Artykuł metodologiczny

Obrazowanie zmiany kształtu komórki i ruchu komórek w gastrulacji Drosophila przy użyciu transgenicznych much reporterowych DE-kadheryny

DOI:

10.3791/54764

⸱

29 grudnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Biotechnology and Genetic Engineering Department, Jahangirnagar University, 2JT Biohistory Research Hall, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 5Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy procedurę przechwytywania na żywo obrazów gastrulacji Drosophila. Umożliwiło nam to lepsze zrozumienie zwężenia wierzchołkowego związanego z wczesnym rozwojem i dalszą analizę mechanizmów rządzących ruchami komórek podczas modyfikacji struktury tkanki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrulacja to pierwszy zestaw morfologicznie dynamicznych zdarzeń, które występują podczas embrionalnego rozwoju zwierząt wielokomórkowych, takich jak Drosophila. Ta zmiana morfologiczna jest również rozpoznawana jako przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT). Rozregulowanie EMT wiąże się ze zwłóknieniem i przerzutami raka. Pojawiają się dowody na to, że EMT jest kontrolowany przez szereg mechanizmów molekularnych. W związku z tym wiadomo również, że wiele kluczowych genów kontrolujących zwężenie wierzchołkowe jest ważnymi czynnikami EMT obserwowanym w przerzutach raka. Podobnie jak EMT podczas gastrulacji Drosophila, komórki nabłonkowe mogą zostać nakłonione do zmiany kształtu i przeprogramowania w celu przekierowania losu komórki w kierunku różnych innych typów komórek. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę obrazowania gastrulacji Drosophila w celu zbadania inicjacji morfogenetycznych ruchów komórkowych i identyfikacji losu komórki na tym etapie rozwoju embrionalnego. Za pomocą tej metody identyfikujemy przegrupowanie komórek w czasie gastrulacji i pokazujemy znaczenie zwężenia wierzchołkowego podczas gastrulacji za pomocą GFP znakowanej DE-kadheryną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrulacja to pierwszy zestaw morfologicznie dynamicznych zdarzeń, które występują podczas rozwoju embrionalnego zwierząt wielokomórkowych, takich jak Drosophila1,2. Co ciekawe, pojawiające się dowody sugerują, że proces ten jest regulowany przez wzajemne oddziaływanie między mechanizmami mechanicznymi i molekularnymi3. Co więcej, przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), które jest kluczowym procesem w gastrulacji, jest również zaangażowane w procesy chorobowe u ludzi, takie jak przerzuty raka4-8. W związku z tym wiadomo również, że wiele genów kontrolujących zwężenie wierzchołkowe jest kluczowymi czynnikami EMT obserwowanym w przerzutach raka9. Tak więc zwężenie wierzchołkowe w czasie gastrulacji jest doskonałym modelem do badania wyżej wymienionych mechanizmów regulacyjnych i poszerzenia naszej wiedzy na temat przerzutów nowotworowych. Zaletą tej techniki jest to, że możemy obserwować ruch komórek w czasie gastrulacji w czasie rzeczywistym, a zatem będziemy w stanie przebadać geny zaangażowane w gastrulację, a także przerzuty raka.

Chociaż stosunkowo mało znana, uważa się, że adhezja między komórkami odgrywa kluczową rolę w zwężeniu wierzchołkowym1. Genetyka Drosophila doskonale nadaje się do badań na poziomie pojedynczej komórki, badając regulacyjne mechanizmy molekularne. Model ten pozwoli nam odkryć znaczenie zwężenia wierzchołkowego podczas gastrulacji. Co więcej, metoda ta może być stosowana do badań przesiewowych genów zaangażowanych w przerzuty raka. Uchwycenie na żywo obrazów gastrulacji Drosophila umożliwiło nam dalsze bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów molekularnych rządzących rearanżacją tkanek. W tym miejscu przedstawiamy obszerny opis prostej metody, aby to osiągnąć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Transgeniczne muchy użyte w tym badaniu obejmują: DE-cad::GFP 10.

1. Przygotowanie talerza z jabłkami

  1. Przygotuj mieszaninę 12,5 g agaru, 125 ml 100% dostępnego w handlu soku jabłkowego, 12,5 g glukozy i 375 mlH2O. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej i wlej ją do 3-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych. Przechowywać mieszaninę w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
  2. Po przygotowaniu talerza z jabłkami dodaj na niego cienką warstwę ugniatanej pasty drożdżowej, aby muchy mogły złożyć jaja.

2. Protokół przygotowania zarodków i obrazowania na żywo

  1. Umieść około 50 much (25 samców i 25 samic) w butelce, aby się kojarzyły, a następnie złóż jaja przez noc na talerzu jabłek pokrytym ugniatanymi drożdżami. Ustaw talerz z sokiem jabłkowym u wylotu butelki. Trzymaj butelkę do góry dnem w inkubatorze. Owiń plastikowe butelki bulionowe Drosophila folią aluminiową, aby skłonić muchy do złożenia większej liczby jaj.
  2. Następnego ranka wymień stary talerz na sok jabłkowy na nowy.
  3. Pozwól muchom złożyć jaja przez 3 do 4 godzin, owijając butelkę folią aluminiową.
  4. Trzy do czterech godzin później zbierz zarodki w sitku do zarodków z talerza z sokiem jabłkowym za pomocą pędzla lub bawełny i umyj je PBS. Umyj zarodki jeszcze 2 do 3 razy za pomocą PBS w 12-dołkowych naczyniach hodowlanych.
  5. Dechorionację zarodków za pomocą 50% wybielacza przez 5 minut w 12-dołkowych naczyniach hodowlanych.
  6. Po procesie dechorionacji należy umyć zarodki jeszcze 2 do 3 razy za pomocą PBS.
  7. Przenieść zarodki do 3-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej PBS i wybrać zarodki w stadium 5 pod mikroskopem w oparciu o poziom przezroczystości na ich granicach. Odpipetować zarodki w stadium za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  8. Następnie umieść dwa wybrane zarodki na szklanym szkiełku nakrywkowym i usuń nadmiar PBS za pomocą drobno skręconej bibuły. Ułóż zarodki grzbietową stroną do góry na szkiełku nakrywkowym za pomocą drobno skręconej bibuły. Następnie przymocuj zarodki do szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą smaru silikonowego za pomocą cienkiej igły i skręconej bibuły.
  9. Nałóż niewielką kroplę oleju halocarbon 700 na zarodki i umieść szkiełko nakrywkowe zawierające zarodki do góry nogami na wgłębionym szkiełku, pozostawiając trochę miejsca na dole szkiełka.
  10. Zbadaj zarodki za pomocą systemu obrazowania konfokalnego, lasera Argon/488 i obiektywu zanurzonego w oleju (63X).
    UWAGA: Identyfikacja zarodka na odpowiednim etapie rozwoju jest ważna dla uchwycenia obrazów zdarzenia gastrulacji. W tych warunkach obserwuj, że prawie wszystkie zarodki rozwijają się normalnie do co najmniej stadium 14. Analizowany zarodek może być dalej hodowany, aby rozwinąć się jako osoba dorosła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym materiale przedstawiamy przebieg gastrulacji zarodka Drosophila oraz ogólny opis procedury przygotowania zarodka (Rysunek 1). Membrany komórkowe są znakowane za pomocą DE-cadherin::GFP, a obrazowanie na żywo ruchów komórek przeprowadza się w czasie gastrulacji w Muszka owocówka (Rycina 2). Ponieważ muchy z GFP-em DE-kadheryny pozwalają na wizualizację złączy przylegających komórek, jesteśmy w stanie śledzić kształt i ruchy komórek w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż wcześniej informowaliśmy o podobnej procedurze przechwytywania na żywo obrazów procesu gastrulacji w Drosophilla1, metoda, którą tutaj opisujemy, jest szczegółowa i łatwa do śledzenia endogennej ekspresji kadheryny, a zatem jest bardzo przydatna do genetycznych badań przesiewowych kluczowych czynników zaangażowanych w gastrulację. Aby zmaksymalizować sukces tej procedury obrazowania, konieczne jest użycie szkiełka z wgłębieniami. Ucisk mechaniczny czasami powoduje śmierć zarodka. Dlatego ważne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), Takeda Science Foundation (HT) oraz MEXT-Supported Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (HT).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Olej halowęglowy 700SigmaMKBH 5726
Smar próżniowy SilikonBeckman335148
Szkiełko nakrywkowe Szkło MatsunamiGrubość No124 - 36 mm
Stariner zarodkówCorningCorning3477
Plastikowe butelki magazynowe DrosophillaHitecMKC-100
DE-Cadherin knock-in muchyREF (10)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Konstrykcja apikalnaobrazowanie konfokalneobrazowanie time lapseprzej cie epitelialno mezenchymalnerozw j embrionalnyznakowanie GFP

Powiązane artykuły