Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

DOI:

10.3791/54738

⸱

26 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Breast Cancer Now Toby Robins Research Centre, Division of Breast Cancer, The Institute of Cancer Research, 2Division of Molecular Pathology, The Institute of Cancer Research, 3Institute of Cancer Sciences, University of Manchester

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja funkcjonalnych zdarzeń powodujących raka jest kluczowa dla pogłębienia naszego zrozumienia biologii nowotworów i niezbędna do odkrycia nowej generacji nowych celów terapeutycznych. Staje się oczywiste, że potrzebne są bardziej złożone modele raka, aby w pełni docenić czynniki napędzające nowotworzenie in vivo i zwiększyć skuteczność nowych terapii, które umożliwiają przejście od modeli przedklinicznych do badań klinicznych.

Tutaj prezentujemy metodologię generowania jednolitych i powtarzalnych sferoid nowotworowych, które mogą być poddane funkcjonalnemu badaniu przesiewowemu siRNA. Te sferoidy wykazują wiele cech, które można znaleźć w guzach litych, które nie występują w tradycyjnej kulturze dwuwymiarowej. Pokazujemy, że kilka powszechnie stosowanych linii komórkowych raka piersi jest podatnych na ten protokół. Ponadto dostarczamy dane potwierdzające zasadność z wykorzystaniem linii komórkowej raka piersi BT474, potwierdzając ich zależność od amplifikacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu HER2 i mutacji kinazy 3-fosfatydyloinozytolo-4,5-bifosforanu (PIK3CA) podczas hodowli jako sferoidy nowotworowe. Wreszcie, jesteśmy w stanie dalej badać i potwierdzać przestrzenny wpływ tych zależności za pomocą immunohistochemii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guzy lite wykazują znaczną niejednorodność histologiczną, genetyczną i mikrośrodowiskową wewnątrz guza, co stanowi dla klinicystów poważne wyzwanie w skutecznym leczeniu pacjentów. Większość modeli wykorzystywanych do identyfikacji nowatorskich terapii celowanych nie obejmuje wielu z tych cech. Rzeczywiście, obecne terapie celowane stosowane w klinice zostały opracowane w ciągu ostatniej dekady przy użyciu podejść przesiewowych, które opierają się na liniach komórek rakowych hodowanych w warunkach dwuwymiarowej (2D) hodowli. Chociaż przyniosło to różne sukcesy, takie jak inhibitory receptorowej kinazy tyrozynowej, staje się oczywiste, że potrzebne są bardziej złożone modele raka, aby w pełni docenić czynniki napędzające nowotworzenie in vivo i zwiększyć liczbę nowych terapii, które przechodzą od modeli przedklinicznych do badań klinicznych. Co więcej, obecnie dobrze uznaje się, że systemy hodowli 2D nie odzwierciedlają zachowania in vivo 1,2. Na przykład w słabo unaczynionych nowotworach, gdy zapotrzebowanie na tlen i składniki odżywcze w mikrośrodowisku przewyższa podaż, rozwijają się regiony wysokich i niskich porodów. Obecność niskiego poziomu tlenu (niedotlenienie) w nowotworach, wykryta przez immunohistochemiczne barwienie skrawków guza dla ustalonych markerów hipoksji, takich jak anhydraza węglanowa IX (CAIX), koreluje z gorszym wynikiem klinicznym w raku piersi 3,4 Zatem włączenie cech takich jak hipoksja do modeli przesiewowych może zwiększyć naszą zdolność do odkrywania nowych celów terapeutycznych, które będą bardziej skuteczne in vivo. Rzeczywiście, skuteczne celowanie w agresywne nowotwory, które zawierają niedotlenienie, jest priorytetem klinicznym 5.

Zmiana tradycyjnego badania przesiewowego siRNA 2D, w celu dokładniejszego podsumowania elementów warunków napotykanych przez komórki nowotworowe w mikrośrodowisku guza, doprowadziła do identyfikacji kilku genów, które okazały się ważne dla wzrostu guza in vivo. Obejmują one funkcjonalne badania przesiewowe genomu wykonywane w warunkach niskiej surowicy6, w warunkach niedotlenienia7 oraz w skojarzeniu8. Na przykład wyciszenie kinazy 6-fosfofrukto-2-kinazy/fruktozy-2,6-bifosfatazy 4 (PFKFB4), białka odpowiedzialnego za regulację węgla wchodzącego do glikolizy, wywołało apoptozę tylko w liniach raka prostaty pochodzących z przerzutów, gdy są hodowane w niskiej surowicy. Wyciszenie PFKFB4 w normalnych liniach komórkowych prostaty w tych samych warunkach nie przyniosło żadnego efektu, podczas gdy wyczerpanie PFKFB4 całkowicie zneutralizowało wzrost ksenoprzeszczepów linii komórkowej raka prostaty 6.

W rozszerzonym panelu linii komórkowych raka piersi, wyciszenie transportera monokarboksylazy 4 (MCT4) preferencyjnie prowadziło do zmniejszenia wzrostu linii komórkowych w warunkach niskiej zawartości tlenu. Podatność ta została potwierdzona in vivo w ortotropowych ksenoprzeszczepach linii komórkowej raka piersi. Być może najbardziej uderzające jest to, że wyciszenie syntetazy acetylo-CoA 2 (ACSS2), enzymu odpowiedzialnego za przekształcanie octanu w acetylo-CoA, zmniejszyło liczbę komórek rakowych w warunkach stresu odżywczego (niski poziom tlenu i surowicy), ale miało niewielki lub żaden wpływ w normalnych warunkach hodowli 8. Ablacja ACSS2 wpłynęła na wzrost ksenoprzeszczepów raka piersi i prostaty, co sugeruje, że gradienty składników odżywczych nie istnieją w izolacji w mikrośrodowisku guza i że komórki znajdujące się w tych regionach są niezbędne do progresji guza 8. Ponadto stwierdzono również, że ACSS2 jest ważny w glejakach i rakach wątrobowokomórkowych 9,10, co sugeruje, że zwiększona aktywność ACSS2 w nowotworach może być podstawowym mechanizmem wspierającym wzrost w niesprzyjających warunkach.

Podsumowując, te badania dowodzą, że podsumowanie warunków napotkanych in vivo i przeprowadzenie badań przesiewowych siRNA pozwala na identyfikację genów niezbędnych do przeżycia raka. Oprócz wpływu na wzrost komórek rakowych 2D w warunkach stresu związanego ze składnikami odżywczymi, wyczerpanie docelowych genów w tych badaniach hamowało wzrost sferoidalnych linii komórek rakowych, odzwierciedlając to, co zaobserwowano w ksenoprzeszczepach nowotworowych 6,8. Tak więc sferoidy linii komórek rakowych zawierają kilka warunków występujących w mikrośrodowisku guza, które nadają wrażliwość na wyciszenie ACSS2. Rzeczywiście, sferoidy wykazują gradienty składników odżywczych (surowica i tlen), zmiany pH, trójwymiarowy (3D) kontakt komórka-komórka, ale także zmiany w szybkości proliferacji z komórkami przechodzącymi zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozę. Przykładem tego jest obecność w sferoidach nowotworowych obszarów martwiczych, cechy niespotykanej w tradycyjnej kulturze 2D.

Sferoidy komórek rakowych były już używane jako bardziej biologicznie istotne modele do badań przesiewowych inhibitorów małych cząsteczek, ale pozwala to tylko na walidację skuteczności związku lub zmianę przeznaczenia związków pierwotnie zaprojektowanych dla innych chorób 11. Obecne metody badań przesiewowych sferoidów nie pozwalają na analizę ubytku określonych genów w sposób wysokoprzepustowy i o wysokiej zawartości. Tutaj po raz pierwszy opisujemy funkcjonalny potok genomiki do odkrywania specyficznych zależności genów przy użyciu technologii małych interferujących RNA (siRNA) w sferoidach linii komórek nowotworowych. Zaprojektowaliśmy specjalną bibliotekę z siRNA ukierunkowanymi na 200 najczęściej mutowanych genów w ludzkim raku piersi i oceniliśmy wpływ wyczerpania genów na rozmiar sferoidów i aktywność metaboliczną w sferoidach raka piersi BT474. Byliśmy w stanie solidnie i powtarzalnie wykryć wpływ wyciszania ERBB2 i PIK3CA w hodowlach 3D. Ponadto mogliśmy ocenić wpływ zubożenia genów na architekturę przestrzenną sferoidów BT474 za pomocą immunohistochemii.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie 96-dołkowych płytek siRNA

UWAGA: Zewnętrzne krawędzie płytki 96-dołkowej są bardziej podatne na parowanie w porównaniu do innych studni, dlatego ogranicz ilość siRNA do 60 na płytkę 96-dołkową. Wypełnij zewnętrzne studzienki zwykłym podłożem lub PBS, aby to ograniczyć. Ponadto zaleca się sprawdzenie poprawności trafień w celu złagodzenia odchyleń płyty.

  1. Rozcieńczyć siRNA do 250 - 500 ng/μl w zredukowanej pożywce surowicy (zgodnie z zaleceniami producenta) i podsycić 10 μl do odpowiednich studzienek płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Wykonaj wszystkie badania przesiewowe w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: Włącz odpowiednie kontrole siRNA nieukierunkowane (negatywne) i zabijające (dodatnie, takie jak UBB i PLK1) w projekcie płytki, aby zapewnić ocenę skuteczności transfekcji. Użycie płytek o niskim przyczepie do pracy siRNA ma kluczowe znaczenie, ponieważ komórki zostaną dodane do mieszaniny transfekcyjnej. Nie możemy wykluczyć, że niektórzy producenci ultra niskie płytki mocujące mogą mieć subtelny wpływ na wzrost sferoidów. W związku z tym zalecamy, aby zostały one przetestowane przez użytkownika końcowego.
  2. Przykryć płyty uszczelkami samoprzylepnymi i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Odwrotna transfekcja linii komórkowej

  1. W dniu sita rozmrozić płytki w temperaturze pokojowej i wirować przez 5 minut przy 1 000 x g za pomocą wirówki stołowej. Dodać 10 μl zredukowanej pożywki surowicy zawierającej odczynnik do zoptymalizowanej transfekcji do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Pozostaw płytki na 15 minut, aby powstały kompleksy transfekcyjne zawierające siRNA.
    UWAGA: W badaniu tym wykorzystano linię komórkową raka piersi BT474 do funkcjonalnych badań przesiewowych genomu (hodowana w DMEM o wysokim poziomie glukozy (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami).
  2. Trypsynizować komórki, które mają być poddane badaniom przesiewowym (0,05% trypsyny i 0,53 mM EDTA) aż do odłączenia od kolby, zneutralizować przy użyciu odpowiedniej objętości pożywki specyficznej dla linii komórkowej i wirować przez 5 minut przy 1,000 x g na wirówce stołowej w celu usunięcia trypsyny. Ponownie zawieś komórki z odpowiednią objętością pożywki i określ dokładny numer komórki za pomocą licznika komórek.
    UWAGA: Zazwyczaj 5,000 komórek na studzienkę wystarcza do powstania sferoidów w większości badanych linii komórkowych. Ważne jest, aby dokładnie policzyć komórki jako zawiesinę pojedynczej komórki w celu dokładnego porównania rozmiarów.
  3. Rozcieńczyć komórki do 5 000 komórek na 180 μl w zimnym podłożu (4 °C).
    UWAGA: Dodanie odtworzonych składników matrycy membrany podstawnej wpłynie negatywnie na wydajność transfekcji i zaleca się, aby nie stosować jej. Optymalizacja linii komórkowych w celu potwierdzenia zdolności tworzenia sferoidów i skuteczności knockdown powinna być przeprowadzona przed badaniem przesiewowym.
  4. Przenieść zawiesinę komórkową do zbiornika, pipetować do mieszania i dodać 180 μl do każdego dołka 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu, zawierającej siRNA przygotowane wcześniej (2.1).
  5. Odwirować płytkę o sile 1 000 x g we wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie powrócić do inkubatora do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C.
  6. UWAGA: Komórki pojawią się jako mozaika na dnie studzienek. W ciągu następnych 12 - 24 godzin komórki połączą się ze sobą, tworząc pojedynczą kulę.
  7. Po 24 godzinach obserwuj, jak komórki tworzą pojedynczą sferoidę w środku studzienki. Dodaj 100 μl kompletnego podłoża do każdej studzienki, aby pobudzić wzrost.
  8. Uzupełnij podłoże po trzech dniach. Delikatnie usuń 100 μl podłoża z każdej studzienki i dodaj 100 μl świeżego podłoża.
  9. W dniu 7 należy określić ilościowo automatyczny rozmiar sferoidy na czytniku płytek, który może ilościowo monitorować wzrost sferoidów w czasie (patrz punkt 3).
  10. Następnie należy określić żywotność komórek za pomocą luminescencyjnego barwnika żywotności komórek (patrz sekcja 4).

3. Automatyczne pozyskiwanie obrazów

  1. Zeskanuj płytki na laboratoryjnym cytometrze do obrazowania na mikrodołku w 7 dniu.
    1. Otwórz oprogramowanie, wybierz następujące opcje: "Płytka 96-dołkowa", wybierz odpowiedni typ płytki i wprowadź nazwę eksperymentu. UWAGA: Wszelkie dodatkowe informacje można również dodać do oprogramowania.
    2. Wybierz aplikację "Tumorsphere". Zmień ostrość tak, aby sferoida była ostra i miała optymalny kontrast.
      UWAGA: Zalecamy "ostrość na podstawie obrazu", ponieważ spodziewane są znaczne różnice w rozmiarach sferoidów.
    3. Wybierz studnie, które wymagają skanowania i "Rozpocznij skanowanie".
    4. Korzystając z oprogramowania skanera płyt, upewnij się, że maska obiektu dokładnie odzwierciedla rozmiar sferoidy. W tym celu należy dostosować średnicę kolonii, dylatację granicy, minimalną grubość i ustawienia precyzji, specyficzne dla każdej badanej linii komórkowej 11,12,
      UWAGA: Obszar sferoidy zostanie następnie obliczony przy użyciu algorytmu oprogramowania. Na przykład, aby dokładnie obliczyć powierzchnię sferoid BT474 hodowanych przez siedem dni, ustaw precyzję na "wysoką" i ustaw minimalną średnicę kolonii na 200 μM. W ten sposób powinna powstać odpowiednia maska sferoidalna reprezentatywna dla obszaru sferoidalnego.
      UWAGA: Dane te można następnie wyeksportować z urządzenia za pomocą funkcji eksportu w postaci pliku danych z adnotacjami. Data to mediana płytki znormalizowana, połączona i przeanalizowana za pomocą wskaźnika z lub ściśle standaryzowanej średniej różnicy (SSMD) w celu zidentyfikowania siRNA, które miały statystycznie istotny wpływ na obszar sferoidalny.

4. Określanie żywotności komórek

  1. Po obliczeniu powierzchni sferoidalnej określić żywotność za pomocą luminescencyjnego barwnika do żywotności komórek. Przygotuj odczynnik zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Ostrożnie usuń 100 μl podłoża z każdej studzienki i dodaj 100 μl barwnika żywotności. Inkubuj płytki przez 15 minut, a następnie skanuj za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych.
    UWAGA: Dane te można następnie wyeksportować z urządzenia za pomocą funkcji eksportu w postaci pliku danych z adnotacjami. Data to znormalizowana mediana płytki, połączona i przeanalizowana za pomocą wskaźnika z lub ściśle standaryzowanej średniej różnicy (SSMD) w celu zidentyfikowania siRNA, które miały statystycznie istotny wpływ na żywotność sferoidalną.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy sferoidalne na 96-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyłączeniu zapewniają wysokoprzepustową ocenę fenotypową potencjalnej onkogenności w kontekście, który łatwiej podsumowuje warunki fizjologiczne występujące w nowotworach in vivo. Rzeczywiście, linie komórek rakowych MCF10DCIS.com i BT474 tworzą ścisłe struktury sferoidalne (ryc. 1A), a badanie immunohistologiczne odcinków sferoidalnych wykazało wyraźne zmiany przestrzenne w morfologii komórkowej i jądrowej. Z biegiem czasu niektóre sferoidy, takie jak sferoidy BT474, rozwijają obszary nekrotyczne, co jest powszechną cechą agresywnych guzów litych (ryc. 1B). Niektóre sferoidy nie rozwijają nekrotycznych rdzeni, takich jak linia komórkowa MDA-MB-231, ale wykazują wyraźną zmienność markera proliferacyjnego Ki67, który odwrotnie koreluje z rozszczepioną ekspresją kapsazy-3, markerem apoptozy (Figura 1C). Aby ustalić, że wiele linii komórkowych jest rzeczywiście podatnych na wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA, komórki BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 i JIMT1 były transfekowane siRNA przez siedem dni. Obecność odczynnika do transfekcji (makiety) lub transfekcji kontrolnych siRNA nie miała wpływu na żywotność sferoidów, podczas gdy wyciszenie niezbędnego genu ubikwityny B (UBB) znacznie zmniejszyło żywotność sferoidów we wszystkich badanych liniach komórkowych (Figura 1D).

Zaprojektowaliśmy ludzką bibliotekę siRNA, która obejmowała najczęściej mutowane geny w nieselekcjonowanych, ER+, HER2+ i potrójnie ujemnych nowotworach piersi. Biblioteka ta składa się z genów o znanej funkcji, takich jak MYC, PIK3CA i TP53 oraz tych, których udział w kancerogenezie nie został ustalony. Ekran zawiera również kilka niedocelowych kontrolnych siRNA (Kontrola #1, Kontrola #2) i siRNA ukierunkowanych na podstawowe geny, takie jak PLK1 i UBB, które działają jako kontrole zabijania (Tabela 1). Zdecydowaliśmy się na użycie linii komórkowych raka piersi BT474, ponieważ łatwo tworzą sferoidy bez dodatku odtworzonej błony podstawnej, są uznanymi liniami komórkowymi konia roboczego i mają znaną architekturę genomową. Na przykład komórki BT474 są dodatnie dla receptora estrogenowego (ER +), wykazują nadekspresję receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2 +) i zawierają mutacje w TP53 (E285K) i PIK3CA (K111N)13.

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, monitorowaliśmy wpływ wyczerpania genów na rozmiar sferoidów i żywotność po siedmiu dniach odwrotnej transfekcji siRNA (Rysunek 1E). Co ciekawe, większość genów nie miała znaczącego wpływu na obszar sferoidalny lub żywotność (Figura 2A). Wyciszenie FOXO3, PIK3CA, ERBB2 i SF3B1 spowodowało najbardziej znaczące powtarzalne zmniejszenie rozmiarów sferoidów. Zmniejszenie tej żywotności sferoidalnej zaobserwowano również po wyciszeniu ERBB2 i SF3B1. Zachęcające jest to, że potwierdziliśmy wpływ wyciszania PIK3CA, ERBB2 i SF3B1 na rozmiar sferoidy za pomocą mikroskopii jasnego pola (Figura 2B). Wcześniej zidentyfikowaliśmy SF3B1 jako niezbędny gen w wielu modelach linii komórkowych, a zatem siSF3B1 stanowi dobrą kontrolę zabijania oprócz UBB 14. Co ciekawe, spośród wszystkich 200 genów tylko wyciszenie E-kadheryny spowodowało znaczny wzrost żywotności sferoidalnej (Figura 2A). Badanie morfologii sferoidów wykazało, że wyciszenie E-kadheryny spowodowało całkowite załamanie architektury sferoidalnej, z żywotnymi komórkami spoczywającymi na dnie dołka o niskim przyczepie (Figura 2B). Ręczne ponowne badanie danych z ekranu objętości sferoidy wykazało, że to również zostało zaobserwowane, ale zostało wyeliminowane z kwantyfikacji obszaru ze względu na to, że obiekt znajdował się powyżej ustalonych ograniczeń rozmiaru. Jak wcześniej podkreślono, komórki BT474 wykazują nadekspresję receptorowej kinazy tyrozynowej HER2 i zawierają mutację onkogenną w PIK3CA (K111N). Potwierdziliśmy, że wyciszenie ERBB2 i PIK3CA spowodowało zmniejszenie żywotności sferoidalnej, podczas gdy transfekcja z kontrolami niedocelowymi nie miała wpływu (Figura 2C).

Następnie zbadaliśmy wpływ wyczerpania siRNA na histologię sferoidalną. Sferoidy BT474 były transfekowane odwrotną transfekcją nieukierunkowanego kontrolnego siRNA i siRNA ukierunkowanego na PIK3CA, ERBB2 i UBB. Wyciszenie ERBB2 i UBB spowodowało zmniejszenie proproliferacyjnego markera Ki67 w porównaniu z kontrolnym siRNA (Figura 2D). Aktywację proapoptotycznego markera rozszczepionej kaspazy-3 zaobserwowano dopiero po wyciszeniu UBB, co sugeruje, że wyczerpanie HER2 i PIK3CA nie powodowało apoptozy, ale było cytostatyczne, a nie cytotoksyczne. Rzeczywiście, wyciszenie HER2 i PIK3CA spowodowało wzrost ekspresji białka białka zatrzymującego cykl komórkowy białka p27 w porównaniu z kontrolnymi transfekowanymi sferoidami.

Podsumowując, wyniki te pokazują, że komórki BT474 są napędzane przez onkogenną sygnalizację HER2 i PIK3CA, gdy są hodowane jako sferoidy 3D. Co ważniejsze, wyniki te pokazują, że możliwe jest zaprojektowanie i wdrożenie dostosowanej do potrzeb biblioteki przesiewowej siRNA setek genów w sferoidach linii komórek nowotworowych w sposób solidny i powtarzalny.

figure-results-1
Rysunek 1: Optymalizacja linii komórkowych pod kątem wzrostu trójwymiarowego. A. Linie komórkowe raka piersi, MCF10DCIS.com i BT474, hodowano na płytkach o niskim przyczepie przez 7 dni. Reprezentatywne obrazy jasnego pola wykonano przy użyciu mikroskopu odwróconego. Podziałka = 100 μm. Sferoidy B. MCF10DCIS.com i BT474 hodowano przez 28 dni. 100 μL świeżej pożywki uzupełniano co 3 - 4 dni. Sferoidy utrwalono w 3,8% formaldehydzie, zatopiono, pocięto i wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E). Reprezentatywne obrazy są wyświetlane w małym i dużym powiększeniu. Podziałka reprezentuje odpowiednio 100 μm i 33 μm. C. Sferoidy MDA-MB-231 hodowano przez 21 dni. 100 μL świeżej pożywki uzupełniano co 3 - 4 dni. Sferoidy utrwalono w 3,8% formaldehydzie, osadzono, pocięto na sekcje i wybarwiono Ki67 i rozszczepioną kaspazą-3. Wyświetlane są reprezentatywne obrazy. Paski skali = 100 μm. Linie komórkowe D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 i JIMT1 zostały odwrócone transfekowane za pomocą makiety (tylko odczynnik do transfekcji), a kontrolne siRNA i UBB, ultra-niskie płytki przyłączeniowe zostały następnie odwirowane, aby utworzyć sferoidy. Świeże podłoże (100 μl) dodano w dniach 1 i 4. Po 7 dniach określono ilościowo żywotność komórek. Dane reprezentują średnią ± SD dwóch niezależnych kontrprób biologicznych wykonanych w trzech powtórzeniach znormalizowanych do kontroli #1. Istotność statystyczną obliczono za pomocą niesparowanego testu t Studentów (p< 0,05). E. Diagram przepływu podsumowujący protokół odwrotnej transfekcji używany do funkcjonalnego badania zależności genów w sferoidach linii komórek nowotworowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Funkcjonalne badanie genomiczne sferoidów BT474 odkrywa zależności onkogenne. Komórki BT474 poddano odwrotnej transfekcji 200-genową ludzką biblioteką siRNA siGENOME w trzech egzemplarzach. Zaobserwowano wielkość i żywotność sferoidów. Wartości surowych danych znormalizowano medianę płytową, a wyniki z obliczono w celu zidentyfikowania istotnych wartości odstających większych niż 1,7 raza odchylenie standardowe mediany tablicowej 15. Zwróć uwagę na odległe geny ERBB2, SF3B1, PLK1 i UBB oraz E-cad. siRNA, które znacznie zwiększyły lub zmniejszyły obszar sferoidalny i żywotność, są zacieniowane na niebiesko i czerwono, gdzie czerwony przedstawia kontrolne siRNA. B. Komórki zostały odwrócono transfekowane kontrolą nieukierunkowaną, E-kadheryną (E-Cad), PIK3CA, ERBB2 lub UBB siRNA, a następnie przędzone w ultra-niskiej płytce przyłączeniowej, tworząc sferoidy. Po 7 dniach wykonano reprezentatywne obrazy sferoidów w jasnym polu za pomocą mikroskopu odwróconego. Paski skali = 100 μm. C. Komórki zostały odwrócono transfekowane kontrolą niecelującą, PIK3CA, ERBB2 lub UBB siRNA, a następnie przędzone na bardzo niskiej płytce przyłączającej, tworząc sferoidy. Po 7 dniach określono ilościowo żywotność komórek. Dane reprezentują średnią ± SD dwóch niezależnych kontrprób biologicznych wykonanych w trzech powtórzeniach znormalizowanych do kontroli #1. Istotność statystyczną obliczono za pomocą niesparowanego testu t Studentów (p < 0,05). D. Po 7 dniach sferoidy zostały utrwalone, osadzone, pocięte i wybarwione na H&E, Ki67, Cleaved Caspase-3 i p27. Wyświetlane są reprezentatywne obrazy. Podziałka = 100 μm. Zwróć uwagę, że H&E sferoid siControl wydają się mniejsze ze względu na artefakt przetwarzania i pojedyncze nienaruszone sferoidy wybrane do barwienia. Nie umniejsza to jednak zmian zaobserwowanych na zeskanowanych obrazach i wynikach żywotności komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

angielska) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: ) powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: : powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
1cyfra arabska3456789101112
Niezwiązane z kierowaniem 1Zobacz materiał TP53Czasu letniegoKMT2C (Język angielski)Nieleczone 1FCGBP (Protokół FCGBP)ARID1B (Biblioteka Języka Arabskiego)FBXM7 (wersjaZobacz materiał TTC40Niekierowanie 2
GATA3Stacja TTNMUC12MUC4AHNAKHUWEI1DNAH11ITPR2 (Biblioteka ITPR2ABCA13CREBBP powiedział:
Protokół MAP2K4PIK3CAF5APOB (Język angielskiANKRD30AMUC17DNAH17LAMA2asZobacz materiał CSMD2
STARD9USH2AFAT3 (System Plików Tłuszczowych)Silnik LPR2Zobacz materiał CSMD3MYO18BDNAH5Płyta MDN1ARHGAP5DNAH9
CXCR3MUC16Zobacz materiał RB1PKHD1L1DNAH2SYNE2DYNC1H1Protokół PCLOCACNA1BBiblioteka ERBB2
Zobacz materiał PLK1SYNE1LYSTPTEN (sieć PTENZobacz materiał SPTA1Nieleczone 2Branża VHLRYR1Zobacz materiał COL6A3UBB
1cyfra arabska3456789101112
Niezwiązane z kierowaniem 1ENAM (Kanał)RYR2Certyfikat BRCA2Nieleczone 1FMN2HECW1BARANEK4SiNiekierowanie 2
FHOD3MACF1RYR3C2ORF16DmdKlasa przemysłowa FRG1HERC2MYH11STAB1Biblioteka ZDBF2
GOLGA6L2NebPistolet maszynowy SMG1CACNA1EDNA14Zatoka Perska GCC2WIRUS HIVEP2Certyfikat NIPBL (NIPBLTANC1Zobacz materiał ZNF536
Złącze HMCN1Klasa NF1Zobacz materiał UBR5CACNA1FDYNC2H1GON4LHYDIN HYDINPKD1L1Federacja FederalnaANK3
Wysoki Stopień Ochrony PrawOBSCN (Sieć NiebezpiecznaUSP34CYMA5FAM208BGPR112Certyfikat ITSN2Zobacz materiał RNF213TprASPM (Protokół ASPM
Zobacz materiał PLK1Zobacz materiał PCDH15XIRP2Zobacz materiał COL7A1Zobacz materiał FLG2Nieleczone 2Branża VHLSAGE1 (Wymiar SAGE1UNC80UBB
1cyfra arabska3456789101112
Niezwiązane z kierowaniem 1Biblioteka DCHS2MUC5B (Jednostka MUC5BZobacz materiał ZFHX4Nieleczone 1MYO9ASPHKAP (Wyspa Cieniowata)CXORF22NCOR1VPS13D
AtrDMXL2MXRA5ANK2KIAA1210ŚLIWKA2TCHH (Tchh)DANH6 powiedziałNOT2 (Nie)ANKRD12
BIRC6DNAH10Sieć TENM1bankomatPrzekaźnik LRP1Zobacz materiał SCN10AVPS13CDNAH7SZWAJCARIAC5ORF42
CDH1DNAH3PEG3 (Układ Kołowy)DYŻUR1Klasa MAP1ASCN2A (Zobacz materiał SCN2A)Protokół IPTR3Zobacz materiał ERBB3Przekaźnik SRRM2CCDC88A
CUBN (SZEŚCIAN)NOCK11RELNDNAH8MED12SHROOM2CEP350 (wersja angielskaFAT4SZT2KANAŁ CHD4
Zobacz materiał PLK1Roczne Horyzonty Czasowe (EYPęcherzykiKIAA1109MED13Nieleczone 2Branża VHLKMT2AVPS13AUBB
1cyfra arabska3456789101112
Bez kierowaniaQSER1ARID1AWDFY3Nieleczone 1Zestaw SDK1TEX15LAMA1Niekierowanie 2
COL14A1SHROOM3ATRX (Silnik ATRX)Sterownik EFCAB5Zobacz materiał SF3B1CBFB (Urząd Skarbowy)AHNAK2
Zobacz materiał CSMD1Zobacz materiał TBX3KIAA0947FOXA1ITPR1 (Dyrektywa w sprawie ITPR1DDX3X (Biblioteka DDX3XKIF4A
MEFV (Kanał Przemysłowy)Zobacz materiał UBR4MYCBP2Protokół INPPL1FLG (Galaktyka KwiatHECTD4FAT2
MGAM (Międzynarodowa Organizacja TVCAN powiedział:Zobacz materiał NBEAL1Protokół MAP3K1AKAP9GPR98FOXO3
Zobacz materiał PLK1Zobacz materiał ZNF462ZESTAW SETXNRP1 (Krajowy Urząd Nadzoru)HERC1Nieleczone 2Branża VHLUBB

Tabela 1: Układ płytek i dekonwolucja biblioteki siRNA dla ludzi. Tabela zawiera zawartość każdej z pul siRNA oraz układ niskich płytek przyłączeniowych używanych w ekranie.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe modele nowotworów są coraz częściej wykorzystywane do oceny skuteczności znanych i nowych związków, które zostały zaprojektowane do selektywnego zabijania komórek nowotworowych. Sferoidy komórek rakowych to struktury, które wykazują warunki bardziej podobne do tych występujących w nowotworach in vivo, dlatego związki, które mają zwiększoną skuteczność w 3D, mają większe szanse na działanie in vivo. Metody te nie pozwalają jednak na identyfikację potencjalnie nowych celów, które nie były przedmiotem projektowania leków, które mogłyby mieć znaczną skuteczność w leczeniu raka.

Opracowaliśmy podejście oparte na genomice funkcjonalnej siRNA, które pozwoliło na trwałe wyciszenie genów przez okres do siedmiu dni w sferoidach linii komórek nowotworowych. Istnieje kilka krytycznych etapów protokołu, które wymagają optymalizacji przed wykonaniem badania przesiewowego siRNA. Niezbędna jest zdolność do tworzenia powtarzalnych, żywotnych sferoid na dużą skalę. Ponadto należy rygorystycznie zoptymalizować odpowiednie warunki transfekcji. Sugerujemy wypróbowanie kilku różnych odczynników do transfekcji z odpowiednimi kontrolami niecelującymi i zabijającymi przed przystąpieniem do badania przesiewowego. Udało nam się wykazać, że kilka powszechnie stosowanych linii komórkowych raka piersi, a mianowicie BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 i JIMT1 było podatnych na transfekcję siRNA. Ponadto dostarczamy dane potwierdzające zasadność badań przesiewowych 200 najczęściej mutowanych genów w raku piersi w sferoidach BT474, potwierdzając ich zależność od amplifikacji HER2 i mutacji onkogennej PIK3CA. Co ciekawe, wyciszenie czynnika transkrypcyjnego FOXO3 spowodowało zmniejszenie rozmiaru sferoidy, ale nie miało znaczącego wpływu na żywotność. Wiadomo, że FOXO3 reguluje odpowiedź na niedotlenienie, zmieniając zdolność metaboliczną komórek rakowych, umożliwiając im łatwiejsze przystosowanie się do środowiska16. Ta rola może potencjalnie zakłócać odczyt żywotności komórek, ponieważ wykrywa obfitość ATP, jednego z głównych produktów metabolizmu komórkowego.

Na poparcie obserwacji zmniejszenia wielkości sferoidów wykazano, że wyciszenie FOXO3 w ksenoprzeszczepach HeLa upośledzało wzrost guza i indukowało apoptozę 17. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre geny mogą wpływać na zdolność komórek rakowych do zachowania architektury 3D, co może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami. Na przykład knockdown E-kadheryny spowodował rozpuszczenie struktury sferoidalnej BT474. Zostało to wcześniej zgłoszone przy użyciu przeciwciał ukierunkowanych na E-Kadherynę 18. Podobnie jak w przypadku każdej platformy przesiewowej, potencjalne cele powinny zostać ponownie poddane badaniom przesiewowym w celu oceny odtwarzalności zaobserwowanego efektu. Technika ta ma swoje ograniczenia, a mianowicie przejściowy charakter knockdownu genu za pośrednictwem siRNA. Trwałe wyciszenie dłuższe niż siedem dni nie było możliwe do osiągnięcia w przypadku siRNA.

Zaletą tego podejścia jest to, że można je łączyć z różnymi innymi barwnikami biometrycznymi, nie tylko tymi, które oceniają żywotność sferoidów, na przykład dostarczając informacji przestrzennych o hipoksji sferoidalnej lub monitorując komórki poddawane apoptozie. Co więcej, ponieważ skany za pomocą czytnika płytek są stosunkowo szybkie i nieinwazyjne, wpływ siRNA na rozmiar sferoidów można ocenić w czasie, a nie tylko w eksperymentalnym punkcie końcowym. Rzeczywiście, obecnie badamy kilka z tych możliwości w ramach naszych badań przesiewowych. Alternatywnym podejściem, które wykorzystuje kultury 3D do identyfikacji nowych zależności, jest wykorzystanie bibliotek chemicznych, które hamują albo szeroki zakres celów, albo określone rodziny białek. Rzeczywiście, Bitler i wsp. wykorzystano to ukierunkowane podejście do zidentyfikowania interakcji syntetycznej letalności między statusem ARID1A a inhibitorami EZH2 w rakach jasnokomórkowych jajnika 19. Odkrycie technologii edycji genów CRISPR-Cas9 pozwoliło również na opracowanie genetycznych badań przesiewowych w hodowlach organoidów i in vivo. Podejście to jest jednak uzależnione od posiadania odpowiednich pomieszczeń dla zwierząt i może być zbyt kosztowne 20.

Podsumowując, uważamy, że nakreśliliśmy protokół, który dokładniej modeluje gradienty tlenu i składników odżywczych, które są cechami mikrośrodowiska guza in vivo, umożliwiając identyfikację nowych celów nowotworowych lub solidną walidację ustalonych celów. Co więcej, nasz protokół może być stosowany do każdego rodzaju linii komórkowej, która tworzy sferoidy, a zatem może być rutynowo stosowany w społeczności badawczej zajmującej się rakiem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opłaty za otwarty dostęp zostały wsparte przez Nexcelom Bioscience, LLC.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Fredrikowi Walbergowi (FACS i ośrodek obrazowania, ICR) za pomoc w mikroskopii. Ta praca została sfinansowana przez Breast Cancer Now. RN jest laureatką stypendium Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LullabyOz Nauki biologiczneLL70500 Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów
ViromerLipocalyxVB-01LB-01wirusopodobny odczynnik do transfekcji polimerów
Ultra-niska płytka mocującaPłytka 96-dołkowa CorningCLS700796-dołkowa
Uszczelki płytek foliowychThermoFisherAB-0626
Barwnik żywotności komórek luminescencyjnychPromegaG7570CellTitre-Glo
(200 μ L)StarlabS1111-0806
Końcówki do pipet (10 μ L)KońcówkiS1111-3800
(1 000 μ L)PipetyS1122-1830
(5 ml)Sarstedt86.1253.025
Pipety serologiczne (10 ml)Sarstedt86.1254.025
Pipety serologiczne (25 ml)Sarstedt86.1685.020
RPMI MediaGIBCO11875-093
DMEM MediaGIBCO11965-084
Opti-MEMGIBCO31985070
Feta surowica bydlęcaGIBCO16140063
siRNADharmaconBiblioteka Cherry picked
Countess Licznik komórekThermoFisher ScientificAMQAX1000
Szkiełka z komorą zliczania komórekThermoFisher ScientificC10312
Celigo SNexcelomfirma
Victor X5Perkin Elmerfirma kontaktowa
Wirówka stołowaRóżne
Axisovert Odwrócony mikroskop jasnego polafirmakontaktowa Hodowla
tkankowa CO2; InkubatorRóżne
Pipety wielokanałoweRóżne
Końcówki do pipet do pipet Starlab serologiczne Starlab Pipety serologiczne kontaktowa Zeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
  4. Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
  5. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
  6. Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
  7. Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
  8. Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
  9. Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
  10. Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
  11. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686(2015).
  12. Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
  13. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  14. Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
  15. Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
  16. Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
  17. Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
  18. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  19. Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
  20. Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cancer Cell SpheroidssiRNA Functional ScreeningTumor Spheroid CultureEpidermal Growth Factor ReceptorPhosphatidylinositol 45 biphosphate 3 kinaseImmunohistochemistry AnalysisBreast Cancer Cell LinesThree Dimensional CultureGene Silencing ImpactPlate Reader Quantification

Powiązane artykuły