peroksydacji lipidów błon komórkowych (MDA) i utrzymania glutationu (GSH) w porównaniu z grupą kontrolną (normalna sól fizjologiczna). Aminotransferazy tkankowe wątroby, w tym aminotransferaza alaninowa (AlAT), są ustalonymi markerami uszkodzenia komórek wątrobowych. Zmniejszenie aktywności AlAT po wstrzyknięciu PEG-SOD do lewego płata sugeruje ochronne działanie PEG-SOD. Zwiększone MDA w tkankach wskazuje na zwiększoną peroksydację lipidów i jest uważane za marker stresu oksydacyjnego i uszkodzenia tkanek. Nadprodukcja reaktywnych form tlenu powoduje wzrost produkcji MDA26. Znaczne zmniejszenie tkankowego MDA w lewym i środkowym płacie zwierzęcia po wstrzyknięciu PEG-SOD wykazuje ochronne działanie PEG-SOD. Jest to zgodne z obecnym zrozumieniem, że PEG-SOD chroni komórki przed uszkodzeniami spowodowanymi przez częściowo zredukowane reaktywne formy tlenu27. Dodatkowo, w obecności reaktywnych form tlenu, dwusiarczek glutationu ulega redukcji do glutationu (GSH)28. Utrzymanie się GSH w lewym i środkowym płacie wątroby, do której wstrzyknięto PEG-SOD, dodatkowo wzmacnia ochronne działanie PEG-SOD. Dodatkowo wykazano, że w tkance narażonej na uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne występuje zwiększona rozszczepiona kaspaza-3, produkt apoptozy. Zmniejszenie rozszczepionej kaspazy-3 w lewym płacie podczas leczenia PEG-SOD sugeruje, że PEG-SOD prowadzi do zmniejszenia apoptozy.

Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) jest kluczowym enzymem w detoksykacji reaktywnych form tlenu. Enzym katalizuje przemianę dwóch anionów ponadtlenkowych w nadtlenek wodoru i wodę. Enzym katalaza następnie przekształca nadtlenek wodoru w wodę i tlen, kończąc proces25. Okres półtrwania natywnego SOD ograniczał jego zastosowanie w modelach eksperymentalnych do czasu opracowania sprzężonej dysmutazy ponadtlenkowej glikolu polietylenowego (PEG-SOD). Sprzężenie SOD z glikolem polietylenowym wydłuża jego okres półtrwania z 6 min do 14 h. Nguyen i wsp. wykazali jego zdolność do łagodzenia peroksydacji lipidów w niedokrwieniu wątroby w modelu szczurzym, przy użyciu dostarczania ogólnoustrojowego29.

Istnieje wiele potencjalnych modyfikacji techniki opisanych w tym miejscu, a niektóre z nich zostały już wcześniej opisane w literaturze. W zależności od zastosowanego modelu cząsteczki były dostarczane za pomocą inhalacji11, wlewu zewnątrzoponowego12, iniekcji dootrzewnowej 17,18,21,22, podania dożylnego 10,14,15,19,23,24 lub wstrzyknięcia do obwodowej żyły krezkowej górnej 8.

W tym protokole jest kilka krytycznych kroków. Najważniejsza jest kaniulacja żyły wrotnej. Należy uważać, aby otwór wycięty w żyle nie był zbyt duży. Tkanka jest bardzo elastyczna, a otwór sam się powiększy. Zalecamy zacząć od wycięcia otworu o wielkości 0,5 mm nożyczkami mikrochirurgicznymi. Kaniula może być wprowadzana przez otwór za pomocą instrumentu, co pozwala na większą zwinność niż w przypadku próby wykonania tej części zabiegu ręcznie. Dodatkowo, początkowo zasilając kaniulę, powinna być ona skierowana bezpośrednio w stronę rozwidlenia lewej i prawej żyły wrotnej, aby uniknąć wybicia w tylnej ścianie żyły. Kiedy końcówka kaniuli dotrze do rozwidlenia, może być następnie podawana specjalnie do lewej żyły. Po wprowadzeniu kaniuli do lewej żyły wrotnej, która zaopatruje zarówno lewy, jak i środkowy płat, jej położenie można potwierdzić ręcznie, wyczuwając ją wewnątrz żyły. Jego pozycję można również potwierdzić, wstrzykując niewielką ilość zimnej soli fizjologicznej i obserwując efekt blanszowania na zaopatrywane segmenty wątroby.

Model klamry wnękowej wątroby u szczura stanowi powtarzalną i stabilną platformę do wykazywania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego wątroby. Zmienne modele zacisków wnękowych zostały wykorzystane przez naukowców do badania ochronnego działania przeciwutleniaczy i innych małych cząsteczek 6,7,8,9,10,11,12,13,14. Punkty zmienności obejmują, które naczynia są zaciśnięte, które segmenty są niedokrwione, czy przewód żółciowy jest włączony, czy nie, oraz długość okresu reperfuzji 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Dodatkowo, gdy model ten jest używany do badania wpływu podania cząsteczki, droga podania jest również niejednorodna 8,10,11,12,14,15,17,18,19,21,22,23,24 . Opisane podejście ma kilka zalet. Po pierwsze, bezpośrednia kaniulacja dopływu wrotnego do segmentu niedokrwiennego pozwala na bezpośrednie segmentowe dostarczanie badanej substancji farmakologicznej do wątroby. Pozwala to na wykorzystanie innych płatów wątroby jako kontroli wewnętrznej. Po drugie, segmentowa kaniulacja wątroby pozwala na zmniejszenie objętości dystrybucji badanej cząsteczki. Takie podejście zmniejsza w ten sposób ryzyko wystąpienia ogólnoustrojowych działań niepożądanych, ponieważ substancja jest wstrzykiwana bezpośrednio do interesującego segmentu wątroby. Bezpośrednia kaniulacja odcinka wątrobowego pozwala na dostarczenie substancji przed niedokrwieniem, dokrwiennym lub po niedokrwieniu. Pozwala to na badanie wpływu cząsteczki w dowolnym momencie cyklu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Wraz ze wzrostem czasu niedokrwienia i zwiększonego poziomu uszkodzenia dostępna byłaby dodatkowa możliwość badania regeneracji wątroby.

Istnieją również pewne ograniczenia tego podejścia. Pierwszym z nich jest koszt rozpoczęcia działalności. Zakup mikroskopu chirurgicznego może być znacznym kosztem początkowym dla laboratorium, które jeszcze go nie posiada. Ta technika może być trudna lub niemożliwa bez mikroskopu. Drugi to czas krzywej uczenia się. Chociaż ta procedura jest stosunkowo prosta, wymaga pewnej praktyki i jest prawdopodobne, że nowicjusz będzie wymagał znacznej liczby procedur, aby stać się ekspertem.

Podsumowując, model ten pozwala na stworzenie powtarzalnej, prostej i opłacalnej platformy do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego wątroby. Chociaż w opisanym tutaj protokole zastosowano dysmutazę ponadtlenkową glikolu polietylenowego, wymiatacza wolnych rodników25, model ten można wykorzystać do podawania wielu różnych substancji farmakologicznych w celu oceny ich wpływu na uszkodzenie I/R w wątrobie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają żadnych ujawnień.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dennisowi Mathiasowi za jego ilustracyjną pracę. Prace te były wspierane przez NIH T32AI 106704-01A1 oraz T. Flesch Fund for Organ Transplantation, Perfusion, Engineering and Regeneration na Uniwersytecie Stanowym Ohio.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczur Sprague-Dawley Harlan Sprague Dawley Inc. 200- 250 gramów 
Mikroskop chirurgiczny Leica M500-N z kanistrami na węgiel drzewny OHS
Kent ScientificSOMNO-2001-8
Izofluran o masie cząsteczkowej 184,5 Piramal Healthcare
Pressure-Lok   Valco Instruments Co, Inc. SOMNO-10ML
Macan MV-7A
Braintree Scientific HHP2
SomnoSuite System do znieczulenia małych zwierzątKent Scientific SS-MVG
PhysioSuiteKent Scientific PS-MSTAT-RT
Komora izofluranowa Kent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 Tlen stołowy
 Praxair98015
27-0 MikrokaniulaBraintree Scientific MC-28
Zwijacze żeber Kent Naukowy 
Glikol polietylenowy - dysmutaza ponadtlenkowa (PEG-SOD)Sigma Aldrich S9549 SIGMA
GenieTouchKent Scientific
Sól fizjologiczna normalnaBaxterNDC 0338-0048-04
Gąbki włókninowe 4 x 4 Kryterium104-2411
Sterylne końcówki QHenry Schein Zdrowie zwierząt1009175
U-100 Strzykawka insulinowa o rozmiarze 27Terumo22-272328
Strzykawka 5 mlBD REF 309603
4-0 Pleciony szew jedwabnyDeknatel, Inc.198737LP
7-0 Pleciony jedwabny szewTeleflex Medical REF 103-S
1,8 ml Arcticle Rurka kriogenicznaUSA Scientific 1418-7410
Instrumenty mikrochirurgiczne
NazwaFirma  Numer katalogowyKomentarze
Małe nożyczki Roboz RS-5610
Duże nożyczkiS& T  Kleszcze SAA-15
- duże kątoweS& T  Kleszcze JFCL-7
- małe kątowe S& TFRAS-15 RM-8
Clip ApplierROBOZRS-5440
Nożyczki - non microFST 14958-1114958-11
Kleszcze - prosta końcówka S& T  FRS-15 RM8TC
Duży klips mikrochirurgicznyFine Scientific Tools18055-01
Mały klips mikrochirurgicznyFine Scientific Tools18055-01
Mały klips mikrochirurgicznyFine Scientific Tools18055-02
Mały klips mikrochirurgicznyFine Scientific Tools18055-03
Inne instrumenty
NazwaCompany  Numer katalogowyUwagi
Małe zaciski na komaryOgólny 
Analiza 
NazwaCompany  Numer katalogowyUwagi
Aminotransferaza alaninowa (ALT) Test BiovisionK752-100
Malondialdehye (MDA) Biblioteka ab118970
Test glutationu (GSH)chemicznej Kajmanów
- Rozszczepiona kaspaza-3 i aktyna Technologia sygnalizacji komórkowej Przeciwciało9661
ImageJ Oprogramowanie Narodowe Instytuty Zdrowia 
Bufor do lizy i ekstrakcji RIPA Milipory10-188
Precyzyjna strzykawka analityczna Unit elektrochirurgiczny Podkładka rozgrzewająca Moduł INS600240 Przeciwciała 7030002

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
  2. Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
  3. Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
  4. OPTN. Overall by Organ. Current US Waiting List. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  5. OPTN. Transplants in the US by Recipient ABO. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  6. Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
  7. Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
  8. Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
  9. Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
  10. Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
  11. Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363(2016).
  12. Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
  13. Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
  14. Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
  15. Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
  16. Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
  17. Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
  18. Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. , 601-607 (2015).
  19. Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. , 3196431(2016).
  20. Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
  21. Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. , (2015).
  22. Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
  23. Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
  24. Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
  25. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20White%20Paper.pdf 1-14 (2012).
  26. Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
  27. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
  28. Carlberg, I., Mannervik, B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490 (1985).
  29. Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwiennekanulacja y y wrotnejbezpo rednie dostarczanie segmentalnepegylowana dysmutaza ponadtlenkowamodel uszkodzenia niedokrwienno reperfuzyjnego w trobybadania nad transplantacj w trobyciep e niedokrwienie i reperfusjaekspresja malondialdehyduanaliza Western blot

Powiązane artykuły