Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54944

⸱

30 listopada 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Streszczenie

Wykorzystanie modeli przedklinicznych do badania biologii nowotworów i odpowiedzi na leczenie jest kluczowe dla badań nad rakiem. Istniejące od dawna ludzkie linie komórkowe i wiele transgenicznych modeli myszy często nie są w stanie podsumować kluczowych aspektów nowotworów złośliwych u ludzi. W związku z tym opracowywane są alternatywne modele, które lepiej reprezentują heterogeniczność guzów pacjentów i ich przerzutów. Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX), w których chirurgicznie wycięte próbki guza są wszczepiane myszom z obniżoną odpornością, stały się atrakcyjną alternatywą, ponieważ mogą być przeszczepiane przez wiele pokoleń i skuteczniej odzwierciedlają heterogeniczność guza niż ksenoprzeszczepy pochodzące z ludzkich linii komórkowych raka. Ograniczeniem w stosowaniu PDX jest to, że są one trudne do transfekcji lub transdukcji w celu wprowadzenia identyfikowalnych reporterów lub manipulowania ekspresją genów. Obecny protokół opisuje metody transdukcji zdysocjowanych komórek nowotworowych z PDX o wysokiej wydajności transdukcji oraz zastosowanie znakowanych PDX do eksperymentalnych modeli przerzutów raka piersi. Protokół demonstruje również zastosowanie znakowanych PDX w eksperymentalnych modelach przerzutów do badania procesu kolonizacji narządów kaskady przerzutowej. Przerzuty do różnych narządów można łatwo zwizualizować i określić ilościowo za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u żywych zwierząt lub ekspresji GFP podczas sekcji i w wyciętych narządach. Metody te stanowią potężne narzędzie do rozszerzenia zastosowania wielu typów PDX do badań nad przerzutami.

Wprowadzenie

Rozwój ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów (PDX), gdzie chirurgicznie wycięte próbki guza są bezpośrednio wszczepiane do myszy z obniżoną odpornością, oferuje kilka zalet w porównaniu ze standardowymi modelami ksenoprzeszczepów linii komórkowych i stanowi duży postęp w badaniach nad rakiem1,2. PDX mogą być utrzymywane i rozwijane przez kolejne pasaże przy minimalnej zmianie cech genetycznych i biologicznych guza wyhodowanego przy pierwszym pasażu; i dokładniej odzwierciedlają niejednorodność guza niż ksenoprzeszczepy pochodzące z ludzkich linii komórek nowotworowych3-8. Modele te są obecnie szeroko stosowane jako platforma do personalizacji terapii nowotworów9,10, jako platforma przedkliniczna w opracowywaniu leków6,11 oraz jako narzędzie eksperymentalne do badania biologii nowotworów4,12.

Większość PDX jest wszczepiana i rozmnażana podskórnie, co umożliwia pomiar wzrostu guza w czasie za pomocą suwmiarki. Jednak choroba z przerzutami była trudniejsza do modelowania przy użyciu PDX. W szczególności w przypadku raka piersi opisano ksenoprzeszczepy ze zdolnością przerzutową do różnych narządów3,5,13, ale częstość spontanicznego rozsiewu do miejsc przerzutów jest niezwykle niska. Tam, gdzie podano, identyfikacja i kwantyfikacja obciążenia przerzutami opiera się na pracochłonnym badaniu histologicznym narządów docelowych po sekcji zwłok. Linie komórek nowotworowych wykazujące ekspresję genów bioluminescencyjnych (lucyferaza, Luc) lub fluorescencyjnych (zielone białko fluorescencyjne, GFP) są powszechnie stosowane w eksperymentalnych modelach przerzutów raka piersi do mózgu, płuc, kości i wątroby po wstrzyknięciu dosercowym, żylnym ogonowym, udowym i śledziony14-16. Chociaż modele te omijają rozprzestrzenianie się z guzów pierwotnych, są cenne dla badania mechanizmów tropizmu narządów i kolonizacji przerzutów. Jednak komórki pochodzące z pierwotnych guzów pacjenta i PDX mogą mieć niskie wskaźniki transfekcji lub transdukcji przy użyciu standardowych procedur. Jedną z alternatyw jest ustanowienie linii komórkowych pochodzących z PDX in vitro17, które można następnie znakować przy użyciu konwencjonalnych protokołów hodowli tkankowych. Takie podejście nie jest jednak odpowiednie do znakowania większości PDX, dla których wyprowadzenie linii komórkowej jest trudne i może zmienić fenotyp komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół transdukcji komórek nowotworowych zdysocjowanych PDX za pomocą wektorów lentiwirusowych odpowiednich do obrazowania in vivo. Ponadto opisujemy eksperymentalne przerzuty za pomocą wstrzyknięcia dosercowego zdysocjowanych komórek PDX znakowanych luc-GFP u myszy z obniżoną odpornością.

Podstawowy protokół transdukcji organoidów zdysocjowanych PDX z ekspresją genu wykazującego ekspresję lentiwirusa został wcześniej opisany 18. W obecnym protokole opisujemy dodatkowe metody wzbogacania ludzkich komórek nowotworowych i uzyskania niemal 100% skuteczności transdukcji, a także zastosowanie znakowanych PDX do wykrywania eksperymentalnych przerzutów raka piersi. Protokół ten można dostosować do znakowania wielu typów nowotworów PDX za pomocą różnych markerów luminescencyjnych i fluorescencyjnych, a także modulacji ekspresji genów (tj. knockdown shRNA genów będących przedmiotem zainteresowania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie kroki wymagające wykorzystania zwierząt w tym protokole są zgodne z wytycznymi komitetu etycznego ds. badań na zwierzętach Uniwersytetu Kolorado (IACUC).

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i innych odczynników

  1. Przygotować 100 ml pożywki mammosfery zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle i pożywkę Hana F-12 (DMEM/F12) (1:1), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, 20 ng/ml), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 10 ng/ml), heparynę (4 μg/ml), 1x B27, penicylinę (100 U/ml), streptomycynę (100 μg/ml). Przygotuj pożywkę w sterylnych warunkach i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Przygotować bufor wzbogacający nabłonek (EEB) zawierający PBS pH 7,2, 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA), 2 mM EDTA. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. Przygotować 5 ml porcji buforu do wytrawiania w sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy. Na noc przed trawieniem guza rozmrozić bufor do wytrawiania (5 ml na 500 mg guza) na lodzie, w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać 1x mieszankę antybiotykowo-przeciwgrzybiczą.
  4. Autoklaw (121 °C przez 30 min) z co najmniej dwoma kleszczami, skalpelem i nożyczkami do preparacji PDX.
  5. Przygotuj 500 ml buforu do płukania zawierającego DMEM:F12 i 5% płodową surowicę bydlęcą (FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy. Podwielokrotność 10 ml na guz w dniu rozwarstwienia guza.
  6. Przygotować bulion z polibrenu o stężeniu 4 μg/μl ze sterylną wodą. Przefiltrować i przelać do 1,5 ml probówek wirówkowych zawierających 100 μl każda, przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Wytwarzanie cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie niosących identyfikowalne markery

  1. Zakup lub wytworzenie cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie zawierających gen reporterowy (tj. GFP i Luc do śledzenia wzrostu guza in vivo) 18,19,
    UWAGA: Miano lentiwirusa wynoszące > 108 TU/ml (jednostki transdukcji na mililitr) jest zalecane do pomyślnej transdukcji PDX. Cząsteczki lentiwirusa powinny być pseudotypowane glikoproteiną G otoczki z wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G), co umożliwia transdukcję szerokiej gamy komórek ssaków.
    UWAGA: Protokół stosowany tutaj do generowania i miareczkowania cząstek lentiwirusa o wysokim mianie jest dostępny pod adresem www.kottonlab.com. Wektory używane w tym protokole to pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro i podwójny promotor pHAGE-EF1aL-lucyferazy-UBC-GFP-W. Wektor ten został wygenerowany przez zastąpienie dsRed genem lucyferazy za promotorem EF1aL w wektorze pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W, który jest miłym darem Darrella Kottona z Boston University.

3. Generacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

  1. Generowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) z raka piersi poprzez wszczepianie pierwotnych lub przerzutowych guzów piersi w poduszeczce tłuszczowej sutka myszy z obniżoną odpornością3,4. Generuj guzy o maksymalnym zalecanym rozmiarze 1 cm średnicy, ponieważ większe guzy mogą zawierać martwicze rdzenie.
    UWAGA: Szczegółowe metody zakładania i przeszczepiania ksenoprzeszczepów opisano w DeRose i wsp. 18. Wzrost PDX o ustalonej zdolności do przeszczepu do guzów o średnicy > 1 cm trwa od 4 do 24 tygodni po implantacji w NOD / SCID / ILIIrg−/− (NSG), w zależności od wewnętrznego tempa wzrostu guza. Chociaż protokół ten opisuje transdukcję PDX raka piersi, może być stosowany do transdukcji wirusa dowolnego guza odpowiedniego do krótkotrwałego pasażu in vitro. Wrażliwość PDX na krótkotrwałe (24 - 96 godzin) przeżycie in vitro jest nieodłączną cechą każdego nowotworu i musi być określona eksperymentalnie.

4. Rozwarstwienie guza i dysocjacja komórek nowotworowych pochodzących z PDX

  1. Eutanazja myszy będących nosicielami PDX za pomocą inhalacji CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy (postępuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi komisji etycznej ds. badań na zwierzętach). Zanurz myszy w 0,2% roztworze chlorheksydyny na 1 minutę. Ustaw mysz w pozycji leżącej na górze deski do sekcji i użyj szpilek, aby przymocować wyprostowane kończyny górne i dolne do deski.
  2. Stosując technikę aseptyczną, użyj skalpela, aby przeciąć skórę wokół guza. Pociągnij skórę za pomocą zestawu kleszczy i oddziel ją od guza za pomocą czystego skalpela, aż guz zostanie całkowicie odsłonięty. Używając czystego zestawu kleszczy i skalpela, usuń guz i umieść go w 5 ml pożywki myjącej na lodzie.
  3. Weź wypreparowany guz do szafki BLS2 w celu dalszego przetwarzania. Usuń pożywkę i przepłucz guz 10 ml Hank's Balanced Salt Sodium Modified with 10 mM Hepes (HBSS/Hepes), dwukrotnie.
  4. Wrzuć guz na sterylną, wstępnie zważoną płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 60 cm. Zważ płytkę zawierającą guz, aby oszacować masę guza.
  5. Za pomocą skalpela przetnij guz na pół, a następnie odetnij 3-milimetrowy krążek z jednej połowy i umieść go w pojemniku z 10% formaliną na 24 godziny. Użyj tej tkanki, aby zweryfikować niejednorodność próbki guza (rodzicielski PDX). Dodaj 200 μl HBSS/Hepes (tyle, aby uniknąć wyschnięcia tkanki) i zmielić pozostały guz na najmniejsze możliwe kawałki za pomocą kleszczy i czystego skalpela.
  6. Przenieś zmielony guz do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać co najmniej 1 ml buforu wytrawiającego zawierającego 1x antybiotyk przeciwgrzybiczy na 100 mg guza.
    UWAGA: Dodanie antybiotyków/leków przeciwgrzybiczych zapobiega zanieczyszczeniu komórek nowotworowych in vitro.
  7. Trawić guz przez 3 godziny w temperaturze 30 °C, wstrząsając w temperaturze 125 - 200 obr./min.
    UWAGA: Zwiększenie temperatury do 37 °C zwiększa efektywność trawienia (więcej pojedynczych komórek w czasie), ale zwykle towarzyszy temu zwiększona śmierć komórek. W przypadku większości nowotworów trawienie w temperaturze 30 °C przez 3 godziny powoduje uzyskanie wystarczającej liczby żywotnych zdysocjowanych komórek, aby przejść do etapu znakowania.
  8. Zatrzymaj trawienie, dodając 35 ml pożywki płuczącej (DMEM/F12 z 5% FBS). Przefiltruj przez nylonową siatkę o grubości 70 μm do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby usunąć niestrawioną tkankę. Odwirować przefiltrowaną pożywkę zawierającą strawione komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  10. Dodać 10 ml buforu do przemywania (DMEM: F12, 5% FBS), aby zatrzymać lizę. Przepuść komórki przez nylonową siatkę 40 μM, aby usunąć grudki. Wirować przy 400 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, umieścić na lodzie.
  11. Ponownie zawiesić strawione komórki w 5 ml buforu do przemywania i policzyć zarówno żywotne, jak i nieżywotne komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego. Krótko zmieszać 50 μl komórek i 50 μl błękitu trypanowego i policzyć komórki z wyłączeniem trypan-błękitu za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Ten surowy produkt trawienny będzie zawierał ludzkie komórki nowotworowe pochodzące z PDX, a także komórki zrębu myszy (fibroblasty, komórki krwi itp.). Strawione komórki mogą być teraz przetwarzane w celu znakowania (krok 6) lub ludzkie komórki rakowe mogą być wzbogacane przy użyciu jednej z procedur opisanych w Ref 5.

5. Wzbogacanie ludzkich komórek raka nabłonka

  1. Zuboż komórki zrębu myszy za pomocą zestawu do zmniejszania liczby komórek linii (Lin+)20.
    UWAGA: Zalecany w przypadku guzów silnie unaczynionych i/lub guzów o dużej zawartości zrębu, w których ekspresja EpCAM jest nieznana lub utracona).
    1. Pobrać do 107 żywych komórek do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml, dodać 2 ml EEB i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Całkowicie odpipetować supernatant.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 40 μl lodowatego EEB na 10-7 komórek.
    3. Dodać 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał na 10-7 komórek, wymieszać delikatnie pipetując i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut (koktajl zawiera przeciwciała przeciwko komórkom myszy Lin+).
    4. Dodać 30 μl zimnego EEB na 107 komórek, wymieszać delikatnie pipetując.
    5. Dodać 20 μl mikrogranulek antybiotyny na 107 komórek, delikatnie pipetując i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
    6. Przemyć komórki 3 ml zimnego EEB, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant. Zawiesić granulat w 500 μl EEB i umieścić na lodzie.
    7. Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora magnetycznego. Przepłukać kolumnę 0,5 ml buforu wzbogacającego nabłonek i pozostawić do przesączenia. Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
    8. Umieść nową rurkę zbiorczą z polipropylenu pod kolumną. Powoli dodaj 500 μl zawierających znakowane komórki do kolumny (komórki znakowane Lin+ zostaną zachowane w kolumnie magnetycznej). Zbierz ścieki jako frakcję z nieznakowanymi komórkami, reprezentującą wzbogaconą frakcję komórek ujemnych (guza).
    9. Przepłukać kolumnę 3 razy 500 μl EBB i zebrać ścieki w tej samej probówce, w której znajdują się ścieki z kroku 5.1.8. Utrzymuj ścieki na lodzie i przejdź do etapu etykietowania (6).
    10. Opcjonalnie: Umieść kolumnę poza polem magnetycznym. Umieść pod spodem nową rurkę polipropylenową i eluuj frakcję LIN+, dodając trzykrotnie 500 μl EEB i używając dołączonego tłoka.
  2. Wzbogacenie ludzkich komórek nabłonkowych raka EpCAM+ (zalecane w przypadku guzów, o których wiadomo, że wyrażają CD326 + i zawierają wysoką zawartość zrębu myszy).
    1. Pobrać do 107 żywych komórek do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml, dodać 2 ml zimnego EEB i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Całkowicie odpipetować supernatant.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 60 μl lodowatego EBB na 107 komórek.
    3. Dodać 20 μl mikrogranulek EpCAM na 10-7 komórek, wymieszać delikatnie pipetując i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    4. Przemyć komórki 3 ml zimnego EEB, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant. Zawiesić granulat w 500 μl EEB i umieścić na lodzie.
    5. Umieść kolumnę w polu magnetycznym mini separatora. Przepłukać kolumnę 0,5 ml EEB i pozostawić do przesączenia. Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
    6. Umieść nową rurkę zbiorczą z polipropylenu pod kolumną. Powoli dodaj 500 μl zawierających znakowane komórki do kolumny (komórki znakowane EpCAM+ zostaną zatrzymane w kolumnie magnetycznej). Zbierz ścieki jako frakcję z nieoznakowanymi komórkami, reprezentującymi komórki zrębu myszy.
    7. Przepłukać kolumnę 4 razy 500 μl buforu ME i zebrać ścieki w tej samej probówce, co ścieki z kroku 5.1.8.
    8. Wyprowadź kolumnę poza pole magnetyczne. Umieść pod spodem nową rurkę polipropylenową i wymyj frakcję EpCAM+, dodając trzykrotnie 500 μl buforu ME. Wypłucz magnetycznie oznakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny. Zebrać ścieki zawierające wzbogaconą frakcję komórek nowotworowych EpCAM+ i przechowywać na lodzie. Przejdź do kroku 6.

6. Transdukcja komórek nowotworowych pochodzących z PDX

  1. Odwirować zdysocjowane komórki nowotworowe w czasie 300 g x 5 min i ponownie zawiesić w 2 ml pożywki mammosferowej. Policz żywotne komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego, jak w 4.11.
  2. Przygotować 10 ml pożywki mammosfery zawierającej 8 μg/ml polibrenu (2 μl podstawowego polibrenu na ml pożywki).
  3. Określ objętość potrzebną dla 2 x 105 żywotnych komórek nowotworowych. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki zawierającej polibren. Płytka 2 x 105 żywotnych komórek nowotworowych na studzienkę w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o bardzo niskiej przyczepności.
    UWAGA: Jest to optymalna liczba komórek wymagana do transdukcji za pomocą jednego wektora lentiwirusowego.
    ostrożność! Z cząstkami lentiwirusowymi i wszystkimi materiałami eksploatacyjnymi stosowanymi z cząstkami lentiwirusa należy obchodzić się zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi zagrożeń biologicznych związanych z rekombinowanym DNA.
    UWAGA: Transdukcja liściakowa pierwotnych komórek piersi silnie faworyzuje komórki mioepitelialne, co może skutkować słabym znakowaniem komórek luminalnych i selekcją subpopulacji komórek nowotworowych podczas znakowania21.
  4. Inkubować wirusa z neuraminidazą w stężeniu 200 mU/ml w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed transdukcją, aby zwiększyć wiązanie cząstek wirusa z różnymi pierwotnymi subpopulacjami komórek i skorygować to potencjalne odchylenie21.
  5. Dodaj cząstki lentiwirusa w temperaturze 10 MOI (2 x 106 TU dla 2 x 105 żywotnych komórek), jeśli komórki zdysocjowane PDX są zubożone z komórek myszy Lin + lub wzbogacone w komórki EpCam +. Dodać cząstki lentiwirusa w temperaturze 30 MOI (6 x 106 TU dla 2 x 105 żywotnych komórek), jeśli używasz niewzbogaconych komórek zdysocjowanych PDX.
    UWAGA: Zwiększony MOI pozwala na efektywną transdukcję nawet w obecności dużych ilości zanieczyszczeń i martwych komórek w surowych ekstraktach. Utrzymuj jedną studzienkę z nieoznakowanymi komórkami, aby służyła jako kontrola żywotności i wydajności transdukcji.
  6. Zawiruj, aby wymieszać wirusa z komórkami. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez okres do 96 godzin. Dodać 500 μl świeżej pożywki mammosfery 24 godziny po transfekcji. Komórki nie przyczepiają się do płytek, nie zasysają pożywki.

7. Ocena skuteczności transdukcji i reimplantacji znakowanych komórek u myszy z obniżoną odpornością

  1. Monitoruj ekspresję markera śladowego (GFP) co 24 godziny za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 10-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Ekspresję GFP można zaobserwować już po 24 godzinach od zakażenia, ale w większości PDX ekspresja GFP jest wyraźnie widoczna po 72 godzinach (ryc. 1).
  2. Oszacuj wydajność transdukcji, oceniając procent komórek GFP+ w całkowitej studzience.
    UWAGA: Ponieważ hodowle zawierają komórki nowotworowe, szczątkowe komórki zrębu i martwe komórki w różnym stopniu, studzienki z zaledwie 10% komórkami GFP+ można wszczepić myszy gospodarzowi.
  3. Przenieść transdukowane komórki z płytek 6-dołkowych do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 1 ml pożywki mammosfery do studzienki, aby zebrać wszystkie pozostawione komórki. Ułóż na lodzie.
  4. Dodać 10 ml HBSS/hepes do transdukowanych komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 50 μl ekstraktu z macierzy podstawowej (BME) na lodzie.
    UWAGA: Podwielokrotności BME należy rozmrozić na lodzie 1 - 2 godziny przed użyciem. BME zestala się w temperaturze pokojowej; Trzymaj się lodu przez cały czas.
  5. Załaduj komórki osadzone w BME do strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml, trzymaj na lodzie i przynieś do zakładu dla zwierząt w celu reimplantacji myszom NSG.
  6. Znieczulenie samic 4-8 tygodniowych myszy NSG, używając 5% izofluranu / 95% tlenu przez 5 minut, a następnie 2% izofluranu / 98% tlenu lub zgodnie z zatwierdzonym protokołem zatwierdzonym przez etykę badań na zwierzętach.
  7. Gdy zwierzę nie reaguje na bodźce bólowe (szczypanie palców u stóp), oczyść miejsce wstrzyknięcia betadyną, a następnie chusteczkami etanolowymi i wstrzyknij 50 μl komórek do czwartej poduszeczki tłuszczowej sutka. Zapewnij myszom środek przeciwbólowy, aby złagodzić dyskomfort związany z wstrzyknięciem, jak wskazano w zatwierdzonym protokole.
  8. Pozwól komórkom tworzyć guzy (2 - 12 tygodni) i monitoruj aktywność GFP i / lub lucyferazy za pomocą systemu przestrajalnego światła i / lub systemu obrazowania lucyferazy in vivo (ryc. 2).
    UWAGA: Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi znieczulenia, analgezji, pomiarów obciążenia guzem i kryteriów eutanazji, zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję etyczną ds. badań na zwierzętach.

8. Kontrola jakości oznakowanych PDX

  1. Określ skuteczność znakowania, oceniając ekspresję lucyferazy i GFP w znakowanych nowotworach.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję bioetyczną ds. badań na zwierzętach w zakresie obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (ryc. 2, 3).
    1. Wypreparuj guzy myszy poddanych eutanazji, gdy rozmiar guza osiągnął średnicę 1,0 - 1,5 cm (lub wcześniej zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, jak opisano w 4). Sekcja powinna być wykonywana w systemie przestrajalnego światła (lub równoważnym systemie, który umożliwia ocenę fluorescencji GFP).
    2. Z każdego guza należy jakościowo oszacować odsetek guza GFP+ za pomocą mikroskopii. Jeśli jest mniejsza niż 100%, należy rozciąć tylko część GFP+. Wypreparuj krążek o średnicy 3 mm i umieść w nim 10% formaliny do zatapiania parafiny i analizy histologicznej, zachowaj mały kawałek na RNA lub inne pożądane analizy i zachowaj jak najwięcej guza w pojedynczych krioprobówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 90% FBS / 10% DMSO do krioprezerwacji.
  2. Ponownie wszczepić fragmenty znakowanego guza do nowych myszy NSGbiorcy 18 w celu rozszerzenia i wykorzystania w eksperymentalnych badaniach przerzutów.
  3. Wykonaj standardowe barwienie immunohistochemiczne tkanki zatopionej w parafinie uzyskanej z guzów przed transdukcją i w każdym następnym pokoleniu, aby sprawdzić, czy znakowane PDX pozostają histologicznie podobne do oryginalnych PDX.
    UWAGA: Znaczniki używane do kontroli jakości różnią się w zależności od PDX. W przypadku PDX raka piersi do wstępnych badań przesiewowych zaleca się ekspresję receptora estrogenowego, receptora progesteronu, receptora naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2), receptora naskórkowego czynnika wzrostu 1 (HER1 lub EGFR), pan-cytokeratyny (pan-CK).

9. Eksperymentalne modele przerzutów z oznaczonymi PDX

  1. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 4, oddziel komórki nowotworowe od znakowanego PDX. Jeśli guz jest silnie unaczyniony lub bogaty w zrąb myszy, należy wykonać wzbogacenie komórek rakowych, jak opisano w 4.5 lub 4.6.
  2. Policz żywe komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i rozcieńcz 250 000 komórek w 100 μl PBS (bez Ca2+, Mg2+) na mysz. Utrzymuj komórki na lodzie. W przypadku wstrzykiwania wielu myszom należy odpowiednio dostosować liczby (i przygotować nadmiar co najmniej jednego dodatkowego wstrzyknięcia, aby uwzględnić błędy pipetowania).
  3. Przynieś komórki na lodzie do odpowiedniej sali zabiegowej dla zwierząt i przystąp do iniekcji dosercowej zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC.
    UWAGA: Szczegółowe protokoły dosercowego wstrzykiwania komórek nowotworowych zostały opisane w innym miejscu22,23.
  4. Śledź i określaj ilościowo rozprzestrzenianie się przerzutów w czasie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Wizualizacja makroskopowych przerzutów w różnych narządach za pomocą obrazowania bioluminescencji i / lub GFP izolowanych narządów podczas sekcji zwłok24 (ryc. 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza metoda opisuje transdukcję komórek raka piersi wyizolowanych z modeli PDX przy użyciu lentiwirusem wektorów o wysokim mianie pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro oraz pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Wektory te wykazują ekspresję markera fluorescencyjnego, który umożliwia oszacowanie wydajności transdukcji in vitro już 24 h po infekcji (Rysunek 1a). W większości przypadków PDX ekspresja GFP jest opóźniona do 72 h po infekcji (Rysunek 1b), kiedy to...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki w protokole:

Zastosowanie cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie (>108 TU/ml) jest kluczowym krokiem w kierunku powodzenia tego protokołu, ponieważ umożliwia dokładną kontrolę składu pożywki podczas transdukcji in vitro . Chociaż wiele metod produkcji cząstek wirusa o wysokim mianie zostało dobrze opisanych18,19; W protokole tym wykorzystuje się cząsteczki lentiwirusowe wytwarzane zgodnie z opisem szczegółowo na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Darrelowi Kottonowi z Boston University za dostarczenie wektora pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W oraz protokołów produkcji lentiwirusa o wysokim mianie, wykorzystywanych w tych badaniach. Praca ta została sfinansowana przez DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) i R01 CA140985 (CAS). Grant NCI P30CA046934 Center wspierał obrazowanie in vivo i hodowle tkankowe na University of Colorado AMC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F12 (1:1)HyclonSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
HeparynaSigmaH4784
B27Gibco/Thermo Fisher17504-44
Antybiotyki przeciwgrzybiczeHyclonSV30010
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105-500Bufor wytrawiający
FBSAtlanta BiologicalsS11550
HBSS Red Ca2+/Mg2+ za darmoHyklonSH30031.02
Hepes
10x PBSHycloneSH30258.01
Cultrex Cultrex3433-005-01Ekstrakt z matrycy piwnicznej (BME)
30 ° Wytrząsarka CNewBrunswick Scientific CO. INCSeries 25 Wytrząsarka
70 μ m filtryFalcon7352350
skalpeleFisher22079690
Klorheksydyna środek dezynfekującyDurvet NDC# 30798-624-35
Czerwona krew  odczynnik do lizy komórekSigmaR7757
NeuraminidazaSigmaN7885-1UN
EpCAM (CD326+) mikrogranulki*Miltenyil Biotec130-061-101
Zestaw do zmniejszania liczby komórek linii, mysz*Miltenyil Biotec130-090-858
Separator MiniMACS Miltenyil Biotec130-042-102
Mini MACS Stojak magnetycznyMiltenyil Biotec130-042-303
Kolumny MSMiltenyil Biotec130-042-201MS lub LS, dostosuj do liczby komórek.
Illumatool Przestrajalny system świetlnyBadania NarzędziaRóżneDo obrazowania fluorescencyjnego in vivo
Urządzenie do obrazowania IVIS200 ksenogenuRóżneDo obrazowania luminescencji in vivo
Ludzki klon cytokeratyny MNF116 Przeciwciało monoklonalneDAKOM0821Pan-cytokeratyna 
Przeciwciało przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostuSygnalizacja komórkowa4267SEGFR
inkubatora Można stosować kolumny

Bibliografia

  1. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
  2. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
  5. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  6. Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
  7. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  8. Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
  9. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201(2013).
  10. Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
  11. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  12. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36(2014).
  13. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  14. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  16. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  17. Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
  18. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
  19. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  20. Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
  21. Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927(2015).
  22. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260(2012).
  23. Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
  24. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
  25. Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

PDX raka piersitransdukcja lentiwirusowaznakowanie komórek nowotworowychobrazowanie bioluminescencyjneekspresja GFPdysocjacja guzawzbogacanie frakcji nabłonkowejobrazowanie in vivo
Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.