Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Summary

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Abstract

Wysokorozdzielczy oksygram to urządzenie do pomiaru zużycia tlenu przez komórki w systemie zamkniętej komory z bardzo wysoką rozdzielczością i czułością w próbkach biologicznych (nienaruszone i przepuszczalne komórki, tkanki lub izolowane mitochondria). Urządzenie oksygraficzne o wysokiej rozdzielczości jest wyposażone w dwie komory i wykorzystuje polarograficzne czujniki tlenu do pomiaru stężenia tlenu i obliczania zużycia tlenu w każdej komorze. Wskaźniki zużycia tlenu są obliczane za pomocą oprogramowania i wyrażane w pikosolach na sekundę na liczbę komórek. Każda komora oksygraficzna o wysokiej rozdzielczości zawiera korek z portami iniekcyjnymi, co czyni ją idealną do miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor lub protokołów miareczkowania detergentem w celu określenia skutecznych i optymalnych stężeń przepuszczalności błony plazmatycznej. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w szerokim zakresie typów komórek, a także dostarcza informacji na temat jakości i integralności mitochondriów oraz maksymalnej zdolności mitochondrialnego systemu transportu elektronów oddechowych.

Introduction

Mitochondria pełnią ważną rolę w metabolizmie energii komórkowej, zwłaszcza poprzez wykorzystanie tlenu do produkcji adenozynotrójfosforanu (ATP). Są one zaangażowane w śmierć komórek i kilka chorób u ludzi. Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) łączy transport elektronów wzdłuż łańcucha transportu elektronów ze zużyciem tlenu i syntezą ATP. Cykl mitochondrialnego kwasu trikarboksylowego (TCA) bierze udział w przekształcaniu białek, węglowodanów i tłuszczów w związki bogate w energię, takie jak dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FADH₂). Elektrony NADH i FADH₂ są następnie przenoszone do kompleksów białkowych łańcucha transportu elektronów oddechowych (I do IV) znajdujących się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Ponadto dwa inne szlaki redoks mogą przenosić elektrony do łańcucha transportu elektronów: i) mitochondrialna flawoproteina przenosząca elektrony (ETF), która znajduje się na powierzchni macierzy wewnętrznej błony mitochondrialnej i dostarcza elektrony z β-utleniania kwasów tłuszczowych; oraz ii) mitochondrialna dehydrogenaza glicerofosforanowa, która utlenia glicerofosforan do fosforanu dihydroksyacetonu i dostarcza elektrony do mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów. Kompleks IV (ostateczny akceptor elektronów) przenosi elektrony do jednej cząsteczki tlenu, przekształcając tlen w dwie cząsteczki wody. Przemieszczanie się elektronów z kompleksu łańcucha transportu elektronów oddechowych I do IV jest sprzężone z przepływem protonów z macierzy mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej, która ustanawia gradient elektrochemiczny w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. Następnie kompleks mitochondrialny V (syntaza ATP) transportuje jony wodorowe z powrotem do macierzy mitochondrialnej i syntetyzuje cząsteczki ATP. Funkcję OXPHOS można ocenić in vivo i in vitro przy użyciu różnych technik i uzyskać różne stany oddychania mitochondrialnego. W izolowanych mitochondriach można mierzyć następujące stany oddechowe: i) podstawowe oddychanie mitochondrialne (stan 1), ii) zużycie tlenu po dodaniu specyficznych substratów kompleksów mitochondrialnego łańcucha oddechowego (stan 2), iii) maksymalne zużycie tlenu w mitochondriach po dodaniu nasyconych stężeń difosforanu adenozyny (ADP) (stan 3) oraz iv) oddychanie spoczynkowe po spożyciu ADP (przekształcone w ATP) (stan 4). W nienaruszonych komórkach można zmierzyć następujące stany oddechowe: i) podstawowe zużycie tlenu komórkowego w obecności endogennych substratów i ADP, ii) podstawowe zużycie tlenu komórkowego w obecności oligomycyny (oddychanie niewrażliwe na oligomycynę) i oddychanie wrażliwe na oligomycynę (obrót ATP), iii) oddychanie niesprzężone FCCP oraz iv) oddychanie niemitochondrialne po dodaniu antymycyny A i rotenonu. W komórkach przepuszczalnych można dodawać specyficzne substraty kompleksów łańcucha transportu elektronów i ADP oraz mierzyć maksymalne częstości oddechów zależne od kompleksu, takie jak częstość oddechów zależna od kompleksu I, II i IV.

Pomiary oddychania komórkowego dostarczają ważnych informacji na temat wydolności oddechowej mitochondriów specyficznych dla kompleksów I-IV, integralności mitochondriów i metabolizmu energetycznego^1,2,3. Jednym z urządzeń, które umożliwiają pomiary zużycia tlenu w mitochondriach z dużą dokładnością, rozdzielczością i czułością, jest wysokorozdzielczy oxygraph⁴. Urządzenie oksygraficzne o wysokiej rozdzielczości zawiera dwie komory z portami wtryskowymi, a każda komora jest wyposażona w polarograficzny czujnik tlenu. Zawiesiny komórkowe lub izolowane mitochondrialne są stale mieszane w respirometrze. Aby ocenić funkcję mitochondriów, substraty i inhibitory aktywności kompleksu mitochondrialnego można dodać zgodnie ze standardowymi protokołami. Substraty i inhibitory mogą być miareczkowane przez wstrzyknięcie do komór oksygraficznych, a wskaźniki zużycia tlenu są obliczane za pomocą oprogramowania i wyrażane w pikosolach na sekundę na liczbę komórek. Respirometria o wysokiej rozdzielczości ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi i konwencjonalnymi polarograficznymi elektrodami tlenowymi, w tym zwiększoną czułość i możliwość pracy z niewielką liczbą próbek biologicznych, takich jak nienaruszone lub przepuszczalne komórki. Ponadto każde urządzenie zawiera dwie komory, a częstość oddechów może być rejestrowana jednocześnie w celu porównania stężeń tlenu. Zaletą oksygrafu o wysokiej rozdzielczości jest również zmniejszony wyciek tlenu z komór urządzenia w porównaniu z tradycyjnymi polarograficznymi elektrodami tlenowymi. Innym niedawno opracowanym urządzeniem do pomiaru zużycia tlenu przez komórki jest 96-dołkowy analizator strumienia zewnątrzkomórkowego ⁵. Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest wyposażony w czujniki fluorescencyjne zamiast polarograficznych. Zalety analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w porównaniu z oksygrafem o wysokiej rozdzielczości to: i) jest to urządzenie w dużej mierze zautomatyzowane, ii) możliwy jest pomiar zużycia tlenu na płytkach 24- i 96-dołkowych do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, co wymaga mniejszych ilości próbek biologicznych, oraz iii) możliwy jest dodatkowy pomiar komórkowego strumienia glikolitycznego. Wadą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w porównaniu z oksygrafem o wysokiej rozdzielczości są i) wysokie koszty urządzenia i materiałów eksploatacyjnych, takich jak płytki fluorescencyjne, które nie nadają się do ponownego użycia, oraz ii) tylko cztery związki na test/studzienkę można wstrzykiwać, dlatego system nie jest wykonalny dla protokołów miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor.

W obecnym badaniu używamy respirometrii o wysokiej rozdzielczości do określenia oddychania mitochondrialnego. W eksperymentach z komórkowym zużyciem tlenu komórki są przepuszczalne, aby umożliwić wejście egzogennego ADP i utlenialnych substratów mitochondrialnych do dostarczania elektronów do kompleksów układu oddechowego. Takie podejście pozwala na rozbiór zdolności oddechowych poszczególnych kompleksów mitochondrialnych, co jest wyraźną zaletą w porównaniu z nienaruszonymi komórkami (wiele substratów jest nieprzepuszczalnych dla komórek). Jednak przepuszczalność błony komórkowej przerwie barierę między cytozolem a przestrzenią i pożywką zewnątrzkomórkową (wypłukanie z substancji rozpuszczonych cytozolowych), a skład przestrzeni wewnątrzkomórkowej zostanie zrównoważony z podłożem zewnątrzkomórkowym. Jedną z wad komórek przepuszczalnych w porównaniu z nienaruszonymi komórkami jest to, że zewnętrzna błona mitochondrialna może zostać uszkodzona, jeśli podczas przenikania komórek zastosuje się nadmierne ilości detergentu. W nienaruszonych komórkach można zmierzyć oddychanie podstawne, sprzężone i niesprzężone nienaruszonych komórek. Metoda ta ocenia zużycie tlenu przez nienaruszone komórki bez dodatku substratów egzogennych i ADP, odtwarzając funkcję oddechową w zintegrowanej komórce, a także dostarczając informacji na temat maksymalnej zdolności transportu elektronów w mitochondriach^6,7. Jedną z zalet nienaruszonych komórek w porównaniu z komórkami przepuszczalnymi jest to, że środowisko komórkowe nie jest zakłócone, a mitochondria stykają się z całymi składnikami komórek. W celu przepuszczalności błony komórkowej zastosowano detergenty, takie jak digitonina⁸. Jednak integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej może być zagrożona, jeśli stosuje się nadmierne ilości digitoniny. Aby potwierdzić, że integralność błony zewnętrznej mitochondriów nie jest zagrożona w komórkach przepuszczalnych, przeprowadza się miareczkowanie digitoniny w celu określenia optymalnego stężenia przepuszczalności komórkowej. W tych eksperymentach komórki są ponownie zawieszane w pożywce oddechowej, a stężenie digitoniny jest miareczkowane za pomocą respirometrii w obecności substratów mitochondrialnych i ADP, a następnie mierzone są tempo oddychania. Oddychanie nienaruszonych, nieprzepuszczalnych komórek nie jest stymulowane w obecności substratów mitochondrialnych i ADP. Jednak późniejsze stopniowe miareczkowanie digitoniny zapewniłoby stopniową przepuszczalność błon plazmatycznych i uzyskano optymalne stężenie digitoniny. Świadczy o tym zwiększenie oddychania aż do pełnej przepuszczalności. Jakość mitochondriów i integralność błony zewnętrznej można zweryfikować, dodając egzogenny cytochrom c^2,9. Cytochrom c jest białkiem przenoszącym elektron o masie 12 kDa w mitochondrialnym łańcuchu transportu elektronów ^10,11,12. Jest zlokalizowany w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej i bierze udział w zużyciu tlenu, przenosząc elektrony z kompleksu III do kompleksu IV. Po uszkodzeniu zewnętrznej błony mitochondrialnej uwalniany jest cytochrom c, a zużycie tlenu w mitochondriach ulega zmniejszeniu. Po dodaniu egzogennego cytochromu c każde zwiększenie oddychania mitochondrialnego wskazuje na przerwaną błonę zewnętrzną mitochondriów.

W komórkach przepuszczalnych, substraty i inhibitory aktywności kompleksu mitochondrialnego są dodawane zgodnie z różnymi protokołami^3,9. Na przykład w celu zbadania częstości oddechów sterowanych kompleksem mitochondrialnym można zastosować następujący protokół. Po przeniknięciu komórek, pierwszy kompleks I jest stymulowany przez substraty jabłczan i glutaminian, które generują NADH jako substrat do łańcucha oddechowego i prowokują aktywację kompleksu I. Następnie dodaje się ADP w celu konwersji do ATP (stan 3, oddychanie zależne od aktywnego kompleksu I). Po osiągnięciu stabilnego sygnału podaje się rotenon (inhibitor mitochondrialnego kompleksu I) w celu zahamowania kompleksu I. Po rotenonie podaje się bursztynian do FADH₂ i aktywację kompleksu II (stan 3, oddychanie zależne od aktywnego kompleksu II). W celu pomiaru oddychania zależnego od kompleksu IV, pierwsze oddychanie zależne od kompleksu III jest hamowane przez dodanie antymycyny A (inhibitora kompleksu mitochondrialnego III). Następnie stymulowane jest kompleksowe oddychanie zależne od kroplówki poprzez podawanie askorbinianu i tetrametylofenylenodiaminy (TMPD). TMPD może ulegać samoutlenianiu w buforze oddechowym, dlatego maksymalną częstość oddychania zależną od kompleksu IV (stan 3) oblicza się przez odjęcie szybkości oddychania przed i po dodaniu azydku sodu, inhibitora mitochondrialnego kompleksu IV. Eksperymenty oddechowe mogą być przeprowadzane równolegle w dwóch komorach oksygraficznych - jedna służy jako kontrola (komórki niestymulowane), a druga zawiera komórki stymulowane. Oczywiście, komórki mogą być wstępnie poddane obróbce na różne sposoby, np. lekami wpływającymi na funkcje mitochondriów, zanim ich zużycie tlenu zostanie zmierzone w komorze oksygraficznej. Protokół ten pozwala na funkcjonalne badanie poszczególnych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych. Ponadto można zmierzyć maksymalne oddychanie stymulowane ADP (stan 3) permeabilizowanych komórek, przy użyciu egzogennego kwasu tłuszczowego w postaci palmitynianu. W tym protokole skoncentrowane zapasy palmitynianu sodu są sprzężone z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) wolną od ultra kwasów tłuszczowych (BSA) (stosunek molowy palmitynianu 6:1:BSA). Następnie komórki są najpierw przepuszczane digitoniną, a oddychanie mitochondrialne ocenia się przez dodanie karnityny i palmitynianu, a następnie dodanie ADP (stan 3, maksymalne oddychanie). Następnie dodaje się oligomycynę do stanu naśladującego 4 (stan 4o) i oblicza się stosunek kontroli oddechowej (wartość RCR) jako stan 3 / stan 4o. β-utlenianie sprzyja wytwarzaniu acetylo-CoA (który wchodzi w cykl TCA) i wytwarzaniu FADH₂ i NADH, których elektrony są przekazywane do łańcucha transportu elektronów przez flawoproteinę przenoszącą elektrony i dehydrogenazę β-hydroksyacylo-CoA. Mitochondria znajdują się w centrum metabolizmu kwasów tłuszczowych, a opisany protokół palmitynianu-BSA może być wykorzystywany przez naukowców badających utlenianie kwasów tłuszczowych. W nienaruszonych komórkach aktywatory i inhibitory aktywności kompleksu mitochondrialnego są dodawane zgodnie z innym protokołem^6,9. W tych eksperymentach mierzy się pierwsze zużycie tlenu przez nieprzepuszczalne komórki przy braku substratów egzogennych (szybkość oddychania fosforylującego). Następnie mierzy się szybkość oddychania niefosforylującego po dodaniu oligomycyny, która jest inhibitorem mitochondrialnej syntazy ATP. Następnie podaje się p-trifluorometoksyfenylohydrazon protonoforu cyjanku karbonylu (FCCP) w różnych stężeniach i mierzy maksymalną częstość oddechów mitochondrialnych. Protonofory, takie jak FCCP, mogą indukować zwiększenie przepuszczalności protonów błony wewnętrznej, umożliwiając bierny ruch protonów w celu rozproszenia gradientu chemiosmotycznego. Wzrost przepuszczalności protonów rozprzęga oddychanie oksydacyjne (brak produkcji ATP) i indukuje wzrost zużycia tlenu. Następnie dodaje się rotenon i antymycynę A w celu zahamowania oddychania mitochondrialnego, a oddychanie niemitochondrialne jest odejmowane od wszystkich innych częstości oddechów.

Wskaźniki zużycia tlenu mogą być wyrażone jako IO₂ [pmol x ^sec-1 x 10-6 komórek] (przepływ tlenu na milion komórek), który jest obliczany przez podzielenie objętościowego strumienia tlenu (w zamkniętej komorze tlenowej), JV,O₂ [pmol x ^sec-1 x ^ml-1] przez stężenie komórek w komorze komórkowej (liczba komórek w objętości [10⁶ komórek∙ml¹])¹⁵. Strumień tlenu właściwy dla masy komórki, JO₂ [pmol x ^sec-1 x ^mg-1], to przepływ na komórkę, IO₂ [pmol x ^sec-1 x 10-6 komórek], podzielony przez masę na komórkę [mg∙10⁶ komórek]; lub strumień objętościowy właściwy, JV, O₂ [pmol x ^sec-1 x ^ml-1], podzielony przez masę na objętość [mg∙ml¹]. JO₂ to strumień tlenu na białko komórki, suchą masę lub objętość komórki.

W niniejszym badaniu wykorzystującym respirometrię o wysokiej rozdzielczości, opisujemy protokoły do określenia i) optymalnego stężenia digitoniny dla pełnej przepuszczalności błony komórkowej plazmatyki (test miareczkowania digitoniny), ii) integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej za pomocą egzogennego cytochromu C, iii) mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV maksymalnych częstości oddechów w komórkach HepG2 permeabilizowanych digitoniną w obecności egzogennego ADP i mitochondrialnego układu oddechowego substraty łańcuchowe, oraz iv) podstawowe, sprzężone i maksymalne oddychanie niesprzężone (maksymalna zdolność transportu elektronów) nienaruszonych komórek bez dodatku substratów egzogennych i ADP, odtwarzających funkcję oddechową w zintegrowanej komórce.

Protocol

1. Hodowla komórkowa

1. Hodowla ludzkich komórek hepG2 ⁶ w 25^{cm 2} kolbach do hodowli komórkowych w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Modified Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze (5% CO₂, 95% powietrza) (gęstość wysiewu: 1 x 10⁶ komórek na 25^{cm 2} kolby do hodowli komórkowych, czas inkubacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C: 48 godzin, gęstość komórek w momencie zbiegu: 4-5 x 10⁶ komórek na 25 cm² kolba do hodowli komórkowych).
2. Wykonuj eksperymenty, gdy komórki są zlewające się w 90% do 95%.

2. Kalibracja respirometryczna o wysokiej rozdzielczości polarograficznych czujników tlenu

1. Pobrać pipetę z 2,1 ml buforu oddechowego do komory oksygraficznej i ciągle mieszać bufor za pomocą mieszadła magnetycznego znajdującego się w komorze (700 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu z polarograficznego czujnika tlenu.
   UWAGA: Polarograficzne elektrody tlenowe w każdej komorze oksygraficznej mierzą stężenie tlenu i obliczają zużycie tlenu (strumień) w każdej komorze. Stężenie tlenu i wskaźniki zużycia tlenu (strumień) są wyświetlane w czasie rzeczywistym online w komputerze za pomocą oprogramowania do gromadzenia i analizy danych.
2. Wykonaj kalibrację powietrza polarograficznego czujnika tlenu zgodnie z protokołami producenta¹⁴.
   UWAGA: Kalibracja polarograficznych czujników tlenu w mediach oddechowych i stężenia tlenu w pożywkach w eksperymentalnej temperaturze nasycenia powietrza jest wykonywana tylko raz dziennie rano. Następnie pożywka może zostać usunięta z komór, a komórki zawieszone w świeżych pożywkach oddechowych są dodawane do komory oksygraficznej i mierzone są częstości oddechów. Po pierwszym eksperymencie komora może zostać umyta i można wykonać dodatkowe serie eksperymentów w tej samej komorze bez dalszych kalibracji.

3. Trypsyna przylegających komórek, liczenie komórek

1. W dniu eksperymentu należy odessać DMEM z kolby do hodowli komórkowych^o średnicy 25 cm2.
2. Przepłukać monowarstwę hodowli komórkowej w kolbie hodowlanej 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
3. Pobrać pipetą 0,5 ml roztworu trypsyny o stężeniu 25 mg/ml (podgrzanego do temperatury 37 °C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) do monowarstwy komórek w kolbie hodowlanej i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze (5% CO₂, 95 % powietrze).
4. Pobrać pipetą 5 ml DMEM zawierającego 10% FBS do oderwanych komórek w kolbie do hodowli komórkowych i zawiesić komórki za pomocą pipetowania.
5. Przenieść zawieszone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej i zdekantować supernatant.
6. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do oddychania¹³ (Table 1).
7. Policz komórki za pomocą licznika komórek i ponownie zawieś je w buforze oddechowym do końcowej gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml. Ponieważ tempo oddychania komórkowego zostanie znormalizowane do liczby komórek, policz komórki za pomocą dokładnego i precyzyjnego licznika komórek.

4. Respirometria o wysokiej rozdzielczości

1. Po kalibracji powietrza (wykonywanej tylko raz dziennie, kroki 2.1-2.2), odessać medium oddechowe z komory oksygrafu i dodać do komory 2,1 ml zawiesiny komórek (1 x 10⁶ komórek/ml) z kroku 3.7.
2. Zamknąć komorę oksygraficzną poprzez włożenie korka.
3. Mieszać komórki w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego znajdującego się w komorze (700 obr./min) w temperaturze 37 °C i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
   UWAGA: Stężenie tlenu i sygnał strumienia tlenu są wyświetlane w czasie rzeczywistym online na komputerze za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy danych¹⁴.
4. Następnie wstrzyknąć substraty i inhibitory do oddychania mitochondrialnego przez tytanowe porty iniekcyjne korków, stosując następujące protokoły.

5. Miareczkowanie digitoniny w nienaruszonych komórkach metodą respirometrii

1. Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 10⁶/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.
2. Wstrzyknąć 2 μl 0,2 mM rotenonu (0,2 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek przez tytanowy otwór iniekcyjny korka komory za pomocą strzykawki i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
   UWAGA: Wszystkie wstrzyknięcia w poniższych krokach są wykonywane przez tytanowe porty iniekcyjne korków za pomocą strzykawek. Dodanie rotenonu jest opcjonalne (zapobiega odwrotnemu przepływowi elektronów) i można je pominąć w doświadczeniach z miareczkowaniem digitoniny, patrz krok 6.3.
3. Wstrzyknąć 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
4. Wstrzyknąć 10 μl 0,5 M ADP (2,5 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
5. Wstrzyknąć 2 μl digitoniny 2 mM (2 μM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 2-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału tlenowego.
6. Ponownie wstrzyknąć 2 μl digitoniny 2 mM do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 2-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału tlenowego.
   UWAGA: Stopniowe dodawanie digitoniny do komórek spowoduje wzrost komórkowego zużycia tlenu, a sygnał strumienia tlenu wzrośnie.
7. Kontynuuj wstrzykiwanie 2-4 μl 2 mM digitoniny krok po kroku (2-4 μM każdy krok) do komory. Po każdym kroku rejestruj oddychanie komórkowe przez 2-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
   UWAGA: Przestań wstrzykiwać digitoninę, gdy sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom, a kolejne wstrzyknięcia digitoniny nie zwiększają częstości oddechów. Czytelnicy powinni określić optymalne stężenie digitoniny w swoich laboratoriach przy użyciu własnych odczynników i użyć uzyskanego optymalnego stężenia digitoniny w krokach 6.2 i 7.2 poniższych protokołów dla swoich eksperymentów.

6. Ocena integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej: Cytochrom C

1. Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 10⁶/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.
2. Wstrzyknąć 2 μl 8 mM digitoniny (8 μM) do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek (1 x 10⁶/ml) i przenikać komórki przez 5 minut.
3. Wstrzyknąć 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
4. Wstrzyknąć 10 μl 0,5 M ADP (2,5 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
   UWAGA: Dodanie ADP do komórek pobudzi kompleks I i wywoła wzrost zużycia tlenu, a sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.
5. Wstrzyknąć 5 μl cytochromu c o stężeniu 4 mM (10 μM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5-10 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
6. Na koniec wstrzyknąć 1 μl oligomycyny 4 mg/ml (2 μg/ml) i rejestrować oddychanie komórkowe aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.

7. Maksymalne oddychanie stymulowane ADP (stan 3) permeabilizowanych komórek HepG2

1. Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 10⁶/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.
2. Wstrzyknąć 2 μl 8 mM digitoniny (8 μM) do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek i przepuszczać komórki przez 5 minut.
3. Wstrzyknąć 12,5 μl 0,8 M jabłczanu (5 mM) i 10 μl 2 M glutaminianu (10 mM) do komory oksygraficznej. Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
4. Wstrzyknąć 10 μl 0,5 M ADP (2,5 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.
   UWAGA: Dodanie ADP do komórek spowoduje wzrost zużycia tlenu, a sygnał strumienia tlenu wzrośnie.
5. Wstrzyknąć 2 μl 0,2 mM rotenonu (0,2 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.
6. Następnie wstrzyknąć 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.
7. Następnie wstrzyknąć 2 μl 5 mM antymycyny A (5 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.
8. Następnie wstrzyknąć 2,5 μl askorbinianu 0,8 mM (1 mM) i natychmiast po tym wstrzyknąć 2,5 μl 0,2 mM TMPD (0,25 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe do momentu wzrostu i ustabilizowania się sygnału strumienia tlenu.
9. Na koniec wstrzyknąć 10 μl 1 M azydku sodu (5 mM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.

8. Zużycie tlenu przez nienaruszone komórki

1. Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą zawiesinę komórek (1 x 10⁶/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1–4.3 protokołu.
2. Wstrzyknąć 1 μl oligomycyny 4 mg/ml (2 μg/ml) do komory oksygraficznej zawierającej zawiesinę komórek i rejestrować oddychanie komórkowe aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.
3. Następnie wstrzyknąć 1 μl 0,2 mM FCCP (0,1 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.
4. Wstrzyknąć 3 μl 0,2 mM FCCP (0,4 μM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie dalej i ustabilizuje się.
5. Miareczkować FCCP w krokach co 0,1 do 0,3 μM, wstrzykując 1-3 μl 0,2 do 1 mM FCCP (0,1 do 2 μM stężenia końcowego w komorze) do komory oksygraficznej, aż sygnał strumienia tlenu osiągnie maksymalny poziom i nie będzie dalej wzrastał, a następnie zacznie spadać.
   UWAGA: Przerwij wstrzykiwanie FCCP, gdy sygnał tlenu osiągnie maksymalny poziom i zacznie spadać.
6. Następnie wstrzyknąć do komory 2 μl 0,2 mM rotenonu (0,2 μM) i 2 μl 5 mM antymycyny A (5 μM). Rejestruj oddech, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje.

Results

Określenie optymalnego stężenia digitoniny dla przepuszczalności komórkowej: Eksperyment z miareczkowaniem digitoniny

Miareczkowanie digitoniny jest wykonywane w celu określenia optymalnego stężenia dla przenikania komórek HepG2. W tych eksperymentach digitonina jest miareczkowana w nienaruszonych komórkach w obecności rotenonu, bursztynianu (substrat mitochondrialnego kompleksu II) i nasycającej ilości ADP (w celu wywołania stanu ...

Discussion

Celem niniejszego protokołu było wykorzystanie respirometrii o wysokiej rozdzielczości do pomiaru częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów oraz integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

W ramach niniejszego protokołu znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, wskaźniki zużycia tlenu przez komórki są zwykle znormalizowane do liczby komórek (pmol/[sec x liczba komórek]). Dl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemiczny
Antymycyna A	Sigma	A 8674	Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu
Askorbinian	Merck	1.00127	Chemiczny
BSA	Sigma	A 6003	Chemiczny
FCCP	Sigma	C 2920	Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu
Automatyczny licznik komórek Countess	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automatyczny przyrząd do liczenia komórek
Cytochrom c	Sigma	C 7752	Chemiczny
Digitonina	Sigma	D 5628	Chemiczny, rozpuszcza się w DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemiczny
FBS	Gibco	26010-074	Średni składnik
Glutaminian	Sigma	G 1626	Chemiczny
Hepes		Sigma H 7523	Chemiczny
KCl	Merck	1.04936	Chemiczny
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemiczny
K-laktobionian	Sigma	L 2398	Chemiczny
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemiczny
rdzeń O2k: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
Oligomycyna	Sigma	O 4876	Substancja chemiczna, rozpuszczać się w etanolu
Penicylina-streptomycyna	Gibco	15140122	Substancja chemiczna
Azydek sodu	Sigma	S2002	Chemiczny
Rotenon	Sigma	R 8875	Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu
Bursztynian	Sigma	S 2378	Chemiczny
Tauryna	Sigma	T 8691	Chemiczny
TMPD	Sigma	T 3134	Chemiczny
Trypsyna	Sigma	T 4674	Chemiczny