Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Podsumowanie

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Streszczenie

Skuteczność potencjalnych terapii przeciwbakteryjnych musi być wykazana na zwierzęcych modelach infekcji jako część procesu odkrywania i rozwoju, najlepiej w modelach, które naśladują zamierzone wskazania kliniczne. Opisano metodę wywoływania silnych zakażeń płuc u immunokompetentnych szczurów i myszy, która pozwala na ocenę leczenia w modelu poważnego zapalenia płuc wywołanego przez S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae lub A. baumannii. Zwierzęta są znieczulane, a inokulum na bazie agaru jest umieszczane głęboko w płucach poprzez niechirurgiczną intubację dotchawiczą. Powstała infekcja jest spójna, powtarzalna i stabilna przez co najmniej 48 godzin i do 96 godzin w przypadku większości izolatów. Badania z dostępnymi do obrotu lekami przeciwbakteryjnymi wykazały dobrą korelację między skutecznością in vivo a podatnością in vitro oraz zaobserwowano zgodność między celami farmakokinekicznymi/farmakodynamicznymi określonymi w tym modelu a klinicznie akceptowanymi celami. Chociaż nauka techniki wymaga początkowej inwestycji czasu, można ją wykonać szybko i efektywnie po osiągnięciu biegłości. Korzyści płynące z modelu obejmują wyeliminowanie wymogu neutropenicznego, zwiększenie odporności i odtwarzalności, możliwość badania większej liczby patogenów i izolatów, poprawę elastyczności w projektowaniu badań oraz ustalenie trudnej infekcji u immunokompetentnego gospodarza.

Wprowadzenie

Ocena skuteczności potencjalnych kandydatów na leki w zwierzęcych modelach infekcji jest kluczowym elementem procesu odkrywania leków przeciwbakteryjnych. Badania skuteczności in vivo dostarczają ważnych danych do podejmowania decyzji w całym okresie prac odkrywczych, począwszy od wyjaśnienia zależności struktura-aktywność (SAR) i optymalizacji serii ołowiowych substancji chemicznych, poprzez określenie charakterystyki farmakokinetycznej i farmakodynamicznej (PK/PD) związków oraz wsparcie w doborze dawki do rozwoju klinicznego i zatwierdzenia przez organy regulacyjne. W tym celu w literaturze opisano liczne modele zakażeń zwierzęcych. Jednym z najczęstszych i najszerzej stosowanych modeli jest neutropeniczne zakażenie uda myszy, które zostało zapoczątkowane przez Eagle^{1, 2}, a później rozszerzone przez Vogelmana i Craiga^{3, 4}. Model ten okazał się nieoceniony w określaniu punktów granicznych podatności bakterii oraz w dostarczaniu celów farmakokinekicznych/farmakokinetycznych, które pomagają w dawkowaniu u ludzi. Istnieje wiele przykładów, w których zdolność predykcyjna tego modelu została udowodniona^4-7. Jednak jedną z wad modelu infekcji uda jest brak bezpośredniego związku z infekcjami płuc. Obecnie kładzie się większy nacisk na dopasowanie miejsca infekcji w modelach zwierzęcych do miejsca infekcji u ludzi; W związku z tym, aby badać związki stosowane w leczeniu zapalenia płuc, idealnie jest wykorzystać model infekcji płuc u zwierząt.

Kilka metod wywoływania infekcji płuc u zwierząt laboratoryjnych zostało opisanych i wykorzystanych do badań skuteczności przeciwbakteryjnej, w tym inhalacja donosowa, aspiracja drogą ustno-gardłową, ekspozycja na aerozol i chirurgiczne inokulowanie dotchawicze⁸. W wielu przypadkach zwierzęta (zwłaszcza myszy) muszą najpierw zostać poddane działaniu neutropenii, aby uzyskać silną infekcję płuc. Pomimo tego poważnie obniżonego stanu odporności, liczba patogenów i szczepów bakteryjnych, które wywołują żywe infekcje u gryzoni, jest ograniczona. Na przykład skuteczne wykrycie Haemophilus influenzae lub Acinetobacter baumannii w modelach^{zapalenia płuc 9, 10} może być trudne, a nawet bardziej zjadliwe patogeny, takie jak Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae, mogą stanowić wyzwanie ^11-13.

W 1991 roku Smith opisał model infekcji płuc u immunokompetentnych szczurów odsadzonych, u którego infekcja była ustalana przez wszczepienie bakterii bezpośrednio do płuc za pomocą prostej, niechirurgicznej metody intubacji dotchawiczej¹⁴. Jagoda i wsp. Później zmodyfikowano metodę infekowania myszy¹⁵. Stosując inokulum na bazie agaru, ta technika inokulacji wywołuje silne infekcje płuc zarówno u immunokompetentnych szczurów, jak i myszy z S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii. Jest podatny na szeroki zakres izolatów, w tym te, które zawierają różne determinanty oporności i te, które nie wywołują żywej infekcji innymi drogami inokulacji. Pozwala również na określenie skuteczności u zwierząt immunokompetentnych, co jest bardziej istotne niż tradycyjny neutropeniczny model myszy dla populacji pacjentów, którzy nie mają poważnie obniżonej odporności. Spójność i niezawodność tego modelu w odniesieniu do wielu patogenów i izolatów sprawia, że doskonale nadaje się on do badań nad skutecznością przeciwbakteryjną.

Protokół

Wszystkie procedury są zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi GSK (IACUC) i spełniają lub przewyższają standardy Amerykańskiego Stowarzyszenia Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC), Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych oraz wszystkich lokalnych i federalnych przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt.

UWAGA: O ile nie określono inaczej, wszystkie procedury powinny być wykonywane z zachowaniem techniki aseptycznej.

1. Hodowla izolatów bakteryjnych

1. Przygotuj od 3 do 6 płytek agarowych z S. pneumoniae lub H. influenzae, ponieważ kultura bulionowa na ogół nie zapewnia wystarczającej ilości materiału do zaszczepienia.
   1. Wyjąć zamrożoną kulturę podstawową z magazynu w temperaturze -80 °C, całkowicie rozmrozić i rozprowadzić do 100 μl na płytce na tryptyczny agar sojowy uzupełniony krwią owczą (S. pneumoniae) lub na agar czekoladowy (H. influenzae) przy użyciu standardowych technik mikrobiologicznych. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 lub} bez niego.
2. Przygotuj kultury bulionowe z K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii.
   1. Wyjąć zamrożoną kulturę podstawową z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C, całkowicie rozmrozić i poddzielić 100 μl bulionu na 50 ml bulionu do infuzji mózgowo-sercowej (BHI). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (około 120 obr./min).
   2. [Opcjonalnie] Jeśli pożądana jest hodowla w fazie logarytmicznej, podwielokrotność 1 ml z otrzymanej kultury przez noc do 50 ml świeżego bulionu BHI. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (około 120 obr./min).

2. Przygotuj zawiesiny bakterii soli fizjologicznej

1. Na wszystkich etapach przygotowania zawiesiny (2.1-2.3) należy użyć sterylnego roztworu soli fizjologicznej w temperaturze między powietrzem otoczenia a temperaturą 37 °C. Zebrać nocny wzrost S. pneumoniae lub H. influenzae z płytek agarowych, zeskrobując kolonie z powierzchni za pomocą sterylnej pętli. Zebrany materiał przenieść do 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do uzyskania mętnej, nieprzezroczystej zawiesiny i delikatnie wirować aż do uzyskania jednorodności.
2. Odwirować 50 ml końcowych kultur bulionowych K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii przeznaczonych do inokulacji (np. kultury nocne lub w fazie logarytmicznej) przez 5 minut przy 4 500 x g. Usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić. Zawiesić osad w co najmniej 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i delikatnie przemieszać, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
3. W razie potrzeby zawiesinę należy rozcieńczyć za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać gęstość w zakresie od 8 do 9 log₁₀ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml. Usunąć podwielokrotność do oznaczania jtk/ml. Seryjnie rozcieńczyć i pokryć podwielokrotność podwielokrotnością zgodnie z opisem w sekcjach 7.5 i 7.6.

3. Przygotuj inokulum na bazie agaru

1. Przygotuj małą butelkę (około 50 ml) agaru odżywczego zgodnie z instrukcjami producenta lub rozpuść butelkę stałego agaru odżywczego, który był wcześniej przygotowany i przechowywany. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury około 50 °C.
2. Przetransportować płynny agar oraz wszystkie niezbędne narzędzia i sprzęt do procesu infekcji do miejsca zabiegu, w którym zwierzęta zostaną zakażone. Utrzymuj małą łaźnię wodną ustawioną na 42 °C w okolicy.
3. Pozwolić, aby agar osiągnął temperaturę około 50 °C, a następnie przelać 9 ml do sterylnej probówki o odpowiedniej wielkości, aby zmieściła się w łaźni wodnej. Pozostawić tę probówkę w łaźni wodnej do momentu, gdy agar osiągnie temperaturę około 42 °C. Upewnij się, że woda znajduje się na takiej głębokości, która pokryje powierzchnię agaru w pojemniku, ale nie dotknie nakrętki lub pokrywki.
4. Dodać 1 ml zawiesiny bakteryjnej soli fizjologicznej z kroku 2.3 do probówki zawierającej 9 ml agaru w łaźni wodnej. Zakryj rurkę, odwróć kilka razy do wymieszania i włóż ją z powrotem do łaźni wodnej.

4. Znieczulanie, intubacja i szczepienie zwierząt

UWAGA: Zaleca się stosowanie swoistych, wolnych od patogenów (SPF), immunokompetentnych samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 100 - 120 g lub samców myszy CD-1 o wadze 20 - 25 g. Zapewnij wszystkim zwierzętom jedzenie i wodę ad libitum i trzymaj je społecznie na zrębkach drzewnych lub innej chłonnej ściółce w standardowych 12-godzinnych cyklach światła i ciemności.

1. Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów należy zaopatrzyć się i wysterylizować metalową kaniulę i rurkę polietylenową o rozmiarze odpowiednim dla gatunku zwierzęcia. Zaopatrz się w sterylne jednorazowe strzykawki o pojemności 1 ml i sterylne jednorazowe igły o rozmiarze 25.
   Uwaga: Strzykawki i igły należy zawsze wyrzucać do pojemnika na ostre przedmioty.
   1. W przypadku szczurów kup lub wyprodukuj metalową kaniulę o długości około 12 cm, średnicy wewnętrznej 0,9 - 1,0 mm i średnicy zewnętrznej 1,0 - 1,2 mm i wygiętej pod kątem około 45° na jednym końcu. Wytnij rurkę polietylenową o długości od 11 do 12 cali o średnicy wewnętrznej 0.4 mm i średnicy zewnętrznej 0.8 mm. (Patrz rysunek 1A.)
   2. W przypadku myszy kup rurkę do karmienia zwierząt #20. Usuń kulkę z końca rurki, chwytając ją szczypcami i ostro pociągając, a następnie delikatnie zegnij koniec pod kątem około 45°. Wytnij rurkę polietylenową o długości od 11 do 12 cali o średnicy wewnętrznej 0.28 mm i średnicy zewnętrznej 0.61 mm. Kup również i wysterylizuj szklaną strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 100 μl i metalową igłę do mikroiniekcji o rozmiarze 30. (Patrz rysunek 1B.)
   3. Umieść metalową kaniulę w szklanej, zakręcanej probówce i autoklaw standardowymi metodami w celu sterylizacji. Namocz i przechowuj pocięte odcinki rurki polietylenowej w zakrytej zlewce zawierającej alkohol.
2. Przygotuj powierzchnię roboczą i urządzenie do intubacji.
   1. Umieść czystą jednorazową matę na powierzchni roboczej, w pobliżu łaźni wodnej. Przenieś metalową kaniulę w szklanej rurce do przechowywania na tę powierzchnię. Zdejmij nasadkę z rurki do przechowywania i wsuń koniec "uchwytu" kaniuli do otwartego końca tubki.
   2. Za pomocą sterylnych kleszczy wyjmij jeden odcinek rurki polietylenowej ze zlewki i włóż ją przez wnętrze sterylnej metalowej kaniuli, upewniając się, że porusza się swobodnie. Załóż sterylną jednorazową igłę o rozmiarze 25 (dla szczurów) lub wysterylizowaną metalową igłę o rozmiarze 30 szklanej strzykawki do mikroiniekcji (dla myszy) na wolnym końcu rurki polietylenowej, wsuwając igłę na kilka mm w rurkę. (Patrz rysunek 1A dla szczurów i rysunek 1B dla myszy).
   3. Umieść znaki prowadzące zarówno na metalowej kaniuli, jak i rurki polietylenowej, aby wskazać głębokość wprowadzenia u zwierzęcia, postępując zgodnie z procedurą intubacji opisaną poniżej na pojedynczym zwierzęciu poddanym eutanazji. Otwórz klatkę piersiową w celu obserwacji, a następnie umieść metalową kaniulę w odpowiedni sposób i odpowiednio przesuń rurkę polietylenową (zgodnie z opisem w sekcji 4.7). Za pomocą nieusuwalnego długopisu zaznacz metalową kaniulę w miejscu, w którym styka się z pyskiem zwierzęcia, oraz rurkę polietylenową w miejscu, w którym styka się z górną częścią metalowej kaniuli, aby pomóc w prawidłowym umieszczeniu u pozostałych zwierząt.
3. W dygestorium (lub przy użyciu odpowiedniego systemu oczyszczania) należy znieczulić do 6 zwierząt jednocześnie w zamkniętej komorze zasilanej ≤5% izofluranem w 1,5 l/min tlenu, aż do zahamowania odruchu wymiotnego (około 1 min).
   UWAGA: Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek doświadczeń należy ustalić bezpieczną dawkę i czas ekspozycji na izofluran w określonych stosowanych warunkach (np. wielkość/rodzaj komory i wielkość/gatunek/szczep zwierzęcia), aby zapobiec niezamierzonemu narażeniu letalnemu.
4. Napełnij sterylną jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml (dla szczurów) sterylnym roztworem soli fizjologicznej, umieszczając sterylną końcówkę w soli fizjologicznej i odciągając tłok. Napełnij sterylną szklaną strzykawkę do mikroiniekcji (dla myszy) zgodnie z poniższym opisem. Przymocować strzykawkę do igły umieszczonej na rurki polietylenowej i przepłukać całą objętość soli fizjologicznej przez rurkę, aż strzykawka zostanie opróżniona.
   1. Aby napełnić strzykawkę do mikroiniekcji (dla myszy), należy całkowicie wyjąć metalowy tłok i igłę (zamontowane na rurki polietylenowej) ze strzykawki i odłożyć je na bok.
   2. Napełnij sterylną jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej (jak opisano powyżej) i przymocuj sterylną jednorazową igłę o rozmiarze 25G. Wprowadzić igłę do górnej części strzykawki do mikroiniekcji (w miejscu, w którym zostanie wprowadzony metalowy tłok) i wcisnąć tłok jednorazowej strzykawki, aż wypełni strzykawkę do mikroiniekcji solą fizjologiczną.
   3. Wyrzucić jednorazową strzykawkę i igłę, które zostały użyte do napełnienia strzykawki do mikroiniekcji, do pojemnika na ostre przedmioty. Ponownie przymocować metalową igłę do mikroiniekcji (założoną na rurkę polietylenową) do końcówki strzykawki do mikroiniekcji i ponownie włożyć metalowy tłok, wciskając tak długo, aż cała objętość soli fizjologicznej zostanie przepłukana przez strzykawkę i rurkę.
5. Napełnić strzykawkę inokulum na bazie agaru z pojemnika w łaźni wodnej i przepłukać agar przez rurkę, aż rurka zostanie zalana (np. całkowicie wypełniona agarem).
   1. W przypadku szczurów wyjąć igłę o rozmiarze 25 (zamontowaną na rurki polietylenowej) z jednorazowej strzykawki. Wyrzuć zużytą strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty. Napełnij nową, sterylną jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml inokulum na bazie agaru z pojemnika w łaźni wodnej, umieszczając sterylną końcówkę w inokulum i odciągając tłok. Ponownie założyć igłę (zamontowaną na rurki polietylenowej) i przepłukać agar przez rurkę, naciskając tłok tylko do momentu, gdy rurka zostanie całkowicie wypełniona agarem.
   2. W przypadku myszy należy wyjąć metalową igłę do mikroiniekcji (założoną na rurkę polietylenową) i metalowy tłok ze strzykawki do mikroiniekcji i odłożyć na bok. Używając sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml i sterylnej jednorazowej igły o rozmiarze 25G, napełnić strzykawkę do mikroiniekcji inokulum na bazie agaru z pojemnika w łaźni wodnej, stosując procedurę napełniania opisaną w sekcji 4.4. Ponownie zamocuj metalową igłę do mikroiniekcji (zamontowaną na rurki polietylenowej), włóż metalowy tłok i przepłucz agar przez rurkę, aż rurka zostanie całkowicie wypełniona agarem.
6. Usuń jedno zwierzę z komory anestezjologicznej. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na macie jednorazowego użytku z głową po prawej stronie i ogonem po lewej, jak pokazano na rysunku 1C.
7. Za pomocą urządzenia do intubacji (tj. metalowej kaniuli wyposażonej w rurkę polietylenową) należy zaintubować zwierzę i wprowadzić kaniulę do dużego płata lewego płuca (patrz rysunek 1D).
   1. Włóż wolny koniec metalowej kaniuli do pyska zwierzęcia. Obróć kaniulę tak, aby wolny koniec był ustawiony pod kątem do góry i delikatnie wsuń ją do tchawicy, ostrożnie omijając struktury krtani lekkim ruchem skręcającym. Potwierdź wprowadzenie do tchawicy, a nie do przełyku, delikatnie przesuwając kaniulę lekko do przodu i do tyłu kilka razy, jednocześnie dotykając pierścieni tchawicy lewym palcem wskazującym, jak pokazano na rysunku 1C.
   2. Gdy kaniula dotrze do rozwidlenia, w którym tchawica rozdziela się na lewe i prawe oskrzel, wykonaj lekki ruch skręcający w kierunku lewej strony zwierzęcia, aby upewnić się, że kaniula została wprowadzona do lewego oskrzela. Przesuń metalową kaniulę do momentu, aż koniec znajdzie się w połowie lub trzech czwartych w dół lewego płuca, używając wcześniej umieszczonego znacznika prowadzącego, aby potwierdzić, że osiągnięto odpowiednią głębokość.
   3. Po założeniu metalowej kaniuli przesuń rurkę polietylenową o kilka mm. Użyj wcześniej umieszczonego znacznika prowadzącego na rurce, aby upewnić się, że jest ona wysunięta tylko na tyle daleko, aby wyjść z końca metalowej kaniuli i nie przebić płuca.
8. Mając obie kaniule na miejscu, użyj dołączonej strzykawki, aby wkroplić 100 μl (dla szczurów) lub 20 μl (dla myszy) zawiesiny agarowej głęboko do dużego płata lewego płuca (patrz rycina 1D). Wyciągnąć kilka mm rurki polietylenowej, a następnie delikatnie wyjąć nienaruszone urządzenie do intubacji. Umieść go z powrotem w szklanej tubie do przechowywania i przenieś zwierzę do nowej klatki, aby wyzdrowiało.
9. Kontynuować znieczulanie, intubację i szczepienie pozostałych zwierząt.
   1. Pomiędzy partiami znieczulonych zwierząt należy wyjąć igłę (założoną na rurkę) ze strzykawki. W przypadku szczurów należy wyrzucić zużytą jednorazową strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty i napełnić nową, sterylną jednorazową strzykawkę z inokulum w łaźni wodnej. W przypadku myszy należy ponownie napełnić tę samą szklaną strzykawkę do mikroiniekcji z inokulum w łaźni wodnej, stosując technikę napełniania opisaną w sekcji 4.4.
   2. Jeśli agar zacznie gęstnieć w urządzeniu do intubacji, przepłucz cały pozostały agar przez rurkę. Wyjąć igłę ze strzykawki (pozostawiając igłę założoną na rurkę polietylenową). Postępować zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 4.4 przepłukać ciepłą, sterylną sól fizjologiczną przez urządzenie do intubacji, powtarzając w razie potrzeby w celu całkowitego usunięcia wszelkich zatorów. Opróżnić strzykawkę z soli fizjologicznej i ponownie przygotować inokulum agarowe, jak opisano w sekcji 4.5.
   3. Obliczyć końcowe inokulum bakteryjne na zwierzę, stosując jtk wyznaczony na podstawie zawiesiny soli fizjologicznej (patrz sekcja 2.3), końcowego współczynnika rozcieńczenia zawiesiny soli fizjologicznej do agaru (np. dziesięciokrotnie) oraz objętości wkroplonej zwierzętom (np. 100 μl dla szczurów lub 20 μl dla myszy).

5. Oceniaj zwierzęta pod kątem potencjalnego błędnego zaszczepienia lub innych zdarzeń niepożądanych

1. Uważnie obserwować wszystkie zwierzęta podczas intubacji, wkraplania agaru i powrotu do zdrowia po znieczuleniu, aby ocenić potencjalną niewłaściwą inokulację. Natychmiast poddać eutanazji (zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC) każde zwierzę, które krwawi, wykazuje zaburzenia oddychania (takie jak trudności w oddychaniu lub sapanie), nie porusza się normalnie po klatce lub nie wydaje się mieć jasnych oczu i zdrowia po powrocie do zdrowia po znieczuleniu.
2. Jeśli dojdzie do spontanicznego zaprzestania oddychania (zwykle gdy inokulum nie zostanie umieszczone wystarczająco głęboko i zablokuje drogi oddechowe), należy potwierdzić zgon przez obserwację i przeprowadzić wtórną metodę eutanazji (taką jak zwichnięcie szyjki macicy lub torakotomia).
3. Zminimalizuj czas, w którym zwierzęta są narażone na izofluran, ponieważ znieczulenie jest wymagane tylko przez kilka minut, aby wykonać zabieg. Jeśli stosowane są środki znieczulające do wstrzykiwań, należy upewnić się, że zwierzęta są pod obserwacją aż do całkowitego wybudzenia. Umieść zwierzęta, zwłaszcza myszy, w ciepłym środowisku w celu rekonwalescencji podczas stosowania środków znieczulających do wstrzykiwań.
4. Obserwuj zwierzęta co najmniej dwa razy dziennie w okresie badania pod kątem następujących objawów chorób układu oddechowego: wyraźny oddech, piloerekcja, zmniejszona aktywność i obniżona temperatura ciała. Natychmiast poddać eutanazji (zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC) każde zwierzę, które jest w stanie agonalnym, doświadcza trudności w oddychaniu lub niewydolności oddechowej, ma zauważalnie obniżoną temperaturę ciała po kontakcie, nie jest w stanie lub nie chce się poruszać lub nie może dotrzeć do jedzenia i wody.

6. Przeprowadzaj zabiegi testowe

1. Przygotować i przeprowadzić leczenie testowe zgodnie z planowanym projektem badania. Podawanie leków należy rozpocząć po 1 lub 2 godzinach od zakażenia (lub jeszcze bardziej opóźnić leczenie, jeśli pożądane jest wyższe wyjściowe obciążenie bakteryjne). Szczegółowe informacje na temat przygotowania i podawania terapii testowych nie mogą być podane, ponieważ zależy to od celu badania, a także od właściwości każdego indywidualnego leczenia. (Patrz rysunek 3 jako example.)
2. Odłóż na bok jedną grupę zakażonych, nieleczonych zwierząt, aby służyły jako podstawowa grupa kontrolna. Należy wymienić obciążenie bakteryjne płuc tych zwierząt w momencie rozpoczęcia leczenia dla innych grup, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 7.
3. W przypadku analiz farmakokinetyczności/PD należy ocenić profil farmakokinetyczny podanego leczenia (leków) we krwi i (lub) tkankach zakażonych zwierząt. Szczegółowe procedury dotyczące badań farmakokinetycznych wykraczają poza zakres tego artykułu.

7. Wylicz żywotne bakterie z płuc

1. Poddać eutanazji jedną grupę nieleczonych zwierząt w momencie rozpoczęcia leczenia dla pozostałych grup (wartość wyjściowa) i wszystkich pozostałych zwierząt pod koniec okresu badania (zwykle 24, 48 lub 96 godzin po zakażeniu) poprzez narażenie wziewne na stopniowo rosnące poziomy dwutlenku węgla w zamkniętej komorze lub metodą alternatywną, zgodnie z zaleceniami lokalnych wytycznych IACUC. Zweryfikuj zgon poprzez obserwację i wykonaj wtórną metodę eutanazji (taką jak zwichnięcie szyjki macicy lub torakotomia).
2. Ułóż zwierzęta w pozycji leżącej na czystej jednorazowej macie i dokładnie zwilż futro na klatce piersiowej alkoholem.
3. Za pomocą sterylnych nożyczek przetnij skórę, leżącą pod spodem warstwę mięśniową i klatkę piersiową równolegle do mostka, aby otworzyć jamę klatki piersiowej. Delikatnie chwyć płuca sterylnymi kleszczami i pociągnij, aby je usunąć, w razie potrzeby używając nożyczek, aby oddzielić je od tchawicy. Umieść płuca na sterylnej gazie, aby wchłonąć nadmiar krwi. Jeśli serce również zostało usunięte, wyciąć je i wyrzucić.
4. Zrób małe nacięcia w płucach sterylnymi nożyczkami, aby odsłonić wewnętrzne sekcje i użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić płuca (oraz wszelkie kawałki, które zostały przypadkowo odcięte) na dnie torby do blendera laboratoryjnego. Na krótko przetocz gruby okrągły przedmiot (taki jak długopis lub marker) na zewnątrz torby, aby zetrzeć chusteczkę. Odpipetuj 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do torebki, umieść torebkę w blenderze laboratoryjnym i uruchom blender laboratoryjny na wysokich obrotach przez 2 minuty.
5. Przenieść homogenizowane próbki ze zmiksowanych torebek do probówek lub płytek za pomocą pipety. Rozcieńczyć homogenat dziesięciokrotnie, dzieląc 1-częściowy homogenat na 9-częściowy roztwór soli fizjologicznej (np. 100 μl homogenatu na 900 μl soli fizjologicznej). Otrzymaną zawiesinę ponownie rozcieńczyć dziesięciokrotnie w podobny sposób. Kontynuować rozcieńczanie każdej nowo otrzymanej zawiesiny kolejnym dziesięciokrotnym współczynnikiem, aż do uzyskania co najmniej 6 seryjnych rozcieńczeń z oryginalnego homogenatu.
6. Trzykrotnie odpipetować podwielokrotności po 20 μl każdy ze wszystkich rozcieńczeń na płytkach agarowych sojowych tryptykazy uzupełnionych krwią owczą (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii) lub na płytkach z agarem czekoladowym (H. influenzae). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z CO 2 lub bez CO₂ . (Patrz rysunek 1E, aby zapoznać się z przykładem płytki wynikowej).
7. Policz kolonie w każdej z trzech kontrprób w pierwszym rozcieńczeniu, które zawiera "policzalną" liczbę (tj. nie za dużo kolonii, aby rozsądnie je policzyć). Obliczyć średnią wartość z trzech powtórzeń. Oznaczyć jtk na płuca, mnożąc średnią wartość przez 50 (w celu uwzględnienia posiewu 20 μl całkowitego 1 ml homogenatu) i uwzględniając końcowy współczynnik rozcieńczenia z oryginalnego homogenatu, w którym zliczono kolonie.

Wyniki

Wymagane narzędzia, orientacja zwierzęcia i głębokość intubacji są pokazane na rysunku 1. Pokazano również reprezentatywny przykład kolonii rosnących na płytce agarowej po seryjnym rozcieńczeniu i trzykrotnym posiewie próbki homogenatu płuc. Wzrost obciążenia bakteryjnego kilkoma logarytmami₁₀ CFU powyżej wyjściowych kontroli jest zwykle obserwowany w zakażonych płucach dla większości izolatów bakteryjnych, nawet po 96 godzinach od zakażenia, a zmienność między zwierzętami jest niska (ryc. 2). W przypadku niektórych H. influenzae wzrost może być niewielki; jednak infekcja nie powinna zacząć ustępować samoistnie w ciągu 48 lub 96 godzin (ryc. 2B). Ten model infekcji płuc może być wykorzystany podczas optymalizacji serii chemicznych ołowiu w celu wsparcia SAR, jak pokazano na rysunku 3 dla reprezentatywnych związków dwóch różnych serii^{16, 17}. Zapewnia spójną, powtarzalną metodę oceny PK/PD u zwierząt immunokompetentnych i została wykorzystana do określenia, że wolny obszar leku pod krzywą stężenie-czas nad minimalnym stężeniem hamującym (fAUC/MIC) korelował ze skutecznością nowego inhibitora deformylazy polipeptydowej (PDF) przeciwko S. pneumoniae i H. influenzae (Figura 4). Ponadto określono docelowe wartości fAUC/MIC dla zastoju i redukcji CFU o 1 log₁₀ w porównaniu z kontrolami wyjściowymi w odniesieniu do 11 izolatów S. pneumoniae i 5 izolatów H. influenzae (Tabela 1)¹⁸. Połączenie tego modelu infekcji z systemem dostarczania leków w celu odtworzenia ludzkich profili farmakokinetycznych u szczurów tworzy potężne narzędzie do oceny schematów dawkowania u ludzi przed badaniami klinicznymi. Przykład tego podsumowano w Tabeli 2, która pokazuje, że preparat amoksycyliny-klawulanianu o przedłużonym uwalnianiu był bardziej skuteczny niż istniejące schematy dawkowania dla organizmów o podwyższonych wartościach MIC¹⁹.

Rycina 1: Niechirurgiczna intubacja dotchawicza. Pokazane są narzędzia do intubacji szczura (A) i myszy (B). Po znieczuleniu zwierzę powinno być ustawione tak, jak pokazano na rysunku C, z głową po prawej stronie i ogonem po lewej, jeśli osoba wykonująca technikę jest praworęczna. Delikatnie przyłóż lewy palec wskazujący do gardła, aby pomóc w badaniu dotykowym pierścieni tchawicy w celu potwierdzenia prawidłowego umieszczenia kaniuli. Inokulum powinno być umieszczone głęboko w lewym płucu, jak pokazano w widoku brzusznym płuca szczura (D). Kolonie rosnące na agarze po seryjnym rozcieńczeniu i posianiu próbki powinny wyglądać podobnie do tych pokazanych w E. Rycina 1D, Copyright © Gill Smith [Laboratory Animals, tom 25 (1991), G. Smith, Prosta niechirurgiczna metoda wkraplania dooskrzelowego w celu ustalenia infekcji dróg oddechowych u szczura, strony 46 - 49]¹⁴. Przedruk za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne przykłady rozwoju bakterii w płucach zakażonych zwierząt. Średnie dane dotyczące odchylenia standardowego CFU ± od N=5 zwierząt/grupę przedstawiono dla różnych izolatów S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) i A. baumannii (E). Pierwszy słupek każdej pary (jasnoszary) to wyjściowe obciążenie bakteryjne po 1 lub 2 godzinach od zakażenia, podczas gdy drugi słupek to kontrola wzrostu na koniec badania po 48 godzinach od infekcji (ciemnoszary) lub 96 godzin po zakażeniu (). Nie zastosowano żadnych metod cenzurowania danych; W związku z tym wyniki te obejmują dane ze wszystkich 5 zwierząt w grupie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ocena skuteczności różnych szeregów chemicznych podczas optymalizacji ołowiu. Modele infekcji płuc z wykorzystaniem opisanych technik wykorzystano do zbadania zależności między strukturą a aktywnością w ramach programu topoizomerazy bakteryjnej typu IIA. Obiecujące związki 7 i 1 oceniano odpowiednio pod kątem wrażliwych na chinolony (A)¹⁶ lub opornych na chinolony (B)¹⁷ izolatów S. pneumoniae. Każdy symbol reprezentuje CFU wyznaczoną z płuc jednego szczura, z liniami reprezentującymi średnią grupy i odchylenie standardowe. Dolna granica oznaczalności (LLQ) wynosiła 1,7 log₁₀ CFU/płuca. Związki zważono (56 lub 112 mg czystej wolnej cząsteczki macierzystej), rozpuszczono w 9 ml sterylnej wody, rozcieńczono 3 ml w 3 ml wody (1:1) i podawano przez zgłębnik doustny 1 ml / 125 g szczura dwa razy dziennie (w odstępie 6 - 7 godzin) przez 2 dni, zaczynając od 1 godziny po zakażeniu. Nieleczone grupy kontrolne (NTC) pobierano próbki po 1 godzinie od zakażenia na początku badania lub leczono solą fizjologiczną i pobierano próbki pod koniec badania (48 godzin) w przypadku kontroli wzrostu. Rysunek 3A przedrukowany z Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, tom 21, T.J. Miles et al., Novel cyclohexyl-amides as posilne leki przeciwbakteryjne skierowane do topoizomerazy bakteryjnej typu IIA, strony 7483 - 7488, Copyright (2011)¹⁶, za zgodą Elsevier. Rysunek 3B przedrukowany z Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, tom 26, T.J. Miles et al., Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as posilne inhibitory topoizomerazy bakteryjnej typu IIA, strony 2464 - 2469, Copyright (2016)¹⁷, za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Charakterystyka PK/PD nowego inhibitora PDF. Modele Emax stworzono na podstawie danych dotyczących skuteczności w zakresie dawek u immunokompetentnych myszy zakażonych w płucach izolatami S. pneumoniae (A) lub H. influenzae (B) w celu określenia docelowych wartości PK/PD dla nowego inhibitora PDF¹⁸. Okręgi reprezentują średnie obciążenie bakteryjne od 4-5 myszy / grupę leczonych różnymi dawkami związku. Przeprowadzono analizy w celu skorelowania skuteczności z 24-godzinnym AUC (otwarte okręgi) lub AUC/MIC (wypełnione okręgi). Przedruk za zgodą, Copyright American © Society for Microbiology, [Środki przeciwdrobnoustrojowe i chemioterapia, tom 60, 2016, strony 180 - 189]¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

			Zastój		1-log10 redukcji
organizm	MIC (μg/ml)	R2 dla Dopasowanie linii (%)	fAUC (fAUC)	fAUC/MIC	fAUC (fAUC)	fAUC/MIC	Maksymalna liczba zabójstw (Log10 redukcji)
S. pneumoniae
Numer katalogowy 10127	0,25	99,9	2.0	Rozdział 8.1	3.6	14,4	2.8
Numer katalogowy: 1316009S	0,25	96,1	6,5	26,0	Rozdział 15.1	60,3	1.8
ATCC10813	0,5	100	8.4	Rozdział 16,9	Rozdział 22,2	44,5	Rozdział 1.2
Numer katalogowy: 1307007S	1	95,8	Rozdział 16.1	Rozdział 16.1	20,1	20,1	2.7
ATCC6303	1	99,8	Pytanie 19,8	Pytanie 19,8	Pytanie 24,8	Pytanie 24,8	2.8
Rok 1629	cyfra arabska	100	Rozdział 15,8	7,9	Rozdział 21,2	Rozdział 10.6	2.4
298443	cyfra arabska	99,9	26,5	Rozdział 13,2	31,0	15,5	2.3
336808	cyfra arabska	Rozdział 86	8,2	Rozdział 4.2	19,0	Pytanie 9,5	2.6
Numer telefonu 338860	cyfra arabska	99,5	2.9	1,5	6.7	3.4	2.8
340449	cyfra arabska	94,6	8,0	Wersja 4.0	Norma 14,9	7,4	2.1
L11259	cyfra arabska	100	7,1	3,5	9,0	Rozdział 4.5	2.0
Średnia ± SD	NAa	nie	11,0 ± 7,5	11,0 ± 7,9	17,0 ± 8,2	od 19,5 ± 17,8	2,3 ± 0,5
mediana	nie	nie	8,2	Rozdział 8.1	19,0	14,4	2.4
H. influenzae (wirus grypy)
1998-100-126H	1	99,7	7,3	7,3	Pytanie 13,4	Pytanie 13,4	2.9
503-008H	1	99,8	7,1	7,1	Pytanie 13,9	Pytanie 13,9	2.7
08003H	cyfra arabska	99,9	14,5	7.2	Rozdział 16,7	8.3	2.7
Zobacz materiał H128	cyfra arabska	96,6	Rozdział 15,3	7,6	26,0	13,0	2.7
19001H	4	Nr 91,9	Rozdział 14,8	3.7	Nr 37,3	9,3	Wersja 3.0
Średnia ± SD	nie	nie	11,8 ± 4,2	6,6 ± 1,6	21,5 ± 10,2	11,6 ± 2,6	2,8 ± 0,1
mediana	nie	nie	14,5	7.2	Rozdział 16,7	13,0	2.7
brak danych, nie dotyczy.

Tabela 1: Cele PK/PD dla nowego inhibitora PDF przeciwko izolatom S. pneumoniae i H. influenzae.Docelowe AUC i AUC/MIC wolnego leku dla zastoju i zmniejszenia CFU o 1 log₁₀ w stosunku do wartości wyjściowej określono dla 11 S. pneumoniae i 5 H. influenzae u myszy immunokompetentnych zakażonych płucami i leczonych związkiem¹⁸. Dane te wykorzystano, aby pomóc w doborze dawek stosowanych u ludzi do badań klinicznych. Ta tabela została zaadaptowana i przedrukowana za zgodą, Copyright American © Society for Microbiology, [Środki przeciwdrobnoustrojowe i chemioterapia, tom 60, 2016, strony 180 - 189]¹⁸.

Grupa leczeniaA	Średnia log10 S. pneumoniae (CFU/płuco)b ± SD dla szczepu (AMX/CA MIC):
	05010S (2 μg/ml)	16001Sc (4 μg/ml)	16001S (4 μg/ml)	30005S (4 μg/ml)	20009S (4 μg/ml)	05003S (8 μg/ml)	404053 (8 μg/ml)	47003S (8 μg/ml)
kontrola	7,3 ± 0,4	7,0 ± 0,8	5.7 ± 1.2	7,1 ± 0,7	7,1 ± 0,4	6,4 ± 0,6	6,8 ± 0,4	6,0 ± 0,3
AMX/CA
2 000/125 mg dwa razy na dobę (stosunek 16:1)	≤ 1,7**	2,8 ± 1,2**	2,2 ± 0,8**	2,3 ± 0,9**	2,5 ± 0,9**	2,0 ± 0,9**	3,8 ± 1,4**	1,8 ± 0,2**
1,000/125 mg t.i.d. (stosunek 8:1)	Nt	Nt	2,8 ± 0,5**	2,7 ± 1,3**	3,3 ± 0,9**	4,9 ± 0,5**	6,6 ± 1,3	4,7 ± 0,7**
875/125 mg t.i.d. (stosunek 7:1)	Nt	Nt	3,0 ± 1,3*	2,1 ± 0,7**	3,2 ± 0,4**	5,2 ± 0,9*	6,4 ± 0,6	4,9 ± 0,4**
875/125 mg dwa razy na pokolenie (stosunek 7:1)	Nt	Nt	4,5 ± 1,2*	5,6 ± 1,3*	5,2 ± 0,7**	6,3 ± 0,7	6,4 ± 0,7	5,5 ± 0,4
500/125 mg t.i.d. (stosunek 4:1)	3,1 ± 1,3**	4,5 ± 0,9**	Nt	Nt	Nt	Nt	Nt	Nt
Azytromycyna, 1 000/500 mg o.d.	Nt	Nt	Nt	5,8 ± 2,0	7,1 ± 0,9	3,1 ± 1,0**	6,6 ± 0,4	6,0 ± 0,6
Lewofloksacyna, 500 mg s.d.	Nt	Nt	4,2 ± 0,8*	5,7 ± 0,8*	4,9 ± 0,8**	3,0 ± 1,3**	3,5 ± 0,2**	3,9 ± 0,8**
Grupa leczeniad	Średnia log10 H. influenzae (CFU/płuco) ± SD dla szczepu:
	H128 (β-laktamaza dodatnia)				Chesterfield (β-laktamaza ujemna, oporna na ampicylinę)
kontrola	6.4 ± 0.6				6.7 ± 0.6
AMX/CA
2 000/125 mg dwa razy na dobę (stosunek 16:1)	2.0 ± 0.7**				3.1 ± 0.9**
1,000/125 mg t.i.d. (stosunek 8:1)	2.1 ± 1.0**				3.6 ± 1.1**
875/125 mg t.i.d. (stosunek 7:1)	2.8 ± 1.3**				3.8 ± 1.3**
875/125 mg dwa razy na pokolenie (stosunek 7:1)	2.0 ± 0.8**				5.1 ± 1.1**
Azytromycyna, 1 000/500 mg o.d.	3.2 ± 1.7*				5.8 ± 1.1
Lewofloksacyna, 500 mg s.d.	≤ 1.7**				≤ 1.7**
a AMX/CA, klawulanian amoksycyliny; b.i.d., dwa razy dziennie; t.i.d., trzy razy dziennie; o.d., raz dziennie.
b Granica wykrywalności wynosiła <1,7; *, istotnie różniąca się od kontrolnej (P ≤ 0,05); **, istotnie różniąca się od kontrolnej (P ≤ 0,01); NT, nie testowany.
c Szczep 16001S został przetestowany w dwóch oddzielnych eksperymentach.
d Amoksycylina-klawulanian 500/125 mg (4:1) trzy razy dziennie nie był testowany przeciwko szczepom H. influenzae.

Tabela 2: Skuteczność odtworzonych profili ekspozycji na osocze ludzkie dla różnych schematów dawkowania amoksycyliny/klawulanianu. Dane uzyskane u immunokompetentnych szczurów zakażonych w płucach izolatami S. pneumoniae lub H. influenzae przy użyciu tego modelu wykazały, że ulepszona postać amoksycyliny-klawulanianu (2 000/125 mg dwa razy na dobę) była bardziej skuteczna niż standardowe schematy dawkowania przeciwko izolatom o podwyższonej wrażliwości in vitro ¹⁹. Ta tabela została zaadaptowana i przedrukowana za zgodą, Copyright American © Society for Microbiology, [Środki przeciwdrobnoustrojowe i chemioterapia, tom 49, 2005, strony 908 - 915]¹⁹.

Dyskusja

Aby uzyskać optymalny sukces w odtwarzaniu tego modelu infekcji, należy rozważyć następujące dodatkowe sugestie. Zjadliwość nowych izolatów można zwiększyć poprzez pasażowanie 2-3 razy in vivo przed zastosowaniem w badaniu. Zamrożone szczepy bakteryjne powinny być zawsze przygotowywane z pierwotnego źródła uzyskanego in vivo, z jak najmniejszą liczbą pasaży od oryginału, a ponowne zamrażanie lub ponowne użycie rozmrożonego wywaru jest odradzane. Wykorzystanie najnowszych izolatów klinicznych odzyskanych od pacjentów z zapaleniem płuc i/lub przygotowanie kultur w fazie logarytmicznej wzrostu może również pomóc w lepszym ustaleniu infekcji. Pięciokrotne rozcieńczenie do agaru (np. 2 ml zawiesiny soli dodanej do 8 ml agaru) może być użyte zamiast dziesięciokrotnego w celu zwiększenia inokulum bakteryjnego, a objętość inokulum można dostosować w zależności od wielkości zwierzęcia (np. 200 μl / zwierzę jest zwykle inokulowane u 250 g szczurów). Przed dodaniem zawiesiny bakteryjnej soli fizjologicznej do agaru (tj. na kroku 2.3), gęstość bakterii można przewidzieć lub oszacować za pomocą oględzin, wzorców MacFarlanda lub pomiarów gęstości optycznej. Pomocne jest zapoznanie się z charakterystyką wzrostu in vitro dla każdego izolatu przed przeprowadzeniem eksperymentów in vivo . Spójność w uprawie i obchodzeniu się z nimi umożliwia najdokładniejsze oszacowanie gęstości bakterii dla danego izolatu. Standardowe metody mikrobiologiczne, które różnią się od opisanych, takie jak alternatywne pożywki i homogenizatory tkankowe, mogą być stosowane odpowiednio do przygotowania inokulacji i liczenia bakterii z zakażonych tkanek.

Zdecydowanie zaleca się przygotowanie lub stopienie agaru dzień przed eksperymentem i przechowywanie go przez noc w oddzielnej łaźni wodnej ustawionej na 50 °C. Uprości to proces i pomoże zabezpieczyć agar przed zbyt wysoką temperaturą w momencie infekcji. Temperatura 41 - 42 °C zapewnia dobrą równowagę między utrzymaniem agaru w stanie ciekłym, bez bycia zbyt gorącym dla krótkotrwałego przetrwania bakterii. Jako możliwa alternatywa dla agaru odżywczego, agar szlachetny był z powodzeniem stosowany w niektórych eksperymentach. Jedna probówka inokulum agarowego jest zwykle wystarczająca na cały eksperyment (i jest zalecana), ale wiele probówek można przygotować do zakażenia dużej liczby zwierząt (np. więcej niż 60) lub gdy proces infekcji trwa dłużej niż 30 - 45 minut Jeśli wymaganych jest wiele probówek z inokulum, dodaj zawiesinę bakteryjną soli fizjologicznej do każdej probówki agaru, zgodnie z potrzebami. Zmniejsza to ryzyko, że długotrwała ekspozycja na podwyższoną temperaturę przed inokulacją wpłynie na przeżywalność i/lub kondycję bakterii. Należy zauważyć, że użycie wielu probówek z inokulum może również wymagać dodatkowych procedur randomizacji zwierząt. Jeśli to możliwe, należy zarazić wszystkie zwierzęta tym samym preparatem inokulum. Zaleca się dostosowanie wielkości eksperymentów do aktualnego poziomu zaawansowania w danej technice.

Wykwalifikowany naukowiec może zaintubować i zaszczepić zwierzę w czasie krótszym niż 30 sekund i zaszczepić do 5 - 6 zwierząt na partię (tj. za pomocą jednej strzykawki pełnej inokulum agarowego). Dla tych, którzy uczą się tej techniki, ważna jest szybkość, ponieważ agar zacznie krzepnąć; Jednak ważniejsze jest dokładne umieszczenie inokulum. Zacznij od 1 lub 2 zwierząt na partię i zwiększaj, gdy technika staje się bardziej znana. Zwierzęta kontynuują oddychanie podczas intubacji; Tak więc okno czasowe na zaszczepienie zależy od tego, jak szybko zwierzę wyzdrowieje po izofluranie, które powinno wynosić około 2 - 3 minut. Zwierzęta, które obudzą się podczas tego procesu, można ponownie znieczulić i spróbować po raz drugi, ale nie zaleca się tego wielokrotnie. Pomyślne zaszczepienie przy pierwszej próbie spodziewane jest u prawie 100% zwierząt po osiągnięciu biegłości. Zauważ, że łatwiej jest nauczyć się tej techniki najpierw na szczurach; Myszy są delikatniejsze, a mniejsze narzędzia są bardziej podatne na zablokowanie zestalonym agarem, jeśli nie są szybko manipulowane. Wstępne rozgrzanie strzykawek, rurki i soli fizjologicznej, a także utrzymywanie urządzenia do intubacji na ciepłej (nie gorącej) powierzchni, takiej jak poduszka grzewcza na niskim ustawieniu, może pomóc w zapobieganiu zestalaniu się agaru. Podczas nauki tej techniki pomocne jest również ćwiczenie prawidłowego umieszczania inokulum przy użyciu ciemnego barwnika (takiego jak skoncentrowany błękit metylenowy) zamiast zawiesiny bakteryjnej w agarze. Wykonaj procedurę zgodnie z opisem, ale poddaj zwierzę eutanazji natychmiast po zaszczepieniu barwnika (nie pozwalając zwierzęciu dojść do siebie między znieczuleniem a eutanazją). Przeanalizuj, aby określić, gdzie został umieszczony barwnik i odpowiednio dostosuj technikę.

Pierwszorzędowym punktem końcowym w tym modelu jest CFU z zakażonych płuc. Przeżywalność nie jest dobrym wskaźnikiem obciążenia bakteryjnego i nie jest zalecanym punktem końcowym. W badaniach skuteczności sugerowane N wynosi 5 - 6 zwierząt na grupę, ponieważ przewiduje się, że wykryje to różnice ≥1 log₁₀ CFU między grupami o co najmniej 90% mocy. Zwierzęta mogą być zarażane w grupach, tak że koledzy z klatki pozostają razem lub można śledzić prawdziwy proces randomizacji. Należy zauważyć, że jeśli grupy są przypisane według klatki, grupy powinny być zakażone w losowej kolejności, przy czym grupa kontrolna wzrostu na końcu badania została zainfekowana jako ostatnia (w celu potwierdzenia, że czas wystawienia na działanie podwyższonej temperatury w łaźni wodnej nie miał wpływu na przeżycie/sprawność bakterii). Nie powinny być konieczne żadne metody cenzurowania danych i nie zaleca się ich stosowania, z wyjątkiem natychmiastowego usunięcia zwierzęcia, które zostało ewidentnie błędnie zaszczepione na początku badania (przed rozpoczęciem jakiegokolwiek leczenia). Zwierzęta, które zostały poddane eutanazji przed zakończeniem badania, powinny zostać poddane próbce, a wyniki powinny zostać włączone do zbioru danych, chyba że prospektywnie zidentyfikowano ważny powód wykluczenia (tj. zdarzenie niezwiązane z zakażeniem lub leczeniem). Przenoszenie leków może mieć wpływ na niektóre próbki i jest ważnym czynnikiem we wszystkich modelach zakażeń in vivo . Jeśli związek jest podawany często, blisko czasu eutanazji lub ma długi okres półtrwania, może być obecny w homogenacie tkankowym w wystarczająco wysokim stężeniu, aby kontynuować zabijanie bakterii ex vivo podczas procesu liczenia bakterii (rozcieńczanie i posiewanie próbek lub na płytkach agarowych podczas inkubacji przez noc). Aby temu zapobiec, przed homogenizacją do próbki można dodać węgiel aktywny i/lub dodatek, który rozkłada cząsteczkę czynną bez uszkadzania komórek bakteryjnych. Inne metody obejmują odwirowanie próbek w celu usunięcia większości związku aktywnego (który powinien pozostać w supernatancie) oraz zastosowanie różnych schematów rozcieńczania i powlekania w celu wystarczającego rozcieńczenia związku czynnego do stężenia niehamującego.

Jak pokazują przykłady przedstawione na rysunku 2, model ten skutecznie indukuje infekcje płuc u gryzoni z szeroką gamą organizmów, w tym takich, które nie rosną dobrze w innych modelach (np. H. influenzae). Infekcje te są spójne i powtarzalne, co zmniejsza prawdopodobieństwo, że eksperymenty będą musiały zostać powtórzone z powodu niepowodzenia modelu i/lub słabej wydajności z danym izolatem. Chociaż zwierzęta są immunokompetentne, nie są w stanie szybko rozwiązać infekcji, jeśli w ogóle. Pozwala to na zwiększenie elastyczności w długości badania, ponieważ wiele izolatów utrzymuje żywotną infekcję przez co najmniej 96 godzin bez konieczności wielokrotnego wstrzykiwania w celu utrzymania neutropenii. Potencjalne korzyści z badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych zostały odnotowane wcześniej^{20, 21} i istnieją dowody na to, że w przypadku niektórych związków (np. oksazolidynonów) dane od gryzoni niebędących neutropenami mogą dokładniej przewidywać docelowe narażenie ludzi w porównaniu z tymi, którzy są neutropeniczni⁵. Wielofunkcyjna użyteczność modelu została przedstawiona na rysunkach 3 i 4 oraz w tabelach 1 i 2. Badania te są częścią dużego zbioru opublikowanych i niepublikowanych danych, które zostały wygenerowane za pomocą tego modelu w celu wsparcia wysiłków optymalizacyjnych^{16, 17, 22-24}, w celu porównania i potwierdzenia proponowanych schematów dawkowania u ludzi^{19, 25-29} oraz w celu charakterystyki PK/PD^{18, 30-32}. Chociaż model ten jest początkowo bardziej skomplikowany do przeprowadzenia w porównaniu z metodą inhalacji donosowej, istnieje wiele korzyści, jak opisano powyżej. Wraz z praktyką i rutynowym stosowaniem techniki powinny stać się proste do wykonania.

W niektórych badaniach można zauważyć, że obciążenie bakteryjne na początku badania było niższe niż zwykle docelowe w innych modelach infekcji płuc. Wynika to w dużej mierze z wymaganego rozcieńczenia do agaru i małej objętości prowokacyjnej, szczególnie u myszy. Należy jednak również zauważyć, że wzrost bakterii obserwowano we wszystkich przypadkach, nawet gdy początkowe obciążenie było stosunkowo niskie. Docelowe wyjściowe miano bakteryjne wynosi od 6 do 6,5 log₁₀ CFU/płuca (6,8 do 7,3 log₁₀ CFU/g tkanki u myszy na podstawie średniej masy płuc), co odpowiada gęstości oszacowanej u ludzi z ciężkim zapaleniem płuc³³. Wyższe obciążenie wyjściowe można osiągnąć poprzez dalszą koncentrację inokulum bakteryjnego lub opóźnienie rozpoczęcia podawania związku, aby umożliwić dodatkowy wzrost bakterii; Jednak zbyt duże zwiększenie obciążenia prowokacyjnego może prowadzić do nienormalnie ciężkiej i ostrej choroby (tj. zgonu w czasie krótszym niż 24 godziny), która jest oporna na wszystkie leczenie przeciwbakteryjne niezależnie od wrażliwości. Chociaż inokulum jest początkowo umieszczane preferencyjnie w lewym płucu zwierzęcia, infekcja na ogół rozprzestrzenia się w obu płucach. Postępująca choroba płuc, rozprzestrzenianie się bakterii na inne narządy i ostateczna zachorowalność są często obserwowane w przypadku S. pneumoniae, K. pneumoniae i P. aeruginosa. Co ciekawe, zakażenia H. influenzae i A. baumannii są zwykle bardziej ograniczone i rzadko prowadzą do śmierci po podaniu przepisanej inokulacji bakteryjnej.

Wyniki skuteczności uzyskane za pomocą tego modelu dobrze korelowały z profilami wrażliwości in vitro, a także ze zdefiniowanymi celami PK/PD. Zmniejszenie obciążenia bakteryjnego jest rutynowo obserwowane w przypadku izolatów uznanych za podatne na badany czynnik, podczas gdy te uważane za oporne nie wykazują żadnych zmian ani wzrostu bakterii powyżej wartości wyjściowej^{16, 17, 19, 24-29}. Badania na szczurach oceniające dwa chinolony i makrolid przy użyciu tego modelu³² wykazały, że docelowa wartość PK/PD wymagana do zmniejszenia liczby S. pneumoniae o 1 log₁₀ w porównaniu z wartością wyjściową była skorelowana z wartością docelową określoną u myszy z neutropenami i, co ważniejsze, z celami klinicznymi dla bakteryjnego zapalenia płuc nabytego przez społeczność^{6, 7, 34, 35}. Gepotydacyna, antybiotyk o nowym mechanizmie, została przetestowana przeciwko wielu S. pneumoniae i wymagała podobnego celu PK/PD dla zmniejszenia o 1 log₁₀ w tym modelu infekcji płuc³¹, jak wymaganego dla zmniejszenia o 1 log₁₀ w neutropenicznym modelu uda³⁶, gdy uwzględniono penetrację płuc (dane w aktach). Podobnie, cele PK / PD określone u myszy dla GSK2251052 przeciwko P. aeruginosa były spójne dla zastoju, 1- i 2-log-10 redukcji CFU między tym modelem płuc³⁰ a modelem neutropenicznego zakażenia uda, gdy rozważano penetrację płuc^{37, 38}. Korelacja z modelem neutropenicznego zakażenia płuc przy użyciu inokulacji donosowej była słaba; Jednak w tym badaniu nie wywołało GSK2251052 więcej niż statyczną odpowiedź³⁸. Może to być związane z wyższym poziomem inokulum bakteryjnego, które wynosiło 8 log₁₀ CFU/mysz w porównaniu z 6 log₁₀ CFU/mysz w neutropenicznych udach³⁷ i intubacji dotchawiczej³⁰. Gromadzenie takich danych ma kluczowe znaczenie dla analizy porównawczej, ponieważ umożliwia bezpośrednie porównanie z istniejącymi modelami i korelację z danymi klinicznymi w celu oceny zdolności predykcyjnych translacji. Szersze zastosowanie modelu intubacji dotchawiczej zakażenia płuc dostarczy dodatkowych danych do tego typu analiz.

Istnieje kilka ograniczeń tego immunokompetentnego modelu zapalenia płuc. Po pierwsze, nie nadaje się do oceny pojawienia się spontanicznej oporności, ponieważ wysoki poziom inokulum bakteryjnego zwykle wymagany do takich badań skutkuje zbyt ciężką infekcją. Po próbach osiągnięcia obciążenia bakteryjnego na poziomie 7 lub 8 log₁₀ CFU na początku badania, zaobserwowano szybką zachorowalność (tj. zwierzęta umierające w czasie krótszym niż 24 godziny) pomimo dokładnego mycia inokulacji w celu usunięcia wcześniej istniejących toksyn (dane w aktach). Być może uda się przezwyciężyć ten problem za pomocą większych gryzoni. Szczury, zwłaszcza cięższe (> 250 g), wydają się lepiej tolerować wyższą dawkę szczepionki w porównaniu z myszami i mogą być odpowiednie do tego typu badań. Drugim ograniczeniem jest to, że stosowanie agaru jako wzmacniacza infekcji może wykluczać użycie modelu do oceny niektórych interakcji gospodarz-patogen. Uważa się, że agar zapewnia chroniony punkt ogniskowy do czasu pełnego ustabilizowania się infekcji w płucach. Możliwe jest dostarczenie inokulum w roztworze soli fizjologicznej, a nie w agarze w celu przezwyciężenia tego problemu; Należy jednak zauważyć, że spowoduje to zakażenie tylko niektórymi izolatami. Po trzecie, aby osiągnąć biegłość w tej technice, wymagana jest stroma krzywa uczenia się. Procedura może być delikatna, szczególnie u myszy. Łatwo jest omyłkowo umieścić metalową kaniulę w przełyku, a nadmierna siła może doprowadzić do przebicia przełyku lub tchawicy. Wymagane jest również ostrożne umieszczenie inokulum, w przeciwnym razie zwierzęta mogą albo nie wyzdrowieć, albo nie zostać odpowiednio zainfekowane. Jednak dzięki cierpliwości i wytrwałości można stać się bardzo biegłym i wykonać technikę szybko, płynnie i dokładnie.

Usuwając wymóg neutropenii, zwiększając odporność i odtwarzalność, umożliwiając badaczom badanie większej liczby patogenów i izolatów, poprawiając elastyczność projektu eksperymentalnego i zapewniając trudną infekcję do scharakteryzowania farmakodynamiki zapalenia płuc, ten immunokompetentny model infekcji płuc stanowi istotną wartość dodaną dla społeczności zajmującej się odkrywaniem antybiotyków. Zwiększone wykorzystanie tego modelu przez dodatkowych badaczy pomoże w zapewnieniu niezbędnej analizy porównawczej, aby zyskał on szerszą akceptację i nadal dostarczał informacji pomocniczych dla właściwej interpretacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
TSA II Tryptikaza Agar sojowy z 5% krwią owczą	Becton Dickinson and Company	4321261
Chocolate II Agar	Becton Dickinson and Company	4321267
BBL Brain Heart Infusion Modified	Becton Dickinson and Company	299070
BBL Tryptikaza Rosół sojowy z 20% glicerolem	Becton Dickinson and Company	297808	nośniki do przechowywania zamrożony bulion
Pętla inokulacyjna	Nunc	251586
0,9% Chlorek sodu, USP	Baxter Healthcare Corporation	NDC 0338-0048-04
Difco Nutrient Agar	Becton Dickinson and Company	213000
30 ml wolnostojąca probówka wirówkowa z nakrętką	EverGreen Scientific	222-3530-G80
50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa 30 x 115 mm	Falcon, marka Corning	352070
14 ml polipropylenowa rurka z okrągłym dnem 17 x 100 mm	Falcon, narzędzie przewodnika	352059 marki
	Intek Services Ltd	GT01	wykonana na zamówienie metalowa kaniula dla szczurów
90' rurka Portex	SAI	POR-080-100	plastikowa kaniula dla szczurów
1 ml TB końcówka strzykawki	Becton Dickinson and Company
Igła PrecisionGlide 25 G x 5/8	Becton Dickinson and Company	305122
Igła do karmienia zwierząt - prosta 20 x 3" 2-1/4	Popper and Sons, Inc	7903	służąca do tworzenia metalowej kaniuli dla myszy
Rurki polietylenowe Intramedic	marki Clay Adams - Becton Dickinson and Company	427401	plastikowa kaniula do myszy
75 TN 5.0 i mikro; Strzykawka L 26s/2"/2	Hamilton	87930	Szklana strzykawka iniekcyjna HPLC
Rurka Pyrex, zakrętka do hodowli 25x150 z gumową wkładką	Corning	9825-25	do autoklawu/przechowywania kaniul metalowych
70% alkohol izopropylowy	Vi-Jon (Swan)	NDC 0869-0810-43
Izofluran, USP	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10
Stomacher	Seward	Stomacher80
Stomacher 80 klasycznych torebek	Seward	BA6040
Płytka testowa, 96 dołków, okrągłe dno	Costar, Corning Inc	3795	opcjonalnie, do seryjnego rozcieńczania
Blood Omni Plates	Hardy	#A127	opcjonalnie, prostokątne płytki krwinkowe