Method Article

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

DOI:

10.3791/55034

⸱

December 31st, 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Bern

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oocyt Xenopus jako heterologiczny system ekspresji białek, został po raz pierwszy opisany przez Gurdona i wsp.1 i jest szeroko stosowany od czasu jego odkrycia (Odnośniki 2 - 3 i odniesienia w nich). Cechą, która sprawia, że oocyt jest atrakcyjny dla ekspresji kanału obcego, jest słaba obfitość endogennych kanałów jonowych4. Ten system ekspresji okazał się przydatny do charakteryzacji wielu białek, w tym kanałów jonowych bramkowanych ligandem.

Ekspresja receptorów GABAA w oocytach Xenopus i ich charakterystyka funkcjonalna jest opisana tutaj, w tym izolacja oocytów, mikroiniekcje z cRNA, usuwanie warstw komórek pęcherzykowych i szybkie zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych. Procedury zostały zoptymalizowane w tym laboratoriumpod kątem 5,6 i odbiegają od rutynowo stosowanych7-9. Tradycyjnie, ogołocone oocyty są przygotowywane z przedłużonym leczeniem kolagenazą płatów jajników w RT, a te ogołocone oocyty są mikrowstrzykiwane mRNA. Korzystając ze zoptymalizowanych metod, za pomocą tego systemu stwierdzono ekspresję i zbadano różne białka błonowe, takie jak rekombinowane receptory GABAA 10-12, ludzkie rekombinowane kanały chlorkowe13, kanały potasowe trypanosomów14 i transporter mio-inozytolu15, 16.

Opisane tutaj metody mogą być stosowane do ekspresji dowolnego białka w oocytach Xenopus, a szybka zmiana roztworu może być wykorzystana do badania innych kanałów jonowych bramkowanych ligandem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

oocyty Xenopus są powszechnie używane jako system ekspresji (Bibliografia 2 - 3 i odniesienia w niej). Są w stanie prawidłowo składać i włączać funkcjonalnie aktywne białka wielocząsteczkowe do swoich błon plazmatycznych. Korzystając z tego systemu, możliwe jest funkcjonalne badanie białek błonowych samodzielnie lub w połączeniu z innymi białkami, w celu zbadania właściwości zmutowanych, chimerycznych lub połączonych białek oraz przeprowadzenia badań przesiewowych potencjalnych leków.

Zalety korzystania z oocytów w porównaniu z innymi heterologicznymi systemami ekspresji obejmują prostą obsługę gigantycznych komórek, wysoki odsetek komórek wyrażających obcą informację genetyczną, prostą kontrolę środowiska oocytu za pomocą perfuzji w kąpieli oraz kontrolę potencjału błonowego.

Wadą tego systemu wyrażeń jest sezonowa zmienność obserwowana w wielu laboratoriach17-20. Przyczyna tej zmienności jest daleka od jasności. Ponadto często obserwuje się, że jakość oocytów znacznie się różni. Tradycyjne metody7-9 obejmowały izolację płatów jajników, ekspozycję płatów jajników na kolagenazę przez około godzinę, selekcję ogołoconych oocytów i mikroiniekcję oocytów. W tym przypadku opisano szereg alternatywnych, szybkich procedur, które pozwoliły nam pracować z tym systemem ekspresji przez ponad 30 lat bez zmienności sezonowej i niewielkiej zmienności jakości oocytów.

Opisane tutaj zmodyfikowane i ulepszone metody izolacji oocytów, mikroiniekcji cRNA i usuwania warstw komórek pęcherzykowych mogą być używane do ekspresji dowolnego białka w oocycie Xenopus. Bardzo prosta metoda szybkiej wymiany roztworu pożywki wokół oocytu może być zastosowana do badania dowolnego kanału jonowego bramkowanego ligandem i nośników.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalny komitet Kantonu Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85/15).

1. Przygotowanie oocytów Xenopus

  1. Utrzymuj żaby (Xenopus laevis) w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności w wodzie, która jest ściśle utrzymywana w temperaturze 20 °C.
  2. Usuń płaty jajników z samic żab9.
    UWAGA: Usunięcie płatów jest bodźcem do regeneracji, a często jakość oocytów poprawia się po operacji. Oocyt jest pokryty warstwą witeliny, warstwą komórek pęcherzykowych i tkanką łączną zawierającą naczynia krwionośne21. Cała struktura nazywana jest "mieszkiem włosowym".
  3. Umieść płaty jajników, które są gęsto upakowane pęcherzykami zawierającymi oocyty, w sterylnym roztworze soli Barth's Saline7 (MBS) uzupełnionym penicyliną i streptomycyną (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,82 mM MgSO4, 0,41 mM CaCl2, 0,33 mM Ca(NO3)2, 10 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).
  4. Pojedyncze pęcherzyki etapu V-VI21. Przytrzymaj płat jajnika kleszczami. Opuść platynową pętlę (ryc. 1) na mieszki włosowe i delikatnie wycofaj pętlę, aby przerwać tkankę łączną zawierającą pęcherzyk od tkanki jajnika.
    UWAGA: Pęcherzyki Stage V-VI21 charakteryzują się wielkością (1,0 - 1,2 mm średnicy) oraz dobrym kontrastem między ciemną pigmentowaną półkulą zwierzęcą a żółtawą półkulą roślinną.
  5. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura należy przenieść tylko zdrowo wyglądające pęcherzyki (tj. idealnie kuliste i z nienaruszoną pigmentacją) na szalkę Petriego o średnicy 35 mm (przyciąć grzbiet do średnicy otworu 1,5 mm).

2. Mikroiniekcja mRNA do cytoplazmy

Uwaga: Opisany tutaj system mikroiniekcji wywodzi się z tego zgłoszonego przez Kressmanna i Birnstiela22.

  1. Przygotować cRNA z odpowiednich cDNA kodujących podjednostki receptora α4β2δ GABAA przez transkrypcję in vitro, dodanie ogona poli (A+) i kwantyfikację RNA za pomocą elektroforezy żelowej23.
  2. Pipety do mikroiniekcji należy przygotować z kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,0 mm), średnica wewnętrzna 0,58 mm (ID), długość 100 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. Odłamać końcówki szklanych naczyń włosowatych pod mikroskopem za pomocą mikromanipulatora i mikrofilamentu, aby uzyskać średnicę końcówki 12 - 15 μm ze ściętą końcówką.
  3. Napełnij pipety do mikroiniekcji olejem parafinowym za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, a następnie zamontuj pipetę do mikroiniekcji na domowym aparacie do mikroiniekcji (Rysunek 2).
    UWAGA: Domowy aparat do wtrysku oleju hydraulicznego składa się z silnika grilla sterowanego za pomocą przełącznika nożnego. Dodatkowy przełącznik zmienia tryb obracania silnika. Silnik ten napędza mikrometryczną (0,5 mm/obrót), która przesuwa lub cofa tłok szklanej strzykawki o pojemności 10 μl. Wstrzyknięcie odbywa się z prędkością około 3 obr./min, a 0,5 obrotu odpowiada wstrzyknięciu 50 nL do pęcherzyka. Końcówka strzykawki jest połączona z grubościenną rurką z politetrafluoroetylenu, która z kolei jest połączona z igłą iniekcyjną za pomocą bardzo krótkiego odcinka rurki Tygon. Kapilara iniekcyjna jest utrzymywana przez uchwyt wiertarski, który jest sterowany przez mikromanipulator. Cały układ wypełniony jest olejem parafinowym. Należy unikać wszelkich pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one uszkodzić układ wtryskowy. Zestaw jest oświetlony zimnym źródłem światła. Do kontroli optycznej wymagany jest mikroskop stereoskopowy. Mieszki włosowe są wizualizowane w zimnym świetle za pomocą mikroskopu stereoskopowego (powiększenie 40X). Skuteczność zestawu do iniekcji jest testowana poprzez wstrzyknięcie radioaktywnego znacznika do oocytów Xenopus. Na jedno wstrzyknięcie należy dostarczyć objętość 45 - 55 nl.
  4. Za pomocą pipety ze sterylną plastikową końcówką przetestuj konfigurację, umieszczając kroplę sterylnej wody na czystym wnętrzu odpornego na wilgoć tworzywa termoplastycznego (2 x 2 cm). Zanurz końcówkę pipety iniekcyjnej w tej kropli, a następnie obróć silnik, aby cofnąć tłok (podciśnienie wewnątrz pipety iniekcyjnej).
    UWAGA: Woda powinna dostać się do pipety i utworzyć widoczną powierzchnię styku z olejem.
  5. Wycofać końcówkę pipety z kropli i przyłożyć nadciśnienie do wnętrza pipety iniekcyjnej. Na końcówce pipety iniekcyjnej powinna utworzyć się kropelka wody.
  6. Przygotuj się do wstrzyknięcia pęcherzyków, ustawiając je w jednej linii z biegunami roślinnymi skierowanymi do góry w szczelinach nylonowej siatki (G: 0,8 mm) przyklejonej do dna szalki Petriego (60 mm) pokrytej MBS.
  7. Dozuj 2 μl mRNA za pomocą pipety ze sterylną plastikową końcówką na czyste wnętrze tworzywa termoplastycznego. Przenieś mRNA do pipety iniekcyjnej, wywierając podciśnienie na wnętrze pipety iniekcyjnej.
  8. Umieścić pipetę iniekcyjną na pojedynczym mieszku włosowym za pomocą mikromanipulatora.
  9. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań w środek bieguna roślinnego i wstrzyknąć 50 nL mRNA z natężeniem przepływu 0,6 μl/min, wywierając nadciśnienie do wnętrza pipety. Odczekaj 5 - 10 s przed wyjęciem końcówki pipety iniekcyjnej z mieszków włosowych, aby uniknąć ucieczki mRNA.
    UWAGA: mRNA należy wstrzyknąć w roślinny (żółtawy) biegun, aby uniknąć wstrzyknięcia do jądra, które znajduje się na półkuli zwierzęcej.
  10. Przenieść wstrzyknięte pęcherzyki na nową szalkę Petriego (35 mm) wypełnioną 2 ml MBS. Umieścić naczynie w chłodziarce do wina ustawionej na temperaturę 18 °C. Inkubować wstrzyknięte pęcherzyki przez 1-7 dni przed zapisem, w zależności od tożsamości nowo wyrażonego białka.

3. Usuwanie mieszków włosowych (Rysunek 3)

UWAGA: Jak wspomniano powyżej, oocyt pokryty warstwą witeliny, komórkami pęcherzykowymi i tkanką łączną, która zawiera naczynia krwionośne24, jest znany jako "pęcherzyk". Wszystkie warstwy z wyjątkiem warstwy witeliny, która zapewnia stabilność mechaniczną, nie uniemożliwiając dostępu roztworów do powierzchni komórki, muszą zostać usunięte przed eksperymentami elektrofizjologicznymi. Pęcherzyk bez otaczających go warstw komórkowych był wcześniej określany jako "ogołocony" oocyt25. Ten etap jest zwykle wykonywany tego samego dnia, co eksperymenty elektrofizjologiczne.

  1. Przenieś dziesięć wstrzykniętych pęcherzyków do probówki ze szkła borokrzemianowego zawierającej 0,5 ml MBS, 1 mg / ml kolagenazy i 0,1 mg / ml inhibitora trypsyny. Zanurzyć probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 36 °C. Inkubować pęcherzyki przez 20 minut i od czasu do czasu wstrząsać probówkami.
  2. Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do drugiej probówki zawierającej 1 ml MBS w temperaturze pokojowej. Pozostaw je w probówce na około 10 sekund.
  3. Przenieść pęcherzyki do trzeciej probówki zawierającej 0,5 ml podwójnie stężonego MBS zawierającego 4 mM kwasu bis(2-aminoetyloetero)-glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA) i inkubować je przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Od czasu do czasu wstrząsać probówką.
    UWAGA: Roztwór hipertoniczny (podwójnie skoncentrowany MBS) służy do wywoływania kurczenia się oocytów w warstwach komórek pęcherzykowych, a tym samym do odrywania warstw komórek pęcherzykowych od oocytu; EGTA jest dodawana w celu zahamowania aktywności kolagenazy.
  4. Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do drugiej probówki zawierającej 1 ml MBS w temperaturze pokojowej. Pozostaw je w probówce na około 10 sekund.
  5. Przenieść oocyty na szalkę Petriego (o średnicy 35 mm) zawierającą 2 ml MBS. Pod mikroskopem stereoskopowym oddziel zewnętrzne otoczki od pęcherzyków, po prostu odpychając nagi oocyt za pomocą platynowej pętli.
    UWAGA: Zewnętrzne otoczki oocytów mocno przylegają do naczynia hodowlanego i można je łatwo oddzielić od oocytów. Niektóre oocyty spontanicznie tracą swoje zewnętrzne otoczki i zostaną odzyskane jako ogołocone oocyty. W wyniku tego zabiegu uzyskuje się w miarę stabilny preparat, który zachowuje kulisty wygląd oocytów.

4. Szybka zmiana roztworu wokół oocytu

  1. Przeprowadzić eksperyment z cęgami napięciowymi, jak opisanow punkcie 9,26.
  2. Zmień roztwór grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, obracając przełączniki perfuzji zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
    1. Roztwór perfuzyjny nanieść w dawce 6 ml/min przez szklaną kapilarnę o średnicy wewnętrznej 1,35 mm, której ujście znajduje się około 0,4 mm od powierzchni oocytu, aby umożliwić szybkie zmiany stężenia agonisty wokół oocytu.
      UWAGA: Tempo zmian zostało wcześniej oszacowane na 70% w czasie krótszym niż 0,5 s27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

oocyty Xenopus zostały mechanicznie wyodrębnione za pomocą platynowej pętli (Rysunek 1). Oocytom wstrzyknięto mikroiniekcję mRNA kodującego podjednostki receptora GABAA α4, β2, δ, 0,5:0,5:2,5 fmol/oocyt (ryc. 2). Po 4 dniach usunięto warstwy komórek pęcherzykowych (ryc. 3). Oocyty umieszczono pod napięciem -80 mV i wystawiono na działanie rosnących stężeń kwasu γ-aminomasłowego (GABA) w obecności ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody opisane w tym artykule odbiegają od tych stosowanych tradycyjnie7-9. Standardem jest wystawienie płatów jajnika na 1 do 2 godzin leczenia kolagenazą8; wyizolować nieuszkodzone, pozbawione oocytów; i wstrzyknąć im mRNA za pomocą komercyjnych urządzeń do iniekcji. Ta klasyczna procedura ma następujące wady: 1) Oocyty mogą zostać uszkodzone przez długą ekspozycję na wysokie stężenia kolagenazy. 2) Niestabilne, obnażone oocyty muszą być przechowywane do czasu eksperymentu. 3) Pozbawione komórek j...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki 315230_156929/1. M.C.M. jest stypendystą (Beca Chile Postdoctorado z CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NaClSigma71380
KClSigmaP-9541
NaHCO3SigmaS6014
MgSO4 SigmaM-1880
CaCl2 Sigma223560
Ca(NO3)2 SigmaC1396
HEPESSigmaH3375
Penicilin/streptomycynaGibco15140-148100 μ g penicyliny/ml i 100 μ g streptomycyna/ml
Platynowa pętla drucianadomowej roboty
Ściągacz do mikropipetZeitz-Instruments GmBHDMZ
Strzykawka Hamilton Hamilton8030010 μ L, Typ 701N
Grubościenne rurki z politetrafluoroetylenuLabmarket GmBH1,0 mm OD 
Olej parafinowySigma18512
Siatka nylonowa, G: 0,8 mm ZBF Zü bogatsza Beuteltuchfabrik AG
Rurka ze szkła borokrzemianowego Corning99445-12PYREX
Collagenase NB Standard GradeSERVA17454
Inhibitor trypsyny typu I-SSigmaT-9003
EGTASigmaE3389
Szklana kapilaraJencons (Scientific) LTD.H15/101,35 ID mm (do perfuzji), alternatywna firma: Harvard Apparatus Limited
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoHarvard Apparatus Limited30-00191,0 OD x  0,58 ID x 100 Długość mm (do mikroiniekcji) 
Kapilara ze szkła borokrzemianowego Harvard Apparatus Limited30-00441,2 OD x 0,69 ID x 100 Długość mm (dla dwuelektrodowego cęgowania napięciowego)
γ-Kwas aminomasłowy (GABA)SigmaA2129
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC)SigmaP2016
grillowyFaulhaber Mikrosilnik prądu stałego Typ 2230 z przekładnią Typ 22/2
śruba mikrometrycznaKiener-Wittlin10400TESA, AR 02.11201
Sterylne plastikowe pipety transferoweSaint-Amand  Mfg.222-20S
silnik

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
  2. Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
  3. Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
  4. Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
  5. Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
  6. Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
  7. Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
  9. Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
  10. Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
  11. Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943(2016).
  12. Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
  13. Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
  14. Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
  15. Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
  16. Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
  17. Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
  18. Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
  19. Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
  20. Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
  21. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
  22. Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
  23. Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
  24. Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
  25. Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
  26. Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
  27. Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus OocytesMicroinjection TechniqueFollicular Cell RemovalElectrophysiological ExperimentsGABA A ReceptorscRNA InjectionCollagenase TreatmentSolution Change MethodOocyte IsolationVoltage Clamp Recording

Related Articles