Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Podsumowanie

Niniejsza technika przedstawia efektywny sposób przygotowania defekcyjnych replikacyjnie zapasów retrowirusów kodujących ludzki onkogen, które następnie wykorzystano do indukowania choroby mieloproliferacyjnej w modelu mysim.

Streszczenie

Nasze laboratorium bada ludzkie choroby mieloproliferacyjne indukowane przez onkogeny takie jak Bcr-Abl lub onkogeny pochodne od receptorów czynników wzrostu (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα itp.). Jesteśmy w stanie modelować i badać chorobę o charakterze ludzkim w naszym modelu mysim, transplantując komórki szpiku kostnego uprzednio zainfekowane retrowirusem wykazującym ekspresję interesującego nas onkogenu. Defektywny replikacyjnie retrowirus kodujący ludzki onkogen oraz marker (GFP, RFP, gen oporności na antybiotyk itp.) jest wytwarzany za pomocą protokołu przejściowej transfekcji z wykorzystaniem komórek 293T, ludzkiej linii komórkowej nabłonka nerkowego przekształconej przez produkt genu E1A adenowirusa. Komórki 293 posiadają niezwykłą właściwość wysokiej podatności na transfekcję fosforanem wapnia (CaPO₄), przy czym z łatwością można osiągnąć wydajność transfekcji na poziomie do 50-80%. W tej procedurze przeprowadzamy kotransfekcję komórek 293 wektorem retrowirusowym wykazującym ekspresję interesującego nas onkogenu oraz plazmidem kodującym funkcje pakowania gag-pol-env, takie jak pojedyncze konstrukty pakujące kat lub pCL, w tym przypadku plazmid EcoPak. Wstępna transfekcja jest dodatkowo usprawniana poprzez zastosowanie chlorochiny. Materiał wirusa ekotropowego, zebrany jako nadsącz z hodowli 48 godz. po transfekcji, może być przechowywany w temperaturze -80°C i wykorzystywany do infekcji linii komórkowych w badaniach transformacji i badaniach in vitro lub pierwotnych komórek, takich jak komórki szpiku kostnego myszy, które mogą następnie zostać użyte do transplantacji w naszym modelu mysim.

Protokół

1. Wieczorem przed transfekcją wysiać komórki 293T w zagęszczeniu 3-5x10⁶ komórek/6 cm płytka do hodowli tkanek.
   
   Uwaga: Używamy komórek 293T ze względu na łatwość transfekcji i wysoką wydajność jako komórek produkujących wirusy. Komórki te nie są zdolne do pakowania wirusa, dopóki nie zostanie wprowadzony plazmid pomocniczy.
   
   
2. Następnego ranka ostrożnie usunąć pożywkę i zastąpić ją 4 ml pożywki dla komórek 293T zawierającej 25 mM chlorochiny. Inkubować przez 1 hr.
   
   Uwaga: płytka powinna być w około 80% konfluenta.
   
   
3. W międzyczasie przygotować w probówkach 5 ml mieszaninę do produkcji wirusa dla 2 płytek jednocześnie:
   1. 2 x 10 mg konstrukcyjnego plazmidu retrowirusowego
   2. 2 x 5 mg konstrukcji pakującej (EcoPak),
   3. 2 x 62 ml CaCl
   4. uzupełnić do 1 ml sterylną wodą ddH₂O
      
      Uwaga: Podczas gdy plazmid retrowirusowy koduje interesujący nas onkogen oraz marker, EcoPak koduje gag-pol-env. Wraz z komórkami 293T będą one produkować ekotropowy retrowirus (RV) specyficzny dla komórek myszy, który nie infekuje komórek ludzkich. Wykazano, że zarówno chlorochina, jak i CaCl₂ zwiększają wydajność transfekcji.
      
      
4. Do mieszaniny dodawać kroplami 1 ml sterylnego 2x HBS, delikatnie wstrząsając probówką na wortexie.
5. Bezzwłocznie dodać ten roztwór do 2 płytek, po 1 ml na każdą, ostrożnie, kropla po kropli.
6. Inkubować przez 7 do 11 hrs.
7. Wieczorem (7 do 11 hrs później) ostrożnie usunąć pożywkę i bardzo delikatnie zastąpić ją 5 ml świeżej pożywki dla komórek 293T. Inkubować do południa następnego dnia.
   
   Uwaga: ten krok jest istotny, ponieważ należy usunąć chlorochinę z komórek. Chlorochina jest toksyczna przy dłuższym czasie ekspozycji. Roztwór na płytkach wydaje się mętny z powodu bardzo drobnego, przypominającego pył wytrącania składników mieszaniny transfekcyjnej.
   
   
   Uwaga: Ważne jest, aby wszystkie wymiany pożywek przeprowadzać z najwyższą ostrożnością, ponieważ komórki zostały uwrażliwione przez chlorochinę i mogą łatwo odkleić się od płytki.
   
   
8. Następnego dnia, 18 do 24 hrs przed odzyskaniem wirusa (około południa), ostrożnie usunąć pożywkę i bardzo delikatnie zastąpić ją 3 ml świeżej pożywki dla komórek 293T. Inkubować przez noc (O/N).
9. Trzeciego ranka (18 do 24 hrs później) delikatnie odessać pożywkę z płytek za pomocą strzykawki 10 ml z igłą 18 G. Ten nadsącz zawiera retrowirusa.
10. Zamienić igłę na filtr strzykawkowy 45 mm, kilkakrotnie odwrócić strzykawkę, aby dobrze wymieszać roztwór, przepuścić nadsącz przez filtr i rozdzielić na aliquoty do probówek kriogenicznych.
    
    Uwaga: Alternatywnie, jeśli przygotowywanych jest 3 lub więcej płytek z wirusem, połączyć wszystkie nadsącze tego samego wirusa w 50 ml probówce stożkowej. Dobrze wymieszać, a następnie rozdzielić nadsącze zawierające retrowirusa do probówek kriogenicznych poprzez filtrację.
    
    
11. Probówki zawierające nadsącze z wirusem przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.

Dyskusja

Cztery kluczowe punkty zapewnią sukces w przygotowaniu dobrego zapasu wirusa:
   

1. Komórki produkcyjne 293T muszą być w bardzo dobrym stanie, co oznacza, że były pasażowane w regularnych odstępach czasu, nigdy nie dopuszczono do ich przerośnięcia, a wysiewano je z optymalną gęstością 3,5-5 milionów na 6 cm płytkę do hodowli tkanek, aby w dniu transfekcji rano osiągnęły konfluencję na poziomie 80% powierzchni płytki. 
   
2. Dodatek chlorochiny poprawia wydajność transfekcji i późniejszy mi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
komórki 293T	linia komórkowa			Przesiewać w stosunku 1:3 do 1:4 co 3 dni, w przeciwnym razie będą miały tendencję do agregowania się podczas ponownego wysiewania i wykażą gorszą wydajność transfekcji.
pożywka dla komórek 293T				DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (opcjonalnie 1% NEAA). Roztwory do hodowli tkankowej pozyskujemy od CellGro.
plazmid z kodującym DNA				Oczyszczony dwukrotnie za pomocą CsCl. Szkielet MSCV, kodujący onkogen i wybrany marker (Neo, GFP itp.)
EcoPak				zwany również pMCV-Ecopac: ekotropowy plazmid pakujący, kodujący gag-pol-env
2x HBS				Na 500 ml: 8,0 g NaCl + 0,37 g KCl + 106,5 mg Na2HPO4 (bezwodny; 201,1 mg w przypadku 7xH2O) + 1,0 g dekstrozy (D-glukozy) + 5,0 g proszku HEPES. Rozpuścić w 450 ml dH2O (milli-Q), dostosować pH do 7,05 za pomocą NaOH, a następnie uzupełnić do 500 ml dH2O. Przefiltrować sterylnie przez filtr 0,45 μ. Przechowywać w temperaturze pokojowej, szczelnie zamknięte.
2M CaCl2		Sigma-Aldrich
miliQ H2O				filtrowana sterylnie
Chlorochina				Zatłoczenie 1000x to 25 mM w PBS- (bez Ca2+/Mg2+), przechowywane w -20C. Dodawać świeżo do pożywki w razie potrzeby.
płytki 6 cm				do hodowli tkankowej
Inkubator				do hodowli tkankowej. Ustawiony na 37C, 10% CO2.
sterylne strzykawki 10 cc				Sterylne. Jedna na typ wirusa.
igły 18G				jednorazowe, jedna na typ wirusa.
filtry strzykawkowe 45 um
plastikowe probówki 5 ml				Sterylne, do mieszania roztworu do transfekcji, dla maksymalnie 2 płytek jednocześnie (2 ml). Stosujemy probówki Falcon.
probówki stożkowe 50 ml
krioprobówki				2 i 4 ml, na alikwoty wirusa.
Wszystkie odczynniki używane w transfekcji muszą być filtrowane sterylnie (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) i utrzymywane w warunkach sterylnych.