Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Summary

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Abstract

Koregulatory transkrypcyjne są niezbędne do efektywnej regulacji transkrypcji struktury chromatyny jądrowej. Koregulatory odgrywają różne role w regulacji transkrypcji. Należą do nich bezpośrednia interakcja z czynnikami transkrypcyjnymi, kowalencyjna modyfikacja histonów i innych białek oraz sporadyczna zmiana konformacji chromatyny. W związku z tym ustalenie stosunkowo szybkich metod identyfikacji białek, które oddziałują w tej sieci, ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia podstawowych mechanizmów regulacyjnych. Identyfikacja partnera wiążącego białko za pośrednictwem LC-MS/MS jest zwalidowaną techniką stosowaną do analizy interakcji białko-białko. Poprzez immunoprecypitację wcześniej zidentyfikowanego członka kompleksu białkowego za pomocą przeciwciała (czasami przeciwciała dla znakowanego białka), możliwe jest zidentyfikowanie jego nieznanych interakcji białkowych za pomocą analizy spektrometrii mas. W niniejszej pracy przedstawiono metodę przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji oddziaływań białkowych z udziałem kofaktorów jądrowych i ich partnerów wiążących za pośrednictwem LC-MS/MS. Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie transkrypcyjnych mechanizmów regulacyjnych docelowych czynników jądrowych.

Introduction

Interakcje białko-białko odgrywają ważną rolę w wielu funkcjach biologicznych. W związku z tym interakcje te są zaangażowane w transdukcję sygnału; transport białek przez błony komórkowe; metabolizm komórkowy; oraz kilka procesów jądrowych, w tym replikacja DNA, naprawa uszkodzeń DNA, rekombinacja i transkrypcja^1,2,3,4. Identyfikacja białek biorących udział w tych interakcjach ma zatem kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszego zrozumienia tych procesów komórkowych.

Immunoprecypitacja (IP) to sprawdzona technika używana do analizy interakcji białko-białko. Aby ułatwić identyfikację białek współimmunoprecypitowanych, często stosuje się spektrometrię mas^5,6,7,8,9. Poprzez celowanie w znanego członka kompleksu białkowego za pomocą przeciwciała, możliwe jest wyizolowanie kompleksu białkowego, a następnie zidentyfikowanie jego nieznanych składników za pomocą analizy spektrometrii mas. ARIP4 (białko 4 oddziałujące z receptorem androgenowym), koregulator transkrypcji, oddziałuje z białkami receptora jądrowego w celu aktywacji lub stłumienia docelowych promotorów w sposób zależny od kontekstu^9,10. Aby lepiej zrozumieć transkrypcyjne mechanizmy regulacyjne rządzące tymi czynnikami jądrowymi, opisujemy kompleksową metodę oczyszczania i identyfikacji białek oddziałujących z ARIP4 za pomocą systemu LC-MS / MS.

Protocol

1. Transfekcja

1. Wysiewaj komórki HEK293 na 100-milimetrowych płytkach hodowlanych (2 x 10⁶ komórek/naczynie). Hodowla komórek w zmodyfikowanej pożywce Eagle's firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 100 μg/ml streptomycyny i 100 jednostek/ml penicyliny. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia przetransfekuj komórki 10 μg plazmidu ARIP4 znakowanego FLAG, używając 40 μl odczynnika do transfekcji zgodnie ze wskazówkami producenta¹¹.

2. Ekstrakcja białka

1. Około 36 godzin po transfekcji umyj komórki lodowatym PBS i zbierz komórki za pomocą skrobaka. Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować ją w temperaturze 8 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5-krotności objętości osadu 0,4 M buforu KCl (Bufor o wysokiej zawartości soli: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl₂, 10% glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-merkaptetanol, 1x koktajl inhibitorów proteazy). Obracać mieszaninę przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
2. Odwirować probówkę o stężeniu 17 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Przenieś supernatant (ekstrakt z całych komórek) do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodaj 3x początkową objętość buforu 0 M KCl (bufor rozcieńczający: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl₂, 10% glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanolu, 1x koktajl inhibitorów proteazy).
4. Przeprowadzić kolejne odwirowanie (17 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C) i przenieść supernatant (ekstrakt z całych komórek) do nowej probówki o pojemności 2 ml.

3. Immunoprecypitacja

1. Podczas wirowania (2.4) przepłukać 50 μl kulek anty-FLAG PBS, 0,1 M chlorowodorkiem glicyny, a następnie 1 M chlorowodorkiem tris, a następnie dwukrotnie przemyć 0,1 M buforem KCl (bufor o niskiej zawartości soli: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 M KCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu, 0,1% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanolu, 1x koktajl inhibitorów proteazy). Wirowanie w tym procesie mycia odbywa się przy 2.000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
2. Wymieszać 50 μl kulek FLAG z ekstraktami całokomórkowymi i delikatnie obracać mieszaninę przez 4 godziny w temperaturze 2-4 °C (1% ekstraktu z całych komórek z kroku 2.4 należy również przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości jako wejście).
3. Przenieść próbkę do mikrokolumny wirowej (spadek grawitacyjny). Utrzymuj przepływ w probówce o pojemności 1,5 ml, zamroź go za pomocą ciekłego azotu i przechowuj w temperaturze -80 °C (sprawdź poziom białka zarówno w wejściu, jak i przepływie za pomocą analizy Western blot).
4. Dodać 1 ml 0,1 M buforu KCl (bufor o niskiej zawartości soli), aby umyć koraliki FLAG (spadek grawitacyjny).
5. Powtórz krok 3.4 jeszcze co najmniej cztery razy (w sumie pięć prań).

4. Elucja

1. Umieścić kolumnę w probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować ją przy 2 000 x g przez 1 minutę; kulki wyschną.
2. Zakryj dolną część kolumny.
3. Dodać 50 μl (równe objętości kulek FLAG) 0,1 M glicyny-HCl (pH 2,5).
4. Delikatnie potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Umieścić kolumnę w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować ją przy 2 000 x g przez 1 minutę.
6. Wymyty roztwór neutralizuje się 10 μl 1 M Tris-HCl (pH 8,0); dobrze wymieszać pipetując lub używając maszyny wirowej.

5. Alkilowanie i trypsyna

1. Do mieszaniny dodać 50 μl 100 mM NH₄HCO₃, 10 μl CH₃CN i 2 μl ditiotreitolu (112 μl objętości całkowitej).
2. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 56 °C.
3. Umieścić próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut.
4. Dodać 10 μl 333 mM jodoacetamidu do próbki i inkubować ją w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
5. Dodać 10 μl trypsyny (33 ng/μl) do mieszaniny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

6. Analiza LC-MS/MS

1. Po nocnej trypsynizacji należy przetransportować produkt końcowy do zakładu LC-MS/MS lub do zewnętrznego laboratorium spektrometrii mas w celu analizy¹².

Results

Zidentyfikowaliśmy silny sygnał ARIP4, około 160 KDa, a także sygnał próbki próbnej i kilku innych nieznanych białek (Rysunek 1). Analiza LC-MS / MS zidentyfikowała zarówno peptydy kompleksu ARIP4, jak i potencjalne kofaktory peptydowe we frakcji kulek FLAG (Tabela 1). p62 (Sequestosome1), znany kofaktor ARIP4¹¹ został zidentyfikowany w analizie (Tabela 1), co potwierdza skuteczność tego systemu^11...

Discussion

Wydajna transfekcja jest niezbędna do uzyskania pomyślnego wyniku za pomocą tego protokołu. W związku z tym zalecamy użycie analizy Western blot w celu określenia poziomów białek znakowanych immunoprecypitacją FLAG. Ten krok umożliwia użytkownikom sprawdzenie, czy ich białko będące przedmiotem zainteresowania jest prawidłowo eksprymowane, a ponadto, czy IP zostało przeprowadzone pomyślnie. Poziomy białek oznaczonych flagą powinny być również sprawdzone przed analizą spektrometrii mas.

Próbna p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji	Thermo Fisher Scientific	11668019
Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA) (100x)	Nacalai Tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Mikro kolumny Bio-Spin	BIO-RAD	732-6204