Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54849

⸱

1 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Streszczenie

Obecnie możliwe jest konstruowanie rekombinowanych form różnych wirusów, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności 1 (HIV-1) i wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), które przenoszą w swoich genomach obce geny, takie jak białko reporterowe lub markerowe. Te rekombinowane wirusy zwykle wiernie naśladują cykl życiowy oryginalnego wirusa w zakażonych komórkach i wykazują tę samą zależność od zakresu gospodarza. Opracowanie rekombinowanego wirusa umożliwia skuteczne badania przesiewowe inhibitorów i identyfikację określonych czynników gospodarza. Jednak do tej pory budowa rekombinowanego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) była trudna ze względu na różne ograniczenia eksperymentalne. Głównym ograniczeniem jest kompaktowy rozmiar genomu HBV i dość ścisły rozmiar genomu, który nie przekracza 1,3 rozmiaru genomu, który musi być upakowany w wiriony. W związku z tym rozmiar obcego genu, który ma zostać wstawiony, powinien być mniejszy niż 0,4 kb, jeśli nie ma być wykonana delecja DNA genomu. Dlatego, aby przezwyciężyć to ograniczenie wielkości, wymagana jest delecja części DNA HBV. W tym miejscu przedstawiamy konstrukcję rekombinowanego genu reporterowego kodującego HBV w celu monitorowania wczesnego etapu cyklu replikacji HBV poprzez zastąpienie części regionu kodującego rdzeń HBV genem reporterowym poprzez usunięcie części regionu kodującego HBV pol. Wykrywanie rekombinowanego zakażenia HBV, monitorowane za pomocą aktywności reporterowej, było bardzo czułe i tańsze niż wykrywanie przy użyciu obecnie dostępnych konwencjonalnych metod oceny zakażenia HBV. System ten będzie przydatny w wielu zastosowaniach, w tym w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji inhibitorów anty-HBV, czynników gospodarza i komórek podatnych na wirusy.

Wprowadzenie

Przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest głównym czynnikiem ryzyka przewlekłych chorób wątroby1. Chociaż obecne strategie terapeutyczne opierają się na analogach nukleotydów, które hamują funkcję pola HBV i/lub podawaniu interferonu typu I, który aktywuje odpowiedź immunologiczną u osób zakażonych, a także pośrednio hamuje proliferację HBV poprzez funkcje genów stymulowane interferonem2, terapie te nie mogą całkowicie wyeliminować DNA HBV3. Co więcej, niepokojące jest pojawienie się wirusów HBV, które są odporne na czynniki anty-pol4. Wykazano, że podawanie złożonych leków przeciwwirusowych bezpośrednio ukierunkowanych na różne etapy cyklu życiowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) lub wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) skutecznie hamuje lub eliminuje wirusa. Podobnie jak w przypadku tego pomysłu, opracowanie leków anty-HBV, które działają bezpośrednio na różne etapy cyklu życiowego HBV, jest ważne dla opracowania przyszłych terapii HBV.

Ogólnie rzecz biorąc, stworzenie prostego systemu hodowli in vitro docelowego wirusa ułatwia rozwój środków antywirusowych. Istnieją jednak co najmniej dwie bariery utrudniające rozwój systemów hodowli in vitro do badań przesiewowych przeciwko HBV. Pierwszym z nich jest brak wygodnego systemu hodowli komórkowych in vitro do celów zakażenia/proliferacji HBV. W przeciwieństwie do innych wirusów, takich jak HIV i HCV, które rozmnażają się w ustalonych liniach komórkowych, hodowla HBV in vitro jest trudna ze względu na ograniczenia eksperymentalne, w tym wąski zakres gospodarza. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano zastosowanie specyficznych systemów hodowli komórkowych, takich jak ludzka linia komórkowa wątrobiaka HepaRG, która jest podatna na zakażenie HBV,5,6,7. Co więcej, wykazano, że komórki PXB, wyizolowane z transgenicznego/SCID aktywatora plazminogenu typu urokinazy, zaszczepionych pierwotnym ludzkim hepatocytem (PHH), są podatne na zakażenie i replikację HBV8. Jednak poziomy replikacji HBV w HepaRG zależą od stanu różnicowania komórkowego po hodowli, co może powodować niespójne i niepowtarzalne wyniki poziomów zakażenia/replikacji HBV. PXB jest powszechnie stosowany w eksperymentach z infekcjami HBV, ale jego dostępność jest ograniczona. Linia komórkowa o ekspresji HBV indukowana tetracykliną, HepAD38, jest również szeroko stosowana do badania replikacji HBV, ale system ten pozwala na ocenę tylko po transkrypcji, a nie na etapie wejścia zakażenia HBV9. Niedawne zidentyfikowanie polipeptydu kotransportującego taurocholan sodu (NTCP) jako funkcjonalnego receptora dla HBV pozwoliło na opracowanie zmiennego systemu hodowli HBV10. Rzeczywiście, ekspresja NTCP w niewrażliwych komórkach raka wątroby, takich jak Huh7 i HepG2, umożliwia zakażenie HBV10, a tym samym wybór linii komórkowych podatnych na HBV został rozszerzony, rozwiązując wiele ograniczeń eksperymentalnych. Drugim problemem jest brak prostego systemu testowego do oceny zakażenia i replikacji HBV. Ocenę zakażenia HBV przeprowadza się zwykle poprzez analizę HBV DNA, RNA i białek. Jednak kwantyfikacja tych markerów wirusa jest czasochłonna, często kosztowna i nie zawsze prosta. W związku z tym opracowanie prostego systemu testów, takiego jak wykorzystanie genu reporterowego, może przezwyciężyć problemy związane z systemami oznaczania HBV.

Jednakże, ponieważ rozmiar genomu, który można umieścić w kapsydzie HBV, jest ograniczony — mniej niż 3,7 kb11 — rozmiar genu reporterowego powinien być jak najmniejszy. Co więcej, obecność wielu elementów cis rozsianych po całym genomie, które są niezbędne do replikacji wirusa, ogranicza dostępne pozycje do wprowadzenia genu reporterowego do genomu. W kilku raportach podjęto próbę wprowadzenia obcych genów, w tym HIV-1 Tat, białka zielonej fluorescencji i DsRed, do genomu HBV11,12,13. Jednak te rekombinowane HBV nie są przydatne do badań przesiewowych zakażenia/replikacji HBV ani do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników wpływających na zakażenie/replikację HBV. Wynika to głównie z niskiej produktywności rekombinowanych wirusów i zmniejszonej intensywności ekspresji genów reporterowych spowodowanej nieefektywną produkcją wirusa.

Aby przezwyciężyć te problemy, skonstruowaliśmy reporter HBV o wysokiej wydajności produkcji wirusa. Wirus ten jest bardzo czuły w monitorowaniu wczesnych etapów cyklu replikacji HBV, od wejścia do transkrypcji. Aby to osiągnąć, NanoLuc (NL) został wybrany jako gen markerowy, ponieważ jest to mały (171 aminokwasów) luminescencyjny reporter14. Co więcej, NL jest około 150 razy jaśniejsza niż świetlik lub lucyferaza Renilla, a reakcja luminescencyjna jest niezależna od ATP, co sugeruje, że wskaźnik fałszywych trafień będzie niski w przypadku badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Wydajność produkcji rekombinowanego wirusa HBV wynosi około 1/5 macierzystego wirusa HBV i jest podobna do poziomów zgłaszanych dla poprzednich wirusów rekombinowanych HBV; jednak jasność NL przezwycięża problemy z produktywnością wirusa, dzięki czemu może być wykorzystana do masowych badań przesiewowych czynników anty-HBV.

Badania przesiewowe czynników anty-HBV przy użyciu hepatocytów pierwotnych, HepaRG, HepAD38 i hepatocytów transdukowanych NTCP mogą być przydatne do badań przesiewowych czynników anty-HBV konwencjonalnymi metodami. Jednak opisany tutaj system ma różne zalety, takie jak prosta obsługa, wysoka czułość i niski koszt badań przesiewowych. Zalety te są odpowiednie dla testów wysokoprzepustowych w celu opracowania i identyfikacji nowych czynników HBV do celów terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja rekombinowanego HBV kodującego białko reporterowe

  1. Przygotowanie komórek HepG2
    1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 100 U/ml aminokwasów endogennych).
    2. Płytka 4 x 106 komórek HepG2 w 10-centymetrowym naczyniu pokrytym kolagenem w 10 ml pożywki hodowlanej dzień przed transfekcją. Inkubować komórki HepG2 w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
      UWAGA: Gdy około 4 x 106 komórek HepG2 zostanie posianych w 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem w 10 ml pożywki hodowlanej, następnego dnia będą one zlewać się w 70-90%.
  2. Transfekcja
    1. Transfekcja komórek HepG2 z 5 μg pUC1.2HBV delta epsilon15 i 5 μg pUC1.2HBV/NL15 przy użyciu odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 10 ml świeżej pożywki hodowlanej.
    3. Tydzień po transfekcji przenieść pożywkę hodowlaną zawierającą rekombinowany wirus HBV do probówki o pojemności 50 ml i przejść do etapu 1.3.1. Dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej do płytki zawierającej transfekowane komórki.
      UWAGA: Produkcja rekombinowanego wirusa HBV utrzymuje się przez 4 tygodnie. Pożywka zawierająca rekombinowany wirus HBV może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
  3. Oczyszczanie rekombinowanego wirusa HBV
    1. Usunąć resztki komórek z pożywki zawierającej rekombinowany wirus HBV przez odwirowanie (2 300 x g przez 5 minut).
    2. Przepuścić supernatant przez filtr membranowy 0,45 μm.
    3. Dodać równą objętość 26% PEG/1,5 M NaCl (glikol polietylenowy 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 i 5 ml 1 M HEPES pH 7,6 w 500 ml) do pożywki zawierającej rekombinowany HBV i delikatnie wymieszać. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Wirować przy 2 300 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie w stężeniu 2.300 x g przez 5 minut.
    7. Załadować 0,5 ml TNE zawierającego rekombinowany HBV na 0,8 ml 20% sacharozy w TNE.
    8. Wirować przy 100 000 × g przez 3 godziny w temperaturze 15 °C.
    9. Wyrzuć jak najwięcej supernatantu i zachowaj osad. Zawiesić go ponownie w 1 ml wolnego DMEM w surowicy na 40 ml wyjściowej pożywki hodowlanej.
    10. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    11. Przefiltruj przez filtr 0,45 μm. Przygotować 0,5 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W przypadku zaobserwowania zanieczyszczenia białkom reporterowym oryginalnej próbki wirusa, należy oczyścić wirusa przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości 5-30% sacharozy w TNE przy 100 000 x g przez 2 godziny lub wirowanie w równowadze gęstości CsCl od 1,1-1,6 g / ml przy 150 000 x g przez 50 godzin.

2. Zakażenie rekombinowanym HBV

  1. Hodowla komórek HepG2 stabilnie eksprymujących NTCP (HepG2/NTCP)15, które są podatne na zakażenie HBV w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 250 μg/ml G-418 i 100 U/ml aminokwasów endogennych w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 .
  2. Na dzień przed zakażeniem umieść około 5 x 104 komórek HepG2/NTCP14 na 96-dołkowej płytce pokrytej kolagenem w 0,1 ml pożywki hodowlanej.
  3. Rozmrażać rekombinowany wirus HBV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż w fiolce pozostanie niewielka ilość lodu.
  4. Przygotować pożywkę do zakażenia, łącząc następujące elementy: 10 μl 40% PEG8000 w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 2 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), 10 μl rekombinowanego HBV i 78 μl świeżej pożywki hodowlanej na basenik 96-dołkowej płytki.
  5. Dodać 100 μl rekombinowanego roztworu HBV do jednego dołka z 96-dołkowej płytki.
  6. Jednego dnia po zakażeniu przemyj zakażone komórki 3 razy 300 μl PBS na studzienkę, aby usunąć zanieczyszczające białko reporterowe z frakcji wirusa.
  7. Inkubować zakażone komórki w 200 μl pożywki hodowlanej zawierającej 2% DMSO przez jeden tydzień lub krócej.

3. Analiza

  1. Tydzień po zakażeniu przemyj zainfekowane komórki 3 razy PBS.
  2. Dodać 50 μl buforu do lizy do zakażonych komórek.
  3. Kołysz płytkę hodowlaną przez 5 minut, a następnie odwiruj przy 2 000 x g przez 5 minut.
  4. Dodać 50 μl substratu reporterowego do płytki luminometru.
  5. Dodać 20 μl lizatu komórkowego do płytki luminometru zawierającej substrat reporterowy. Wymieszaj, krótko wirując.
  6. Umieść płytkę w luminometrze i rozpocznij czytanie15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat genomu HBV, transkrybowanych RNA, białek wirusa oraz ich regionów kodujących w genomie. Wskazano również gen reporterowy oraz jego lokalizację w genomie. Rysunek 2 przedstawia plazmid reporterowy HBV oraz plazmid pomocniczy zawierający gen reporterowy. Plazmid reporterowy pUC1.2HBV/NL skonstruowano poprzez usunięcie nukleotydów w pozycjach 223-811 z miejsca inicjacji transkrypcji preCore mRNA w pUC1.2HBV16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Genom HBV ma cztery podstawowe otwarte ramki odczytu (ORF), w tym rdzeń, polimerazę, powierzchnię i X ORF (ryc. 1). Transkrypcja tych czterech ORF HBV jest ściśle regulowana przez cztery promotory: promotor precore/core zawierający wzmacniacz II, promotor S1, promotor S2 i promotor X zawierający wzmacniacz I18. MRNA o wielkości 3,5 kb i 3,4 kb są tłumaczone odpowiednio na białka PreCore i Core. Białko dużej obwiedni (L) jest wytwarzane z największego subgenomowego mRNA (2,5 kb), a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Program Badawczy nad Zapaleniem Wątroby z Japońskiej Agencji Badań Medycznych i Rozwoju (AMED) oraz przez Granty na Badania Naukowe z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Test lucyferazy Nano-Glo RegentPromegaN1110
Roztwór mieszany penicyliny i streptomycynyNacalai tesque09367-34 
MEM Roztwór aminokwasów endogennychThermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I Medium o zredukowanej surowicyThermo Fisher Scientific31985070
100 mm/naczynie pokryte kolagenemIwaki4020-010
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher ScientificL3000001 
Glikol polietylenowy (PEG) 6000 Sigma-Aldrich81255
Glikol polietylenowy (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0,5 mol/L Roztwór EDTANacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0,45 μ m, polietyleneterosulfon, filtrMerck MilliporeSLHP033RS
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Powlekana kolagenem 96-dołkowa płytkaCorningNO3585
Pasywna liza 5x BuforPromegaE1941
GloMax 96 Luminometr mikropłytkowyPromegaE6501
SacharozaNacalai tesque30403-55
Płytka luminometruGreiner bio-one655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--Odniesienie 15
pUC1.2HBV delta epsilon--Odniesienie 15
/NL--Odniesienie 15
Probówka 50 mlViolamo1-3500-02
Anti-Myc przeciwciałoSigma-AldrichC3956
HBIGJapan Blood ProductsOrganization-IFN
-βMochida Pharmaceutical14987224005413
HeparynaSigma-AldrichH3393
pUC1.2HBV

Bibliografia

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306(2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Konstrukcja rekombinowanego HBVmonitorowanie cyklu replikacyjnego HBVprzesiewanie czynników przeciw-HBVinfekcja komórek HepG2 NTCPmetoda wytrącania PEGwirowanie w gradiencie sacharozydetekcja genu reporterowegoidentyfikacja inhibitorów HBVanaliza czynników gospodarza
Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.