Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55063

⸱

15 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego badania było sformułowanie technologii, które pozwalają na skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach NK (natural killer). Transdukcja lentiwirusowa ludzkich lub mysich pierwotnych komórek NK za pośrednictwem dekstranu skutkuje wyższą wydajnością ekspresji genów. Ta metoda transdukcji genów znacznie poprawi manipulację genetyczną komórkami NK.

Streszczenie

Skuteczna transdukcja określonych genów do komórek NK była dużym wyzwaniem. Udane transdukcje mają kluczowe znaczenie dla określenia roli genu będącego przedmiotem zainteresowania w rozwoju, różnicowaniu i funkcjonowaniu komórek NK. Ostatnie postępy związane z chimerycznymi receptorami antygenowymi (CAR) w immunoterapii nowotworów podkreślają potrzebę opracowania skutecznej metody dostarczania genów egzogennych do limfocytów efektorowych. Skuteczność transdukcji genów za pośrednictwem lentiwirusa do pierwotnych ludzkich lub mysich komórek NK pozostaje znacznie niska, co jest głównym czynnikiem ograniczającym. Ostatnie postępy w stosowaniu polimerów kationowych, takich jak polibren, wskazują na poprawę skuteczności transdukcji genów w limfocytach T. Jednak produkty te nie poprawiły wydajności transdukcji komórek NK. Praca ta pokazuje, że dekstran, rozgałęziony polisacharyd glukanu, znacznie poprawia wydajność transdukcji pierwotnych komórek NK u ludzi i myszy. Ta wysoce powtarzalna metodologia transdukcji zapewnia kompetentne narzędzie do transdukcji ludzkich pierwotnych komórek NK, co może znacznie poprawić kliniczne zastosowania dostarczania genów, a tym samym immunoterapię nowotworów opartą na komórkach NK.

Wprowadzenie

Komórki NK (Natural killer) są główną populacją limfocytarną wrodzonego układu odpornościowego1. Komórki NK funkcjonują jako pierwszoliniowi obrońcy odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko nowotworom i infekcjom2,3,4. Komórki NK odgrywają również kluczową rolę w rozwoju tolerancji poprzez wydzielanie silnych cytokin i chemokin5. Ze względu na ich silną zdolność do celowania i eliminowania komórek nowotworowych, prowadzonych jest wiele badań klinicznych mających na celu ocenę ludzkich komórek NK pochodzących od dawcy jako adoptywnej immunoterapii raka6,7. W przeciwieństwie do limfocytów T, biologia rozwojowa komórek NK nie została jeszcze dobrze scharakteryzowana8. Ten brak wiedzy jest częściowo spowodowany brakiem skutecznych technik, które dostarczałyby geny będące przedmiotem zainteresowania do mysich lub ludzkich pierwotnych komórek NK. Z tych powodów większość badań nad komórkami NK przeprowadzono w liniach komórkowych, a nie w komórkach pierwotnych. W związku z tym kluczowe znaczenie ma potrzeba niezawodnego i wydajnego protokołu transdukcji pierwotnych komórek NK z genami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Ogólnym celem tego badania było sformułowanie spójnej i niezawodnej metody, za pomocą której pierwotne ludzkie lub mysie komórki NK mogłyby być transdukowane za pomocą lenti- lub retrowirusów.

Wcześniejsze badania, które próbowały rozwiązać ten problem, zostały przeprowadzone, głównie przy użyciu przejściowej transformacji pierwotnych komórek NK. Obejmuje to transfekcję plazmidu9,10, wirus Epsteina-Barr (EBV)/retrowirusowy wektor hybrydowy11, wektory krowianki12,13 i chimeryczne wektory adenowirusowe Ad5/F3514. Pomimo skromnej skuteczności tych technik, przejściowy charakter transdukcji sprawia, że nie nadają się one do długoterminowego wykorzystania genetycznie zmodyfikowanych komórek NK. W kilku ostatnich badaniach wykorzystano wektory retrowirusowe do transdukcji komórek NK, co wymagało wielu cykli infekcji w celu osiągnięcia akceptowalnego poziomu ekspresji genów11,15. W przeciwieństwie do wektorów retrowirusowych, wektory lentiwirusowe mogą wykorzystywać maszynerię importu jądra komórkowego gospodarza do translokacji kompleksu wstępnej integracji wirusa do jądra. Jest to główny czynnik ograniczający replikację wirusa w komórkach niedzielących się, do których należą pierwotne komórki NK.

Interakcje między różnymi receptorami na powierzchni komórki a cząsteczkami wirusa umożliwiają jego wychwyt do komórki. Początkowe zaangażowanie między białkami otoczki wirusa a pokrewnymi receptorami gospodarza może być ograniczone ze względu na potencjalne ujemne ładunki istniejące między tymi dwoma. Uzasadnieniem wielu technik transdukcji jest to, że dodanie polimerów kationowych, takich jak polibren (Pb), siarczan protaminy (PS) lub dekstran, może nadać dodatni ładunek receptorom na powierzchni komórki, a tym samym zwiększyć wiązanie białek otoczki wirusa. Zwiększy to wydajność fuzji i wychwyt cząstek wirusa przez komórki16. Chociaż doniesiono, że Pb lub PS mogą poprawić transfer genów w limfocytach T17, ich zastosowanie nie miało żadnego wpływu na wydajność transdukcji pierwotnych komórek NK. Ponadto nie przeprowadzono analizy porównawczej między tymi odczynnikami przy użyciu pierwotnych komórek NK. W tym badaniu porównano wydajność transdukcji trzech polimerów kationowych. Wyniki pokazują, że spośród tych trzech polimerów kationowych tylko dekstran znacząco zwiększa wydajną transdukcję wirusa zarówno do mysich, jak i ludzkich pierwotnych komórek NK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dla zwierząt były zgodne z humanitarnym i etycznym traktowaniem zwierząt i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Badań Biomedycznych (BRC) Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. Wykorzystanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) Instytutu Badań Krwi Centrum Krwi Wisconsin, Milwaukee, WI.

1. Myszy, linie komórkowe i wektory

  1. Kup myszy C57BL/6 od komercyjnych dostawców. Utrzymuj kolonie myszy w warunkach wolnych od patogenów i używaj samic i samców myszy w wieku od 6 do 12 tygodni. Pozyskaj pozbawione elementów pozwalających na identyfikację PBMC pochodzące od ludzi ze źródeł zatwierdzonych przez IRB.
  2. Znieczulić zwierzęta mieszaniną 20-30% v/v izofluranu w glikolu propylenowym (1,2-propanodiol, klasa USP) w celu znieczulenia myszy. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy myszy są pod narkozą.
  3. Aby poddać zwierzęta eutanazji, należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy po indukcji znieczulenia.
    1. Powstrzymaj myszy, mocno chwytając jedną ręką podstawę ogona. Umieść solidny długopis typu kij lub kciuk i pierwszy palec drugiej ręki na karku, u podstawy czaszki.
    2. Aby spowodować zwichnięcie, popchnij rękę przytrzymującą głowę zwierzęcia do przodu i popchnij w dół, ciągnąc do tyłu ręką trzymającą podstawę ogona. Sprawdź skuteczność zwichnięcia poprzez wyczucie separacji tkanki szyjki macicy.
  4. Trzymaj zwierzęta w komorze/klatce przez co najmniej 5 minut i usuwaj je tylko wtedy, gdy nie występuje aktywność oddechowa lub gdy brakuje wykrywalnego bicia serca.
  5. Zdobądź ogniwa K562 i YAC-1 od dostawców komercyjnych i utrzymuj je w RPMI1640 podłożu zawierającym 10% inaktywowanego termicznie FBS. Okresowo testuj te linie komórkowe, aby wykluczyć możliwość zanieczyszczenia mykoplazmą.

2. Przygotowanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych

  1. Hodowla 5 × 106 komórek 293T przez noc w kolbie T75 cm2 zawierającej roztwór 20 ml pożywki RPMI1640 z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 5% z 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i 0,001% β-merkaptoetanolu. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5,2% CO2 .
  2. Zbierz komórki 293T za pomocą trypsyny (0,025%)/EDTA (1 mM) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 5 ml trypsyny/EDTA do PBS i inkubować kolby przez 10 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić odłączenie komórek 293T od kolb T75 cm2.
    1. Zbierz oderwane komórki i umyj je dwukrotnie w PBS, aby usunąć wszelkie ślady trypsyny i EDTA. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj liczbę komórek do miliona komórek na ml.
  3. Transfekcja komórek 293T18 za pomocą 3,95 μg psPAX2, 1,32 μg pMD2G i 5,26 μg pLEP-GFP-Puro (wygenerowanych wewnętrznie w BRI przez klonowanie promotora EF1alpha z pWPI zamiast promotora CMV w pLenti CMV-GFP-Puro)19.
    1. Przygotuj 1 ml 150 mM NaCl plus 63 μl 0,6 mg/ml polietylenininu (PEI; 25 000 kD, liniowo). Dobrze wymieszaj, a następnie dodaj plazmidy i wymieszaj. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać do komórek.
    2. 16 godzin po transfekcji zastąp pożywkę do transfekcji świeżą pożywką plus 4,5 mM maślanu sodu. Zebrać supernatant zawierający wirusa 48 godzin po transfekcji i zagęścić przez nocne odwirowanie w ilości 5 000 × g. Zobacz tabelę materiałów.
  4. Określ miana wirusa za pomocą komórek 293T, wykonując seryjne rozcieńczenia i oznaczając metodą cytometrii przepływowej 72 godziny po transdukcji20. Wykorzystanie ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) jako miary do ilościowego określenia miana wirusa.

3. Oczyszczanie i ekspansja mysich pierwotnych komórek NK

  1. Oczyść mysie pierwotne komórki NK21. Krótko mówiąc, przepuść jednokomórkowe zawiesiny śledziony przez kolumny z wełny nylonowej, aby zubożyć przylegające populacje składające się z komórek B i makrofagów.
  2. Posiewaj nieprzylegające populacje eluowane z kolumny z wełny nylonowej, która zawiera mysie komórki NK z 1,000 U / ml interleukiny (IL)-2 w RPMI1640 pożywce z 10% FBS, 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 5% z 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i 0,001% β-merkaptoetanolu (RPMI1640 kompletne podłoże).
  3. Zmienić pożywkę z kolb w 4 dniu tej hodowli, aby usunąć nieprzylegające limfocyty T i NKT; komórki, które pozostają przyklejone do kolb, są w dużej mierze komórkami NK. Dodać 20 ml świeżej RPMI1640 kompletnej pożywki i 1000 U/ml IL-2, aby uzupełnić kolby.
  4. Sprawdź czystość mysich hodowli komórek NK w dniu 7 za pomocą cytometrii przepływowej z markerami specyficznymi dla komórek NK20 przy użyciu preparatów z ponad 95% populacji CD3-NK1.1+.

4. Oczyszczanie i ekspansja ludzkich pierwotnych komórek NK

  1. Wyizoluj PBMC według gradientu gęstości z kożuchów zdrowych ochotników. Na krótko, ostrożnie ułóż 35 ml na wpół rozcieńczonych (HBSS) komórek na 15 ml gradientu gęstości w 50-mililitrowej probówce kanonicznej. Wirować przy 400 × g przez 30 minut w temperaturze 20 °C w obracającym się wirniku kubełkowym bez hamulca.
  2. Użyj komercyjnych zestawów selekcji ujemnej opartych na przeciwciałach do oczyszczania ludzkich pierwotnych komórek NK zgodnie z protokołem producenta.
  3. Po wyizolowaniu należy oznaczyć czystość preparatów komórek NK za pomocą analiz immunofluorescencyjnych. Preparaty z komórek NK barwić przeciwciałami anty-CD3 2 μg/ml i 2 μg/ml anty-CD56 w temperaturze 4 °C przez 20 min. Umyj komórki dwukrotnie populacjami komórek PBS NK oznaczonymi przez brak CD3 i obecność CD56 na powierzchni komórki.
  4. Inkubować preparaty komórkowe z przeciwciałami przez 20 minut w temperaturze 4 °C, przemyć PBS i przeanalizować w cytometrze przepływowym. Do testów transdukcji genów należy używać preparatów z komórek NK o czystości ponad 85%20.

5. Transdukcja mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK za pomocą lentiwirusa

  1. Zawiesić mysie lub ludzkie pierwotne komórki NK na 24-dołkowej płytce w 0,5 × 105/ml pożywki w obecności supernatantu lentiwirusa GFP przy 5, 10 i 20 wielokrotności infekcji (MOI) oraz w obecności Pb (8 μg/ml), PS (8 μg/ml) lub dekstranu (8 μg/ml).
  2. Odwirować płytki o masie 1 000 × g przez 60 minut.
  3. Bez dekantacji supernatantu należy hodować komórki przez noc (16-18 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5,2% CO2 .
  4. Przemyć 10 ml PBS i ponownie zawiesić w 2 ml kompletnej pożywki RPMI1640 hodowlanej w obecności IL-2 (300 j./ml).
  5. Przetestuj pierwotną cytotoksyczność komórek NK u ludzi i myszy odpowiednio wobec K562 i YAC-1, wykonując 51testów uwalniania chromu (Cr) w różnych proporcjach efektora do komórki docelowej22.
    1. Krótko mówiąc, podaj milionowi komórek docelowych 50 μCi znakowanego radioaktywnie chromianu sodu 51Cr. Podczas 4-godzinnego czasu inkubacji pobierają 51Cr do białek komórkowych. Pod koniec inkubacji umyj komórki, aby usunąć wszelkie niewłączone etykiety.
    2. Oblicz specyficzną lizę komórek nowotworowych przez ilość bezwzględnego, spontanicznego i eksperymentalnego uwolnienia 51Cr z komórek docelowych.
      UWAGA: Obliczenie procentu lizy swoistej z eksperymentów z pentapikatami przeprowadzono przy użyciu następującego równania: % lizy swoistej = ((51Cr średnie uwalnianie eksperymentalne - 51Cr średnie uwalnianie spontaniczne) / (51Cr średnie maksymalne uwalnianie - 51Cr średnie uwalnianie spontaniczne)) х 100, gdzie "51Cr średnie spontaniczne uwalnianie" to 51Cr uwalniane z komórek docelowych przy braku komórek NK i "51Cr średnie maksymalne uwalnianie" oznacza 51Cr uwalniane z komórek docelowych po lizie przez 2 N kwas solny (HCl).
  6. Zbierz transdukowane komórki NK w 7 dniu, delikatnie stukając w kolby.
    1. Aktywuj pobrane komórki za pomocą miareczkowanych stężeń mAb anty-NKG2D (A10) związanych z płytkami, pokrywając 96-dołkowe, wysoce absorbujące białka płytki polistyrenowe stężeniami 2,5 μg/ml mAb anty-NKG2D przez noc.
    2. Przemyć każdą studzienkę 100 μl PBS trzy razy przed dodaniem pierwotnych komórek NK.
  7. Zebrać supernatanty hodowli za pomocą pipety wielokanałowej między 16 a 18 godzinami po aktywacji, aby określić ilościowo cytokiny, takie jak IFN-γ. Wygeneruj krzywe standardowe przy użyciu rekombinowanych cytokin dostarczonych z zestawami do testów immunoenzymatycznych (ELISA).
  8. Przetestuj żywotność komórek NK za pomocą barwienia aneksyny-V/7-amino-aktynomycyny D (7-AAD)23 i określ procent komórek martwiczych wśród przekształconych komórek NK za pomocą cytometru przepływowego.
    1. Aby przeprowadzić ten test, należy zebrać mysie i ludzkie komórki NK cztery dni po transdukcji, przemyć dwa razy 10 ml zimnego PBS w ilości 500 × g przez 5 minut każdy i inkubować z zestawem Annexin-V (PE)/7-AAD.
  9. Użyj odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej do analizy danych. Wybierz populację żywych komórek i przeanalizuj ekspresję GFP (kanał FITC) jako miarę transdukcji wirusa24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dekstran indukuje wydajny transfer genów wektora lentiwirusowego w pierwotnych komórkach NK człowieka i myszy

Ludzkie komórki NK zostały wyizolowane i oczyszczone z PBMC (z czystością powyżej 85%) i inkubowane przez noc z rIL-2 300 U/mL. Te pierwotne komórki NK poddano następnie transdukcji lentiwirusem GFP przy różnych wielokrotnościach infekcji (MOI; 3, 10 i 20 IU na komórkę) w płytkach 24-dołkowych w obecności 8 µg/mL Pb, PS lub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to pokazuje, że zastosowanie dekstranu jako kationowego środka polimerowego zwiększa skuteczność transdukcji lentiwirusowej zarówno mysich, jak i ludzkich pierwotnych komórek NK. Ponadto inne czynniki kationowe, takie jak Pb lub PS, nie mają zauważalnego wpływu na dostarczanie wektorów wirusowych do ludzkich pierwotnych komórek NK. Wcześniej wykazano, że Pb może zwiększać transdukcję genów w ludzkich limfocytach T17. Wyniki te sugerują jednak, że ani Pb, ani PS nie mają podobnej wydajności...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy twierdzą, że nie ma finansowego konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Lucii Sammarco i jej stoisku z lemoniadą Lulu za inspirację, motywację i wsparcie. Prace te były częściowo wspierane przez NIH R01 AI102893 i NCI R01 CA179363 (SM); NHLBI-HL087951 (Szwajcarska Republika Ludowa); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W.); Fundacja Alex Lemonade Stand (S.M.); Program HRHM Funduszu MACC (S.M.; S.R.; M.S.T.); Fundacja Rodziny Mikołajów (S.M.); rodzina Gardetto (S.M.); Program Stypendialny Hyundai (M.S.T.); Hyundai Nadzieja na kołach (S.R.); Fundusz MACC (M.S.T. i S.M.); Instytut Badań nad Dziećmi, MCW (S.R.); oraz Nagroda im. Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DekstranSigma-Aldrich90-64-91-9
polibren (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
siarczan protaminy (PS)Sigma-Aldrichp3369
TrypsynaCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Płodowa surowica bydlęcaATALANTAS11150
PenicylinaCorning30-001-CI
B-merkaptoetanolSIGMAM3148
pirogronian soduCorningMT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )eBioscience14-7311-85
Propidium lodding roztwór barwiącyBD51-66211E
Lipofektamina 3000Thermo FisherL3000015
IsofluranPHOENIXNDC 57319-559-05
Zestaw do negatywnej selekcji komórek NKKomórka macierzysta19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
MyszyJakson664
Komórki 293TATCCCRL-3216
Kolby T75Cornnig430641U
przeciwciałach Zestawy do negatywnej selekcjiKomórki macierzyste19055
51Testy uwalniania chromu (Cr)Perkin Elmer'sNEZ030
Zestawy ELISAEbioscience00-4201-56
Maślan soduSigma5887-5G
Liniowe polinaukipolietylenowe23966-2
FicollGE Nauki przyrodnicze17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV
oparte na

Bibliografia

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95(2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94(2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529(2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki NKwzmocnienie dekstranemcytometria przep ywowaizolacja kom rekanaliza cytokindostarczanie gen wzastosowania w immunoterapiimiano wirusa
Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.