Method Article

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

DOI:

10.3791/55119

⸱

January 18th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości wykorzystujący zautomatyzowane obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białkowych za pomocą opartych na rezonansie Förstera odczytów transferu energii (FRET) stałych lub żywych komórek na płytkach wielodołkowych. Zapewnia to środki do badań przesiewowych procesów sygnalizacji komórkowej odczytywanych za pomocą wewnątrzcząsteczkowych bioczujników FRET lub międzycząsteczkowych FRET interakcji białkowych, takich jak oligomeryzacja lub heterodimeryzacja, które można wykorzystać do identyfikacji partnerów wiążących. Opisujemy tutaj funkcjonalność tego zautomatyzowanego oprzyrządowania FLIM z płytką wielodołkową i prezentujemy przykładowe dane z naszych badań oligomeryzacji białka HIV Gag oraz przebiegu w czasie biosensora FRET w żywych komórkach. Następnie znajduje się szczegółowy opis praktycznej implementacji wraz z odniesieniem do listy komponentów sprzętowych oraz opisem oprogramowania do akwizycji danych typu open source napisanego w μManagerze. Przedstawiono również zastosowanie FLIMfit, klienta opartego na otwartym kodzie źródłowym MATLAB dla platformy OMERO, do analizy tablic danych FLIM z płytek wielodołkowych. Przedstawiono protokoły obrazowania komórek stałych i żywych oraz demonstrację zautomatyzowanego eksperymentu FLIM z płytką wielodołkową z wykorzystaniem komórek eksprymujących fluorescencyjne konstrukty FRET oparte na białkach. Uzupełnieniem jest przegląd analizy danych dla tego konkretnego zestawu danych FLIM FRET.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące wykorzystanie zautomatyzowanej analizy wysokiej zawartości (HCA) w odkrywaniu leków1 do oznaczania bibliotek związków jest uzupełniane przez trend w podstawowych badaniach nauk przyrodniczych w kierunku zautomatyzowanych eksperymentów obrazowania dla systematycznych badań, np. dla fenotypowych ekranów bibliotek siRNA. Zautomatyzowany HCA staje się również coraz ważniejszy w badaniach biologicznych na mniejszą skalę, które zwykle były wdrażane za pomocą ręcznych eksperymentów z dziesiątkami szalek komórek obrazowanych za pomocą konwencjonalnych mikroskopów. Moc statystyczna wynikająca z możliwości oznaczania i analizowania setek do tysięcy pól widzenia umożliwia uśrednianie szumów eksperymentalnych (w tym "szumów biologicznych"), a automatyzacja pozyskiwania danych obrazowych i analizy dużych matryc próbek może pomóc w wyeliminowaniu stronniczości operatora i często może być wykorzystywana do wykrywania występowania błędów systematycznych. takich jak zmiana profilu IRF podczas przejęcia. Testy oparte na fluorescencji są szeroko stosowane w HCA, a większość dostępnych na rynku oprzyrządowań HCA obejmuje obrazowanie intensywności fluorescencji w jednym lub więcej kanałach spektralnych w celu mapowania względnej dystrybucji i kolokalizacji znakowanych białek. Bardziej wyrafinowane metody obrazowania fluorescencyjnego, takie jak obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM), obrazowanie anizotropii polaryzacji i obrazowanie anizotropii fluorescencji w czasie rozdzielczym, nie są szeroko stosowane w komercyjnych instrumentach HCA, chociaż oferują potężne odczyty ilościowe, np. interakcji białek. Poniżej przedstawiamy podejście open source do implementacji FLIM w zautomatyzowanym mikroskopie dla HCA.

Czas życia fluorescencji zapewnia z natury ratiometryczny odczyt spektroskopowy, który może być używany do rozróżniania różnych gatunków molekularnych lub do badania lokalnego środowiska molekularnego fluoroforu i jest niewrażliwy na stężenie fluoroforu, na skuteczność wzbudzenia/wykrywania oraz na wpływ rozpraszania i absorpcji próbki2. Ponadto, ponieważ pomiary czasu życia fluorescencji mogą być wykonywane w jednym kanale spektralnym, są one bezpośrednio porównywalne między różnymi instrumentami i próbkami bez kalibracji. Można je stosować do endogennych fluoroforów, w tym niektórych metabolitów komórkowych, lipidów i składników macierzy zewnątrzkomórkowej, w celu zapewnienia wewnętrznych odczytów procesów biologicznych i patologii. W ten sposób bezznacznikowy FLIM może mapować zmiany metaboliczne w komórkach3,4 i jest stosowany do monitorowania różnicowania komórek macierzystych5,6 i wzrostu rusztowań kolagenowych7. Niedawno wykazaliśmy, że FLIM HCA może być stosowany do automatycznych, bezznacznikowych testów metabolizmu komórkowego z wykorzystaniem autofluorescencji8. Częściej jednak pomiary czasu życia fluorescencji i FLIM stosuje się do egzogennych fluoroforów, które znakują określone biomolekuły, często realizowane przy użyciu barwników barwiących przedziały komórkowe, przy użyciu barwników sprzężonych z przeciwciałami, które celują w określone białka w utrwalonych komórkach lub przy użyciu genetycznie wyrażonych fluoroforów sprzężonych z określonymi białkami. Czas życia fluorescencji może być wykorzystany do zapewnienia solidnych odczytów ilościowych sond fluorescencyjnych wykrywających ich środowisko fizyczne lub chemiczne. Na przykład barwniki zostały wykorzystane do wykrywania lokalnej fazy lipidowej błon komórkowych9 lub lepkości komórek10, a biosensory oparte na białkach fluorescencyjnych o ekspresji genetycznej zostały opracowane w celu raportowania stężeń cząsteczek sygnalizacji komórkowej, w tym IP311, PIP212 i kalpainy13 lub jonów, takich jak wapń14,15, potas16 i chlorek17.

Wiele takich biosensorów wykorzystuje Förster Resonance Energy Transfer (FRET)18,19 do dostarczania odczytów zmian w budowie biosensora. FRET między fluoroforami "donorowymi" i "akceptorowymi" zachodzi poprzez bezpośrednie oddziaływanie dipol-dipol krótkiego zasięgu, dla którego fluorofory są zwykle oddalone od siebie o mniej niż ~10 nm. W ten sposób wykrycie FRET wskazuje na bliskie sąsiedztwo odpowiednio znakowanych białek, a tym samym zapewnia środki do odczytania interakcji białko-białko20, takich jak wiązanie lub oligomeryzacja - albo jako punkty końcowe w stałych komórkach, albo jako dynamiczne zdarzenia w pomiarach przebiegu czasu żywych komórek. Poprzez znakowanie odpowiedniego konstruktu molekularnego zarówno fluoroforami donorowymi, jak i akceptorowymi, możliwe jest również odczytanie zmian konformacyjnych - lub rozszczepienia - konstruktu poprzez zmianę FRET i jest to podstawa wielu biosensorów21. Pomiary wydajności FRET mogą dostarczyć informacji na temat odległości dawca-akceptor oraz frakcji populacji fluoroforów donorowych poddawanych FRET. W związku z tym techniki obrazowania oparte na FRET mogą być wykorzystywane do mapowania i ilościowego określania interakcji molekularnych w przestrzeni i czasie, np. w celu wyjaśnienia procesów sygnalizacji komórkowej22. Automatyzacja takich technik obrazowania może zapewnić testy o wysokiej przepustowości oparte na odczytach szlaków sygnałowych lub sieci.

W HCA, najczęściej stosowanym odczytem FRET jest obrazowanie spektralne ratiometryczne, gdzie mapowane są zmiany w stosunku intensywności akceptora do dawcy. Chociaż podejście to jest łatwo wdrażane – i jest dostępne w wielu dostępnych na rynku czytnikach płytek wielodołkowych – ilościowe pomiary FRET o rozdzielczości spektralnej wymagają kalibracji odpowiedzi spektralnej systemu23. Obejmuje to przesłuchy spektralne wynikające z przebijania widmowego i bezpośredniego wzbudzenia akceptora, a także charakterystykę transmisji przyrządu i próbki (efekt filtra wewnętrznego). Zasadniczo wiąże się to z pomiarem dodatkowych próbek "kontrolnych", które są oznaczone jako tylko dawca lub tylko akceptor.

Z takich spektralnych ratiometrycznych pomiarów FRET można uzyskać efektywną wydajność FRET (iloczyn rzeczywistej wydajności FRET i frakcji cząsteczek donora/akceptora FRET) wraz ze względną proporcją cząsteczek donorowych i akceptorowych24. Spektralnie ratiometryczne FRET jest często stosowane z jednocząsteczkowymi biosensorami FRET, w których można założyć, że znana jest stechiometria donora/akceptora. Aby określić frakcje populacji dawcy i akceptora FRET, np. w celu uzyskania krzywej dawka-odpowiedź, wymagana jest wiedza na temat rzeczywistej skuteczności FRET. Można to uzyskać, mierząc dodatnią próbkę kontrolną FRET o znanych właściwościach lub stosując inną metodę pomiaru wydajności FRET, taką jak fotowybielanie akceptorowe lub FLIM.

Korzystając z odczytów czasu życia fluorescencji, FRET może być wykrywany i kwantyfikowany przez pomiary samej emisji donorowej — eliminując potrzebę kalibracji spektralnej i dalszych próbek kontrolnych. W ten sposób odczyty FLIM FRET mogą być porównywane między instrumentami i między różnymi próbkami, co pozwala na porównanie danych z endoskopii lub tomografii żywych modeli choroby25 z pomiarami testów opartych na komórkach. Dopasowując profile rozpadu fluorescencji donora do odpowiedniego modelu rozpadu wielowykładniczego odpowiadającego populacjom dawców FRET i nie-FRET, można w zasadzie uzyskać wydajność FRET i frakcje populacji bezpośrednio bez dalszych pomiarów. Te znaczące zalety odbywają się jednak kosztem FLIM, który wymaga większej liczby wykrytych fotonów na piksel niż obrazowanie o intensywności spektralnie rozdzielczej - zazwyczaj setki fotonów są wymagane do osiągnięcia dokładności wyznaczania czasu życia wynoszącej 10% przy dopasowaniu do pojedynczego modelu rozpadu wykładniczego i przy dopasowywaniu profili rozpadu fluorescencji do złożonych (rozpadów wielowykładniczych) modeli. Liczba wymaganych wykrytych fotonów wzrasta do tysięcy. Tradycyjnie prowadziło to do długich czasów akwizycji (dziesiątki do setek sekund na pole widzenia) dla FLIM, szczególnie w przypadku stosowania skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) realizowanego z sekwencyjną akwizycją pikseli w laserowych mikroskopach skaningowych. Próby zwiększenia prędkości obrazowania poprzez zastosowanie wyższych intensywności wzbudzenia mogą prowadzić do znacznego fotowybielania i/lub fototoksyczności. Wraz z brakiem odpowiedniego dostępnego na rynku oprzyrządowania i narzędzi programowych, utrudnia to wykorzystanie FLIM w HCA do odkrywania leków lub biologii systemów, gdzie mają być obrazowane setki do tysięcy pól widzenia. Skanowanie laserowe TCSPC FLIM zostało zaimplementowane w zautomatyzowanym wielodołkowym mikroskopie płytkowym26 do pomiarów wtórnych po identyfikacji "trafień" za pomocą obrazowania anizotropii fluorescencji w stanie ustalonym z rozdzielczością polaryzacji27, które może osiągać podobne prędkości obrazowania do spektralnego obrazowania ratiometrycznego28, z którym ma wiele zalet i wad. Obrazowanie anizotropii fluorescencji wykorzystuje spadek anizotropii fluorescencji akceptora w obecności FRET i jest również wrażliwe na przesłuchy spektralne (np. bezpośrednie wzbudzenie akceptora). Wymaga kalibracji w celu uwzględnienia przesłuchu polaryzacyjnego i nie zapewnia bezpośredniego pomiaru wydajności FRET.

Aby zdać sobie sprawę z zalet FLIM dla HCA, pracowaliśmy nad rozwiązaniem problemów związanych z szybkością pozyskiwania obrazów i szerszym dostępem do technologii. W tym miejscu przedstawiamy pełną listę komponentów oprogramowania i sprzętu typu open source, które można wykorzystać do wdrożenia zautomatyzowanego szybkiego czytnika płytek wielodołkowych FLIM, który opisano poniżej, wraz z przykładowymi testami opartymi na FRET. W naszym podejściu29 FLIM jest realizowany przy użyciu obrazowania bramkowanego w czasie o szerokim polu przy użyciu bramkowanego optycznego wzmacniacza obrazu (GOI), który jest zilustrowany na rysunku 1, który może zapewnić szybsze tempo obrazowania i niższe fotowybielanie niż skanowanie pojedynczą wiązką TCSPC ze względu na równoległe badanie pikseli. Nasz instrument openFLIM-HCA może zapewnić nienadzorowany FLIM, potrzebując tylko kilku sekund na uzyskanie danych FLIM wykrywających kilka 100 fotonów na piksel (w zależności od jasności próbki). W połączeniu z czasem wymaganym do przesunięcia próbki z poprzedniego pola widzenia, dostosowania ustawień akwizycji i utrzymania ostrości próbki, zwykle daje to czas akwizycji płytki wielodołkowej wynoszący ~10 s na pole widzenia25,28. Cięcie optyczne można zrealizować za pomocą quasi-szerokokątnego skanera Nipkow ("wirującego dysku")30.

Do analizy danych FLIM opracowaliśmy narzędzie open source o nazwie FLIMfit31, które jest w stanie szybko analizować zestawy danych FLIM z płytkami wielodołkowymi na konwencjonalnych stacjach roboczych PC i jest wtyczką do OMERO32. FLIMfit zapewnia globalne możliwości analityczne (omówione w sekcji 1.2), które umożliwiają dopasowanie danych FLIM do złożonych modeli z zaledwie kilkoma 100 fotonami na piksel przy założeniu, że składowe czasu życia fluorescencji są niezmienne w całym obrazie lub regionie zainteresowania (ROI), zmniejszając w ten sposób wymaganą liczbę wykrywanych fotonów, ekspozycję na światło próbki i czas akwizycji obrazu. Uruchomienie FLIMfit na standardowym komputerze stacjonarnym wymaga tylko 10 sekund czasu obliczeniowego do analizy zestawów danych zawierających setki pól widzenia. W ten sposób zarówno akwizycja, jak i analiza danych FLIM mogą być przeprowadzane w terminach, które są praktyczne dla HCA.

sprzęt openFLIM-HCA

Nasza implementacja FLIM HCA składa się z sześciu kluczowych elementów: (i) ramki mikroskopu fluorescencyjnego z optycznym autofokusem; (ii) stolik mikroskopowy z napędem silnikowym (x-y-z); (iii) źródło lasera wzbudzającego; (iv) szerokokątny, bramkowany czasowo system FLIM z bramkowanym wzmacniaczem optycznym (GOI), generatorem opóźnienia i kamerą; (v) komputer do akwizycji i analizy danych oraz (vi) skaner dysków Nipkow do obrazowania z podziałem optycznym w celu stłumienia nieostrego światła. Może to być ważne podczas obrazowania słabych sygnałów, np. z bioczujników FRET na błonie komórkowej komórki, które mogą zostać zalane przez fluorescencję cytoplazmatyczną lub tło z szkiełek nakrywkowych lub pożywki hodowlanej. Dane FLIM bramkowane w czasie są pozyskiwane poprzez oświetlenie próbki ultrakrótkim impulsowym promieniowaniem wzbudzenia, obrazowanie emisji fluorescencji do fotokatody GOI i uzyskanie serii obrazów CCD luminoforu GOI dla szeregu ustawień opóźnienia czasowego bramki wzmacniacza optycznego po nadejściu impulsów wzbudzenia. Wraz ze wzrostem opóźnienia bramki czasowej po wzbudzeniu, sygnał fluorescencji zmniejsza się, a seria obrazów intensywności fluorescencji bramkowanych w czasie uzyskanych na CCD tworzy zestaw danych wymaganych do analizy profili rozpadu wszystkich fluoroforów w polu widzenia. Bramkowanie GOI jest zsynchronizowane z impulsami wzbudzenia, a dla serii akwizycji CCD opóźnienie bramki czasowej względem impulsów wzbudzenia jest ustawione na serię rosnących wartości w pożądanym zakresie. Synchronizację tę uzyskuje się za pomocą generatora opóźnień, który składa się z "szybkiej skrzynki opóźniającej" (zapewniającej opóźnienia do 20 ns w krokach co 1 ps) i "zgrubnej skrzynki opóźniającej", która zapewnia opóźnienia z minimalnym krokiem 25 ps.

Dla FLIM, wzbudzenie może być zapewnione przez dowolny ultraszybki laser. Dla wygody zazwyczaj stosujemy źródło superkontinuum pompowane laserem światłowodowym, które dostarcza impulsy pikosekundowe przestrajalne w całym widmie widzialnym, z których można wybrać odpowiednie promieniowanie wzbudzenia dla dowolnego fluoroforu za pomocą zmotoryzowanego koła filtrów z różnymi filtrami pasmowo-przepustowymi. Zazwyczaj używamy średniej mocy ~100-200 μW na próbce z impulsami z częstotliwością powtarzania 40 lub 60 MHz. Takie moce wzbudzenia mogą być również zapewnione przez ultraszybkie źródła laserowe oparte na podwojeniu częstotliwości laserów szafirowych domieszkowanych tytanem z synchronizacją modów. Należy pamiętać, że czas trwania impulsu wzbudzenia poniżej ~100 ps jest wystarczający dla większości eksperymentów. Drugie zmotoryzowane koło filtrowe wyposażone w filtry o neutralnej gęstości służy do regulacji intensywności wzbudzenia. Dla bezpieczeństwa i wygody promieniowanie wzbudzenia może być dostarczane za pomocą światłowodu jednomodowego. Konfiguracje dla FLIM szerokokątnego i FLIM z podziałem optycznym przedstawiono odpowiednio na rysunkach 2 i 3. Aby uzyskać więcej informacji na temat konkretnych użytych komponentów, odwiedź openFLIM-HCA wiki33. Kopia aktualnej listy części znajduje się w materiałach uzupełniających.

Dla FLIM o szerokim polu, promieniowanie wzbudzenia jest wymagane, aby oświetlić całe pole widzenia tak równomiernie, jak to tylko możliwe. W tym celu kierujemy wiązkę lasera wzbudzającego do holograficznego dyfuzora "cylindra", który jest obracany z częstotliwością 10-50 Hz, aby uśrednić w czasie plamkę lasera, przy czym płaszczyzna dyfuzora jest obrazowana do tylnej płaszczyzny ogniskowej soczewki mikroskopu obiektywowego. Obraz fluorescencyjny z portu wyjściowego mikroskopu jest przekazywany na fotokatodę GOI, a luminofor GOI (obszar aktywny o przekątnej 18 mm) jest obrazowany na czujniku chłodzonej naukowej kamery CCD (rozmiar chipa 10,2 mm x 8,3 mm) za pomocą pary obiektywów kamery zapewniających powiększenie 0,7. System jest sterowany przez standardowy komputer PC, który jest połączony z oprzyrządowaniem za pomocą protokołów RS232. Ponadto mikroprocesor Arduino służy do sterowania migawką w ścieżce światła wzbudzenia, która jest zamknięta, z wyjątkiem sytuacji, gdy kamera CCD pozyskuje dane FLIM oraz do rejestrowania sygnału z fotodiody, który służy do pomiaru średniej mocy ze źródła wzbudzenia superkontinuum z filtrem spektralnym. W przypadku optycznie przeciętego FLIM wzbudzenie laserowe promieniowanie jest sprzężone z jednomodowym światłowodem utrzymującym polaryzację, który łączy się bezpośrednio z jednostką skanera dysków Nipkow, jak pokazano na rysunku 3. Wyjściowy obraz fluorescencyjny ze skanera Nipkow jest przekazywany na fotokatodę GOI, a reszta systemu jest taka sama jak w przypadku FLIM o szerokim polu.

oprogramowanie openFLIM-HCA

Oprogramowanie do akwizycji danych jest napisane w μManager34. Zapewnia pełną funkcjonalność akwizycji danych HCA, w tym opcje zmiany kolejności, w jakiej obrazowane są dołki płytki, uzyskiwanie przebiegów czasowych dla dowolnego pola widzenia, automatyczne utrzymywanie ostrości podczas pomiarów oraz sterowanie kołami filtrów wzbudzenia i emisji oraz zmieniaczem dichroicznym do automatycznego obrazowania wielokolorowego. Możliwe jest również przeprowadzenie akwizycji intensywności fluorescencji "prescan" w celu automatycznej identyfikacji i zarejestrowania pozycji odpowiednich FOV do późniejszej akwizycji FLIM zgodnie z kryteriami, np. w oparciu o intensywność. Dane FLIM HCA mogą być zapisywane jako seria plików TIFF, jako seria plików OME-TIFF (tj. po jednym na FOV) lub jako pojedynczy plik OME-TIFF zawierający wszystkie dane z płytki wielodołkowej. Więcej informacji oraz szczegółowy opis oprogramowania μManager można znaleźć na wiki33 openFLIM-HCA.

Oprogramowanie do analizy danych, FLIMfit31, klient oparty na otwartym kodzie źródłowym MATLAB dla platformy zarządzania danymi obrazowymi OMERO32, jest w stanie odczytać dane FLIM z serwera OMERO lub z dysku komputera, jak pokazano na rysunku 4. Został zaprojektowany do analizy danych z TCSPC lub instrumentów FLIM z bramkowaniem czasowym o szerokim polu i zapewnia wiele możliwości dopasowania danych z openFLIM-HCA, w tym dopasowania do monowykładniczych profili zaniku oraz podwojenia wykładniczych i bardziej złożonych profili zaniku, w tym modeli takich jak profile rozpadu fluorescencji z rozdzielczością polaryzacji. Może również uwzględniać stałe i zmienne w czasie sygnały tła i może wykorzystywać mierzoną funkcję odpowiedzi instrumentu czasoprzestrzennego (IRF) lub może pasować za pomocą wyidealizowanego IRF, który może być przesunięty w czasie na podstawie pikseli o wartość określoną na podstawie pełnego eksperymentalnego pomiaru IRF. Globalną różnicę czasu (t0) między IRF a próbką fluorescencyjną można wyznaczyć na podstawie pomiaru wzorca fluorescencji. Można również wziąć pod uwagę różnice przestrzenne w sygnałach tła i IRF. FLIMfit jest w stanie dopasować dane FLIM pod względem pikseli lub za pomocą "globalnego binningu" lub "globalnego dopasowania", aby ułatwić dopasowanie danych FLIM o skromnych (setkach) liczbach fotonów do złożonych modeli rozpadu.

Globalne binning polega na agregowaniu wszystkich wykrytych fotonów z pikseli w ramach zdefiniowanego przez użytkownika ROI w każdym punkcie czasowym, aby zapewnić wystarczającą liczbę fotonów, aby umożliwić dopasowanie do złożonych modeli rozpadu. ROI może być całym polem widzenia (FOV), może być zdefiniowany ręcznie przez użytkownika lub może być określony za pomocą narzędzi do segmentacji obrazu. Zwrot z inwestycji można również zdefiniować za pomocą masek zaimportowanych do FLIMfit z innego oprogramowania do segmentacji obrazów. W przypadku zastosowań FRET często stosuje się globalne kategoryzowanie w celu dopasowania do modelu podwójnego rozpadu wykładniczego w celu określenia składników czasu życia fluorescencji odpowiadających fluoroforom donorowym FRETing i nie-FRETing, które zakłada się, że są niezmienne przestrzennie w całym ROI, a następnie ponownego dopasowania na podstawie pikseli z ustalonymi wartościami składników czasu życia w celu uzyskania frakcji populacji dawcy FRETing w każdym pikselu.

Globalne dopasowanie polega na jednoczesnym dopasowaniu składników czasu życia i pikselowych frakcji populacji dawców FRETing na całym FOV- lub w zestawie danych FLIM, który może zawierać wiele FOV, np. z eksperymentu z płytką wielodołkową lub serii czasowej obrazów czasu życia fluorescencji. Globalne dopasowanie jest w stanie wykorzystać przestrzenną zmienność frakcji populacji na obrazie, która jest tracona w podejściu do globalnego kategoryzacji, aby zapewnić silniejsze ograniczenia w szacowaniu czasu życia komponentu – a tym samym bardziej wiarygodne wyniki – aczkolwiek kosztem znacznie większej liczby obliczeń35. FLIMfit może szybko analizować zestawy danych FLIM z płytkami wielodołkowymi z globalnym dopasowaniem na konwencjonalnych stacjach roboczych PC, na przykład z wielodołkowym zestawem danych FLIM bramkowanych czasowo, uzyskanymi z pięcioma bramkami czasowymi dla każdej z 394 FOV, z których każda składa się z 672 x 512 pikseli, wymagając tylko 32 sekund i 2 GB pamięci, aby dopasować się do modelu podwójnego rozpadu wykładniczego31. Udało się to osiągnąć dzięki wykorzystaniu rozłącznego nieliniowego algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów zaimplementowanego przy użyciu wielowątkowych algorytmów równoległych, aby umożliwić efektywne skalowanie na procesorach wielordzeniowych, a kod FLIMfit został zoptymalizowany w celu zminimalizowania zużycia pamięci. Rysunek 5 przedstawia migawkę graficznego interfejsu użytkownika FLIMfit, a więcej szczegółów można znaleźć na stronie internetowej podanej w odnośniku 36. Więcej informacji na temat globalnego dopasowania i globalnego kategoryzacji można znaleźć w odnośniku 31.

Następujący protokół dla FLIM HCA przy użyciu naszego oprzyrządowania i oprogramowania openFLIM-HCA może być dostosowany do szerokiego zakresu eksperymentów obrazowania komórek z odczytami FLIM. Ogólnie rzecz biorąc, wielodołkowe eksperymenty FRET na płytkach powinny być zaprojektowane tak, aby obejmowały powtórzone studzienki pozytywnych i ujemnych kontroli biologicznych, oprócz badanych warunków. W tym miejscu opisujemy konkretną implementację do wykonywania optycznie sekcjonowanego FLIM (patrz ryc. 3) komórek Cos eksprymujących konstrukty FRET składające się z białka fluorescencyjnego mTurquoise i białka fluorescencyjnego Venus połączonych krótkim łącznikiem peptydowym. W tym przypadku konstrukcje mTq32V, mTq17V i mTq5V FRET (omówione w sekcji Reprezentatywne wyniki) zapewniają niską, średnią i wysoką sprawność FRET wraz z konstrukcją mTq5A bez FRET. Te konstrukcje i inne materiały wymagane do przestrzegania tego protokołu są wymienione w Wykazie materiałów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie tablicy płytek wielodołkowych

  1. Przygotować roztwór 75 μM kumaryny 6 w etanolu (τ ~ 2,43 ns) do pomiarów referencyjnych w celu umożliwienia wyznaczenia t0.
  2. Wysiewaj 150 000 komórek Cos do czterech dołków na płytce 6-dołkowej i pozostaw na noc do przyczepienia w pożywce hodowlanej (patrz Lista materiałów).
  3. Transfekować po jednym dołku za pomocą mTq5A, mTq5V, mTq17V i mTq32V przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta i hodowli przez 24 godziny.
  4. Odłącz komórki za pomocą komercyjnego roztworu trypsyny/EDTA zgodnie z protokołem producenta.
  5. Odpipetuj 5,000 komórek Cos zawieszonych w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) wyrażającym mTq5A do każdej z dołków A1-G3 na 96-dołkowej płytce wielodołkowej o grubości #1,5 ze szklanym dnem, która została wcześniej potraktowana poli-L-lizyną. Powtórz dla komórek wykazujących ekspresję mTq5V w studzienkach A4-G6, mTq17V w studzienkach A5-G9 i mTq32V w studzienkach A10-G12.
  6. Pozostawić studzienkę H1 pustą (w celu umożliwienia pomiaru tła statycznego z płytki wielodołkowej).
  7. Odpipetować 200 μl HBSS tylko do studzienki H2 (w celu zapewnienia pomiaru dowolnego sygnału tła z pożywki do hodowli komórkowych).
  8. Odpipetować 5 000 nietransfekowanych komórek w HBSS do studzienki H3 (w celu zapewnienia pomiaru dowolnego sygnału tła z autofluorescencji komórkowej).
  9. Odpipetować 200 μl roztworu barwnika kumaryny o stężeniu 75 μM do dołka H4 (w celu sprawdzenia wszelkich zmian t0 podczas pobierania płytki wielodołkowej, np. spowodowanych zmianami temperatury otoczenia lub fluktuacjami w obwodzie laserowym lub czasowym.

2. Akwizycja danych openFLIM-HCA

UWAGA: Szczegółowe informacje można znaleźć na wiki openFLIM-HCA33.

  1. Uruchom program μManager i wtyczkę OpenFLIM-HCA
  2. Wybierz plik kalibracyjny dla określonej kombinacji generatora opóźnienia i częstotliwości powtarzania lasera w sekcji "Sterowanie FLIM: Plik kalibracji skrzynki opóźniającej: Pliki kalibracyjne" .
  3. Ustaw folder, w którym zostaną zapisane dane, w polu "Plik: Ustaw folder podstawowy".
  4. Sprawdź ścieżkę wiązki wzbudzenia, aby upewnić się, że sprzężenie ze światłowodem dostarczającym jest stabilne i że wydajność sprzężenia jest maksymalizowana poprzez pomiar mocy przesyłanej przez światłowód dostarczający za pomocą miernika mocy. Dopuszczalne są wahania mniejsze niż 5%.
  5. Sprawdź, czy wyzwalanie GOI jest stabilne, wyświetlając sygnał wyjściowy monitora z GOI na oscyloskopie wyzwalanym przez sygnał wyzwalający wejście GOI.
  6. Sprawdź obrazowanie luminoforu GOI na czujniku CCD, zakrywając fotokatodę GOI, ustawiając jej wzmocnienie na 750 V i skupiając jedną z soczewek przekaźnikowych w taki sposób, aby obrazy rzadkich pojedynczych fotonów (z powodu światła tła przeciekającego przez pokrywę GOI) zarejestrowane na CCD były tak ostre, jak to możliwe.
  7. Sprawdzić, czy pole widzenia próbki jest równomiernie oświetlone, poprzez obrazowanie jednorodnej próbki fluorescencyjnej, takiej jak kropla roztworu barwnika odniesienia na szkiełku nakrywkowym, przy użyciu wystarczająco niskiej mocy wzbudzenia (< 1 μW), aby zapewnić, że rząd Indii nie jest nasycony.
  8. Należy wybrać odpowiedni plik definicji płytki, tj. wybrać opcję dla płytek 96-dołkowych ("Plik: Załaduj właściwości płytki").
  9. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, upewnij się, że w ramce mikroskopu nie ma kostki rozdzielacza wiązki dichroicznej, wybierając pustą pozycję.
  10. Ręcznie wybierz szerokość bramki 4 ns w GOI dla całego eksperymentu.
  11. Pobieranie danych obrazu IRF:
    1. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, upewnij się, że na ścieżce wiązki nie ma obiektywu mikroskopu, wybierając pustą pozycję. Ręcznie umieść anodowany blok wiązki nad wieżyczką obiektywu, aby zapobiec ucieczce światła laserowego i ustawić go pod kątem, aby zminimalizować odbicie z powrotem w ramie mikroskopu.
    2. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, ustaw filtry w CSUX (wzbudzenie, dichroik, emisja) w taki sposób, aby można było zobrazować część światła wzbudzenia rozproszonego od wirującego dysku Nipkowa, ale upewnij się, że intensywność nie jest wystarczająca do nasycenia systemu na czas integracji CCD wynoszący 200 ms. Ma to na celu uniknięcie wystawiania fotokatody GOI na zbyt dużo światła, które mogłoby uszkodzić fotokatodę.
    3. Użyj funkcji Znajdź maxpoint w pełnym zakresie opóźnień objętych programowalną skrzynką szybkiego opóźnienia. Sprawdź wyświetlony schemat wyjściowy, a następnie wyreguluj ręczną skrzynkę opóźnienia kursu, naciskając przycisk do przodu, tak aby pełny profil IRF znajdował się w zasięgu skanowania skrzynki szybkiego opóźnienia.
    4. Dostosuj parametry akwizycji (gęstość neutralna, czas ekspozycji, akumulacja klatek), aby CCD nie był nasycony w najjaśniejszej bramce czasowej, a efektywny czas integracji wynosił >200 ms.
    5. Ustaw kroki opóźnienia 25 ps w pełnym zakresie opóźnienia ("Sterowanie FLIM: Pole szybkiego opóźnienia: Wypełnij opóźnienia").
    6. Uzyskaj obraz IRF, naciskając "Snap FLIM image".
    7. Uzyskaj obraz tła, blokując laser ("Kontrola ścieżki światła: Gęstość neutralna: zablokowana"), zmniejszając liczbę opóźnień ("Sterowanie FLIM: Skrzynka szybkiego opóźnienia: Ustawienie aktualnego opóźnienia (ps)"), pozostaw wszystkie inne właściwości niezmienione i naciśnij "Snap FLIM image".
  12. Uzyskaj referencyjne dane barwnika:
    1. Wybierz dobrze H4 za pomocą graficznego interfejsu użytkownika μManager ("Kontrolka XYZ: Przejdź do studni: H4").
    2. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, wybierz filtry (wzbudzenie 434/17 nm, dichroiczne, emisja 482/25 nm) do obrazowania mTqFP.
    3. Użyj funkcji Znajdź punkt maksimum w pełnym zakresie pola szybkiego opóźnienia, a następnie dostosuj zgrubne pole opóźnienia tak, aby pełny profil zaniku mieścił się w zakresie opóźnienia pola szybkiego opóźnienia.
    4. Ustaw opóźnienie do punktu maksymalnej intensywności, zmieniając "Sterowanie FLIM: Skrzynka szybkiego opóźnienia: Ustawienie aktualnego opóźnienia (ps)". Dostosuj parametry akwizycji (gęstość neutralna, czas ekspozycji) tak, aby matryca CCD nie była nasycona.
    5. Ustaw kroki opóźnienia na 25 ps w pełnym zakresie opóźnienia ("Sterowanie FLIM: Pole szybkiego opóźnienia: Wypełnij opóźnienia).
    6. Uzyskaj referencyjne dane barwnika, naciskając "Snap FLIM image".
    7. Uzyskać drugi obraz z kamery CCD w tle, blokując laser wzbudzający (patrz 2.11.7)
  13. Pozyskanie danych FLIM próbki płytki wielodołkowej za pomocą oprogramowania do akwizycji μManager:
    1. Ustaw, które dołki powinny być obrazowane i liczbę FOV do uzyskania na odwiert ("Ustaw sekwencjonowaną akwizycję HCA: pozycje XYZ").
    2. Ręcznie wybierz przykładowe pole widzenia zawierające próbkę, która ma zostać zobrazowana. Użyj tego pola widzenia, aby określić optymalny filtr o neutralnej gęstości, szerokość bramki w GOI i czas integracji kamery, tak aby osiągnąć 75% zakresu dynamiki kamery CCD.
    3. Ustaw autofokus ("Sterowanie XYZ: Autofokus"): Naciśnij "Tylko przywróć kontrolę ostrości", a następnie ręcznie ustaw ostrość na interesujących komórkach lub strukturze. Ustaw "Zakres wyszukiwania autofokusa" na 2000 μm i naciśnij "Enter". Naciśnij "AF teraz", aby rozpocząć procedurę autofokusa. Wartość przesunięcia pojawi się w polu "FocusOffset (Autofocus)".
    4. Wprowadź wartość przesunięcia uzyskaną w 2.13.3 w polu "Przesunięcie AF" i powtórz procedurę autofokusa dwukrotnie ("AF teraz"), aby sprawdzić, czy wartość przesunięcia wynosi teraz zero, co wskazuje na prawidłowe działanie systemu autofokusa.
    5. Użyj funkcji "AutoGate" w oprogramowaniu do akwizycji OpenFLIM-HCA, aby wybrać logarytmiczne próbkowanie punktów opóźnienia. Alternatywnie można je wybrać ręcznie, więcej informacji można znaleźć w odnośniku 36.
    6. Ustaw wartość "Akumulacja ramek" na wartość, która daje żądany całkowity czas pozyskiwania danych. Zwiększenie liczby akumulowanych ramek zwiększa stosunek sygnału do szumu danych FLIM kosztem wydłużenia całkowitego czasu pozyskiwania danych FLIM.
    7. Uruchom akwizycję FLIM płytki wielodołkowej, naciskając przycisk "Rozpocznij sekwencję HCA".
  14. Uzyskać dalszy obraz z kamery CCD w tle, blokując laser wzbudzający (patrz 2.11.7) z identycznymi ustawieniami akwizycji, jakie są używane do akwizycji danych FLIM.

3. Analiza danych openFLIM-HCA za pomocą FLIMfit

  1. Sprawdź, czy dostępne są niezbędne pliki pomocnicze do analizy danych FLIM (tj. IRF i referencyjny pomiar barwnika).
  2. Załaduj dane z pustej studzienki (H1), studzienki zawierającej pożywkę hodowlaną (H2) i studzienki zawierającej nieznakowane komórki w pożywce hodowlanej (H3) do FLIMfit ("Plik: Załaduj dane FLIM"), aby sprawdzić, czy nie ma żadnych wkładów tła większych niż 1% sygnału z komórek wyrażających "tylko dawcę", tj. w studzienkach A1-G3.
  3. Przygotuj plik tła zmiennego w czasie (TVB), ładując studzienkę z pożywką hodowlaną do FLIMfit ("Plik: Załaduj dane FLIM"). Załaduj dane tła kamery uzyskane w sekcji 2.14 ("Tło: Załaduj tło") i użyj opcji FLIMfit "Narzędzia: Utwórz mapę intensywności TVB", aby wygenerować TVB. Więcej informacji na temat TVB można znaleźć w odnośniku 31.
  4. Przygotuj przestrzennie zróżnicowaną mapę przesunięcia IRF, wczytując dane IRF uzyskane w sekcji 2.11 i odejmując tło kamery CCD uzyskane w sekcji 2.11.7. Użyj opcji FLIMfit "Narzędzia: Utwórz mapę przesunięcia IRF", aby obliczyć przestrzennie zmienną mapę przesunięcia IRF. Zobacz odniesienie [31], aby uzyskać więcej szczegółów na temat Mapy Przesunięcia IRF.
  5. Dopasuj rozpad monowykładniczy do danych referencyjnych barwnika uzyskanych w sekcji 2.12. Załaduj barwnik odniesienia i przestrzennie zmieniającą się mapę IRF obliczoną w sekcji 3.4, ustaw parametry dopasowania ("Żywotność: Nie. Exp:1") z t0 ustawionym jako dopasowany parametr ("Lifetime: FIT IRF Shift: Fitted"). Uzyskana wartość t0 jest następnie podawana w tabeli przedstawionej w zakładce "Parametry".
  6. Przeanalizować dane FLIM, wczytując eksperymentalne dane FLIM uzyskane w sekcji 2.13, przestrzennie zmieniającą się mapę IRF obliczoną w sekcji 3.4, tło kamery uzyskane w sekcji 2.14, plik TVB przygotowany w sekcji 3.3 i wpisać ujemną wartość t0 uzyskaną w sekcji 3.5 ("IRF: przesunięcie IRF: t0"). Następnie dopasuj dane eksperymentalne do pożądanego modelu rozpadu za pomocą FLIMfit36 zgodnie z wymaganiami eksperymentu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować możliwości oprzyrządowania openFLIM-HCA, przedstawiamy trzy przykładowe zastosowania FRET. Pierwsza z nich dotyczy konstruktów fret, które są adaptacją konstruktów modelowych FRET opracowanych przez laboratorium Stephena Vogela38. Składają się one z szeregu genetycznie wyrażalnych konstruktów fluorescencyjnych, w których białko fluorescencyjne donora (mTurquoise) jest połączone z fluoroforem akceptorowym (Venus) krótkimi, kontrolowanymi długościami 5, 17 i 32 aminokwasów (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Różne długości łączników między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi skutkują różną wydajnością FRET, a tym samym różnymi czasami życia dawcy. Aby zapewnić kontrolę negatywną, Wenus w krótkim konstrukcie łącznika 5-aminokwasowego jest zastępowana przez Bursztyn - niefluorescencyjną mutację YFP (mTq5A), która nie może działać jako akceptor FRET38. Zastąpiliśmy Cerulean w oryginalnych wektorach pCXV i pC5A poprzez restrykcyjne trawienie wektorów enzymami NheI i BglII oraz ligowanie fragmentów mTurquoise trawionych przy użyciu tych samych enzymów z wektora pmTurquoise-N1. Region łącznika nie został zmodyfikowany przez to podstawienie.

Rysunek 6 przedstawia przykładowy test FLIM FRET przy użyciu tego systemu modelowego wyrażonego w komórkach Cos, w którym wielodołkowa płytka jest ułożona w układ z 3 kolumnami każda z komórek transfekowanych kontrolą ujemną (kolumny 1-3), konstrukt 5-aminokwasowego łącznika FRET (kolumny 4-6), konstrukt 17-aminokwasowego łącznika FRET (kolumny 7-9) i konstrukt 32-aminokwasowego łącznika FRET (kolumny 10-12). Wiersz H zawiera studnie do szacowania TVB. Rysunek 6(a) przedstawia przykłady automatycznie uzyskanych obrazów czasu życia fluorescencji typowych pól widzenia w każdej studzience. Oczywiste jest, że kontrola ujemna (kolumny 1-3) przedstawia najdłuższe czasy życia i że czas życia dawcy jest najkrótszy dla konstruktu FRET o najkrótszej długości łącznika (kolumny 4-6). Rysunek 6(b) pokazuje, w jaki sposób średni czas życia uśredniony dla wszystkich FOV w każdym dołku zmienia się na płytce wielodołkowej. Rysunki 6(c) i (d) pokazują przykładowe mapy czasu życia połączone intensywnością fluorescencji donora dla FOV odpowiednio mTq5A i mTq17V. Rycina 6 (e) przedstawia profil intensywności rozpadu fluorescencji dawcy uśredniony dla wszystkich komórek zobrazowanych w dołku A1, wraz z dopasowaniem do modelu rozpadu monowykładniczego i IRF (który jest zdominowany przez szerokość bramki GOI). Rysunek 6(f) przedstawia średni czas trwania fluorescencji dla każdej kolumny płytki wielodołkowej uzyskany z dopasowania monowykładniczego w pikselach. Tabelę średniego czasu życia i odchylenia standardowego (STD) można znaleźć w tabeli 1 poniżej. Akwizycja danych dla obrazów pokazanych na rysunku 6 zajęła około 160 minut. Analiza trwała 92 s na komputerze 2,6 GHz z 10 rdzeniami i 64 GB pamięci RAM.

Drugi przykładowy test demonstruje zastosowanie FLIM FRET do odczytu oligomeryzacji HIV-1 Gag podczas składania wirionów HIV-1 jako środka do testowania inhibitorów tego procesu25,42. Ekspresja HIV-1 Gag w odpowiednich komórkach gospodarza stanowi system modelowy dla tego etapu cyklu życiowego HIV-1, ponieważ prowadzi do powstawania cząstek wirusopodobnych (VLP), które są podobne do niedojrzałych wirionów HIV-1. W tym teście wyraziliśmy białko Gag HIV-1 połączone z CFP w komórkach HeLa i porównaliśmy działanie różnych inhibitorów poprzez ich wpływ na sygnał FRET, który wynikał z oligomeryzacji Gag. Szczegółowe informacje na temat zastosowanych inhibitorów znajdują się w pozycji bibliograficznej 42.

Szczegóły przygotowania próbki i pomiarów eksperymentalnych są szczegółowo opisane w odnośniku 25, gdzie wykazaliśmy, że możemy użyć FLIM do odczytu zarówno heteroFRET między agregującymi białkami Gag znakowanymi stochastycznie CFP i YFP, jak i homoFRET w komórkach wykazujących ekspresję tylko Gag znakowaną CFP. Chociaż homoFRET zwykle nie powoduje zmiany w czasie życia dawcy, ma to miejsce w szczególnym przypadku CFP, w którym fluorofor występuje w dwóch izomerach o różnych średnich czasach życia fluorescencji40,41. Odczyt CFP homo-FRET ma zalety uproszczonego przygotowania próbki w porównaniu z hetero-FRET CFP/YFP i jest bardziej wydajny spektralnie, co może być ważne dla multipleksowanych odczytów FRET.

Nasza poprzednia praca zastosowała FLIM FRET do oceny oligomeryzacji Gag w obecności inhibitora N-mirystoilotransferazy (NMT)42. Inhibitor ten zaburza endogenne enzymy odpowiedzialne za dodawanie kwasu mirystynowego do Gag, co umożliwia białkom Gag wiązanie się z błoną plazmatyczną i jest warunkiem wstępnym43 w tworzeniu wirionów HIV lub VLP. Wykazaliśmy, że zarówno odczyty heteroFRET, jak i homoFRET mogą osiągnąć Z' >0,6 w badaniach odpowiedzi na dawkę z inhibitorem NMT. Z' jest parametrem stosowanym w przemyśle farmaceutycznym do wskazania jakości testu i reprezentuje różnice w średnich wartościach kontroli dodatnich i ujemnych oraz ich względnych rozpiętości w celu wygenerowania jednowartościowego wskaźnika jakości testu – przy czym Z' > 0,5 jest uważane za "doskonałe" dla testu farmaceutycznego44. Zauważamy, że ta doskonała wydajność została osiągnięta w przypadku próbek, dla których zmiana średniego czasu życia dawcy była rzędu 300 ps - demonstrując statystyczną moc analizy danych FLIM dla dużej liczby komórek, co umożliwia realizację użytecznych odczytów przy użyciu znacznie mniejszych zmian w czasie życia fluorescencji niż jest to możliwe przy typowych liczbach komórek obrazowanych w ręcznych eksperymentach mikroskopowych.

Tutaj prezentujemy zestaw danych FLIM FRET z płytką wielodołkową, porównujący 4 związki hamujące oligomeryzację HIV Gag (oznaczone jako ICL13, ICL14, ICL15 i ICL16). W tym eksperymencie wykorzystaliśmy odczyt homoFRET z komórkami HeLa przejściowo transfekowanymi plazmidem Gag-CFP. W sumie zastosowano dziewięć różnych dawek każdego inhibitora zgodnie ze standardowym protokołem opisanym w odnośniku 32, co pozwoliło na powtórzenie dwóch dołków na warunek. Jako kontrola pozytywna, kolumna 1 przedstawia komórki wyrażające myr-Gag, zmutowane białko Gag pozbawione ugrupowania kwasu mirystynowego, które nie może tworzyć VLP, a więc symuluje całkowite hamowanie. Kontrolę ujemną zapewniono poprzez dozowanie komórek wykazujących ekspresję Gag-CFP tylko przy użyciu samego nośnika użytego do dostarczenia inhibitorów w innych kolumnach (kolumna 11). W sumie uzyskano osiem FOV na odwiert.

Dane zostały wyposażone w pojedynczy model rozkładu wykładniczego na podstawie piksel po pikselu, a mapa czasu życia fluorescencji pokazująca średni czas życia na studnię (dla wszystkich pikseli powyżej progu intensywności w ośmiu polach widzenia) jest pokazana poniżej na rysunku 7(a). Rysunek 7(b) przedstawia odpowiedni wykres czasu życia fluorescencji w funkcji stężenia inhibitora. Trzy z tych inhibitorów wykazują działanie hamujące (ICL13, ICL15 i ICL16) podczas inkubacji z komórkami wykazującymi ekspresję Gag-CFP. Jeden inhibitor (ICL14) nie wykazuje działania w żadnej badanej dawce. Wartość Z' obliczona dla tej płytki wynosiła 0,51. Wartości uzyskane dla kontroli dodatniej i ujemnej przedstawiono na rysunku 7 b) jako punkty zaznaczone kolorem czarnym przy 100 μM i długości fali 0,1 nM.

Krzywe reakcji na dawkę dla ICL13, ICL15 i ICL16 pokazane na rysunku 7(b) zostały następnie dopasowane do 4-parametrowego logistycznego modelu regresji nieliniowej ze współczynnikiem Hilla ustalonym na 145 z maksymalnymi i minimalnymi czasami życia ustalonymi na wartości uzyskane odpowiednio z dodatnich (kolumna 1) i ujemnych (kolumna 11) kontroli. Zwrócone wartości IC50 dla trzech krzywych wynosiły następnie: 38 nM, 24 nM i 116 nM odpowiednio dla ICL13, ICL15 i ICL16. Dla porównania z wartościami IC50 uzyskanymi za pomocą wewnątrzkomórkowych pomiarów FLIM FRET, określiliśmy IC50 pod kątem hamowania aktywności enzymatycznej rekombinowanego ludzkiego NMT1 w naszym wcześniej opisanym teście enzymów biochemicznych42. Trzy związki, które zostały uznane za aktywne przez FLIM FRET, są również najbardziej aktywne w tym teście (wartości IC50 odpowiednio 17 nM, 51 nM i 39 nM dla ICL13, ICL15 i ICL16), przy czym ICL14, który nie wykazał istotnej odpowiedzi w teście FLIM FRET, jest około 100 razy mniej aktywny wobec NMT1 (IC50 1700 nM). W przypadku związków czynnych wartości IC50 uzyskane za pomocą tych niezależnych metod oznaczania są niezwykle podobne, z niewielkimi różnicami, które można prawdopodobnie przypisać różnicom w wychwytywaniu lub metabolizmie związku w komórkach.

To małe badanie podkreśla zdolność FLIM HCA do rozróżniania siły działania różnych związków, które działają na ten sam cel zainteresowania. Uważamy, że jest to pierwsza demonstracja badania przesiewowego wykorzystującego zautomatyzowany FLIM w kontekście wysokiej zawartości w celu wygenerowania krzywych odpowiedzi na wiele dawek i ilustruje potencjał FLIM do zastosowania w badaniach przesiewowych i/lub charakteryzowaniu użytecznych związków terapeutycznych.

Trzeci przykładowy eksperyment FLIM FRET dotyczy genetycznie wyrażonego biosensora FRET do wymiany białka aktywowanego przez cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP (EPAC)), który jest czynnikiem wymiany guaniny Rap-1, który wiąże się specyficznie z cAMP. Ten bioczujnik EPAC FRET (EPAC-SH188) wykorzystuje białko fluorescencyjne mTurquoise2 (mTq2FP) jako fluorofor donorowy i zawiera dwa Venus-FP w celu zaimplementowania kompozytowego akceptora46. cAMP jest wszechobecnym drugim przekaźnikiem i bierze udział w wielu procesach wewnątrzkomórkowych w wielu różnych organizmach. Jest syntetyzowany przez cyklazę adenylanową z konwersji ATP w błonie komórkowej. Tutaj pokazujemy naszą zdolność do odczytywania i ilościowego określania jego aktywności w żywych komórkach HEK293T po dodaniu forskoliny, aktywatora cyklazy adenylanowej, który zwiększa wewnątrzkomórkową produkcję cAMP, a tym samym zwiększa jego stężenie cytoplazmatyczne. Ten czujnik EPAC przechodzi FRET w stanie nieaktywowanym (niezwiązanym), a jego żywotność donora wzrasta wraz ze stężeniem cAMP, gdy cAMP prowadzi do otwarcia bioczujnika. Monowykładniczy profil rozpadu mTq2FP sprawia, że ten bioczujnik lepiej nadaje się do ilościowej analizy czasu życia niż bioczujniki oparte na CFP 45. Rysunek 8 przedstawia przykład przebiegu czasowego zarejestrowanego za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu FLIM z płytką wielodołkową, w którym wykreśliliśmy zmianę średniego czasu życia i zmianę frakcji populacji dawców FRETing w czasie po dodaniu 100 μM forskoliny. Dla uproszczenia zakładamy, że całkowity sygnał można opisać za pomocą mieszaniny dawców monowykładniczych i nie-FRET, a frakcję populacyjną aktywowanego biosensora EPAC FRET uzyskano przez dopasowanie profilu podwójnego rozpadu wykładniczego w całym szeregu czasowym.

Do akwizycji danych cAMP (EPAC) wybrano pięć opóźnień bramki, o szerokości bramki 4,000 ps, z czasem opóźnienia ustawionym na 1,300 ps, 4,300 ps (intensywność szczytowa), 4,919 ps, 6,656 ps, 8,035 ps, 1,0391 ps i 16,000 ps. Czas integracji kamery dla każdego opóźnienia wynosił 250 ms. W jednym z odwiertów przeprowadziliśmy pomiar czasu FLIM z obrazami wykonywanymi co 10 sekund w ciągu 10 minut. Punkty danych uzyskane w czasie 120 s i 130 s zostały usunięte, ponieważ dodanie forskoliny spowodowało niewielkie przesunięcie w ogniskowej próbki, a tym samym intensywności fluorescencji zarejestrowanej podczas akwizycji FLIM w tych punktach czasowych.

W celu analizy danych obrazy zostały załadowane do FLIMfit i podzielone na segmenty dla każdej komórki. Dane dotyczące czasu życia fluorescencji dopasowano do modelu podwójnego rozpadu wykładniczego przy użyciu IRF i stałej wartości t0 uzyskanej z barwnika referencyjnego (75 μM kumaryny 6). Średni czas życia fluorescencji dawcy uśredniony dla wszystkich komórek pokazano na rysunku 8(a). Rysunek 8(b) pokazuje zmianę frakcji populacji FRETing w czasie obliczoną przez dopasowanie tych samych danych FLIM do tego samego modelu podwójnego rozkładu wykładniczego

figure-results-1

gdzie β to frakcja dawcy FRET. Zakładamy mieszaninę pierwiastków FRETing i non-FRETing dla punktów czasowych przed dodaniem forskoliny. Aby uzyskać te czasy życia, zastosowano podwójne dopasowanie wykładnicze do pierwszych trzech punktów czasowych, dając czasy życia τ1 = 3,964 ± 21 ps dla dawcy niebędącego FRETing i τ2 = 3,022 ± 27 ps dla dawcy FRETing. Zostały one ustalone w celu późniejszego dopasowania całego zestawu danych w celu uzyskania β wartości w każdym punkcie czasowym.

Podsumowując, przedstawiliśmy przykładowe wyniki FLIM HCA dla trzech próbek eksperymentalnych. Pierwszą z nich była 96-dołkowa płytka z komórkami Cos eksprymującymi konstrukty FRET zawierające donor mTqFP połączony z akceptorem Venus FP lub niefluorescencyjnym konstruktem bursztynowym za pomocą łącznika peptydowego o różnej długości. Zmiana wydajności FRET, a tym samym czasu życia donora wraz z długością łącznika, jest wyraźnie widoczna, a odchylenie standardowe średniego czasu życia dla każdej konstrukcji było mniejsze niż 36 ps. Drugim przykładowym testem było "badanie przesiewowe" czterech potencjalnych inhibitorów mirystoylacji białka HIV Gag, dla których % hamowania obliczono na podstawie zmienności średniego czasu życia fluorescencji dawcy ze stężeniem inhibitora mierzonym w komórkach Hela eksprymujących białko Gag znakowane CFP. Odczyt ten opiera się na homoFRET, który zwykle nie powoduje zmiany w czasie życia dawcy, ale tak jest w przypadku CFP, ponieważ występuje on w wielu izomerach o różnym czasie życia fluorescencji. Może to być przydatne z punktu widzenia wydajności spektralnej, np. do multipleksowania różnych odczytów FRET25. Trzecim przykładowym testem było monitorowanie żywych komórek HEK293T w czasie wykazujących ekspresję biosensora cAMP FRET, EPAC. Wykazało to oczekiwaną odpowiedź po leczeniu forskoliną i zastosowaniu FLIMfit przy użyciu modelu podwójnego rozpadu wykładniczego, przy czym liczba wykrytych fotonów jest proporcjonalna do obrazowania żywych komórek - jak wcześniej pokazaliśmy w przypadku biosensora LIBRA FRET dla IP347.

figure-results-2
Rysunek 1. Schemat szerokokątnego bramkowania czasowego FLIM przy użyciu bramkowanego optycznego wzmacniacza obrazu (GOI). Po lewej stronie pokazany jest schemat systemu doświadczalnego. U góry po prawej, schemat impulsu wzbudzenia, położenie obrazów bramkowanych czasowo i monowykładnicze dopasowanie do danych. U dołu po prawej, rysunek przedstawiający zanik fluorescencji od dwóch obiektów pokazanych w systemie eksperymentalnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2. Schemat szerokokątnego openFLIM-HCA z wykorzystaniem bramkowanego optycznego wzmacniacza obrazu (GOI). Bardziej szczegółowy opis komponentów systemu znajduje się w tekście głównym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 3. Schemat optycznie podzielonego openFLIM-HCA przy użyciu bramkowanego optycznego wzmacniacza obrazu (GOI) z modułem skanera dysków Nipkow. Bardziej szczegółowy opis komponentów systemu znajduje się w tekście głównym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 4. Schemat przepływu danych obrazu z programu akwizycyjnego Manager do serwera OMERO lub dysku komputera i do FLIMfit w celu analizy. Przepływ danych rozpoczyna się w lewym górnym rogu, gdzie surowe dane obrazu są pozyskiwane w oprogramowaniu do akwizycji μ-Manager. Elementy wewnątrz przerywanego pola reprezentują etapy analizy danych FLIM, podczas gdy te na zewnątrz odpowiadają pozyskiwaniu i przechowywaniu danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 5. Zrzut ekranu interfejsu użytkownika FLIMfit. U góry po lewej, lista aktualnie załadowanych pól widzenia oraz obraz intensywności fluorescencji aktualnie wybranego pola widzenia. U dołu po lewej, wybór modelu dopasowania i warunków montażu. U góry po prawej, zanik fluorescencji dla bieżącego obszaru zainteresowania (niebieskie kółka), dopasowanie do danych (czerwona linia), IRF (czerwona przerywana linia) z resztkami dopasowania poniżej (niebieska linia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 6. Płytka wielodołkowa FLIM modelu FRET konstruuje mTq5V, mTq17V, mTq32V wyrażane w komórkach Cos. (a) przykładowe obrazy czasu życia fluorescencji FOV w każdym dołku dla różnych konstruktów FRET wyrażonych w komórkach Cos, jak omówiono w tekście. b) mapa cieplna średnich czasów życia fluorescencji Wenus uśrednionych dla wszystkich komórek w każdym dołku. (c) obraz intensywności bursztynu turkusowego z nałożoną mapą czasu życia (podziałka 20 μm). (d) obraz intensywności turkusowej Wenus (17 aminokwasów) pokryty mapą czasu życia (skala 20 μm). (e) zmierzony profil zaniku intensywności (niebieskie kółka) fluorescencji konstruktu mTq5A (kontrola ujemna) uśredniony dla wszystkich komórek zobrazowanych w dołku A1, wraz z dopasowaniem danych do rozpadu jednowykładniczego (niebieska linia ciągła) i IRF (przerywana pomarańczowa linia). f) wykres średniego czasu życia uśrednionego dla każdej kolumny na płytce wielodołkowej, ze słupkami błędu przedstawiającymi odchylenie standardowe czasu trwania fluorescencji między polami widzenia. Dla (a-d) wartości czasu życia są reprezentowane za pomocą fałszywej skali kolorów ze wskazanymi granicami w pikosekundach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 7. Przykładowe badanie przesiewowe FLIM na płytce wielodołkowej inhibitorów Gag z wykorzystaniem komórek HeLa eksprymujących Gag-CFP. a) Mapa cieplna średniego czasu życia fluorescencji dawcy na basenik dla płytki wielodołkowej ułożonej w kolumnę 1 przedstawiającą komórki transfekowane myr-Gag-CFP jako pozytywną kontrolę dla zahamowania, kolumnę 11 przedstawiającą komórki transfekowane Gag-CFP poddane działaniu wyłącznie nośnika oraz przerywane kolorowe kwadraty wskazujące studzienki, którym podano jeden z czterech różnych inhibitorów o stężeniach w zakresie od kolumny 2 o wysokiej dawce do kolumny 10 o niskiej dawce. Skala fałszywych kolorów reprezentuje średni czas trwania fluorescencji w zakresie od 2,200 ps do 3,100 ps. (b) wykreśla czas trwania fluorescencji dla każdego inhibitora ze słupkami błędów pokazującymi odchylenie standardowe między powtarzającymi się dołkami. Punkty oznaczone kolorem czarnym na poziomach 2 i -4 na osi poziomej są odpowiednio dodatnimi i ujemnymi punktami kontroli uzyskanymi odpowiednio z kolumn 1 i 11. Linie ciągłe wskazują dopasowanie do danych dotyczących krzywej dawka-odpowiedź dla różnych inhibitorów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 8. Przykładowe zastosowanie FLIM do odczytu biosensora EPAC FRET w pomiarze poklatkowym przy użyciu HEK293T komórek. Zmiana (a) średniego czasu trwania fluorescencji i (b) frakcji dawcy FRETing w funkcji czasu po dodaniu forskoliny, wskazywana przez zielony pasek. Paski błędów pokazują błąd standardowy na komórkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

na studnię Std błądzić na studnię Std błądzić Zobacz materiał mT5A Numer katalogowy: 4008 Rozdział 32 12 mT17V 3004 TGL 26 10 mT5V powiedział: Numer katalogowy: 2717 35 Rozdział 13 mT32V 3133 SZT. Rozdział 30 11

Tabela 1. Średni czas życia i odchylenie standardowe (STD) konstrukcji FRET.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy zautomatyzowany wielodołkowy mikroskop płytkowy przeznaczony dla HCA przy użyciu bramkowanego czasowo FLIM. Sterowanie tym urządzeniem odbywa się za pomocą oprogramowania open source napisanego w μManager z opcją zapisywania danych na serwerze OMERO i przeprowadzania analizy danych FLIM za pomocą FLIMfit36, programu open source napisanego w MatLab i dostępnego jako klient OMERO32 Oprogramowanie do sterowania przyrządami μManager , openFLIM-HCA, jest dostępne online33 wraz z listą komponentów systemu48 aby umożliwić naukowcom akademickim konstruowanie własnych instrumentów FLIM HCA.

W celu uzyskania wiarygodnych danych FLIM konieczna jest optymalizacja ustawień akwizycji IWP i CCD oraz uwzględnienie wszelkich zmian w t0. Jak opisano w 3.8.2, ustawienie wzmocnienia GOI i czas integracji kamery CCD powinny być ustawione tak, aby osiągały ~75% zakresu dynamiki CCD. Użycie wyższych napięć GOI i wielokrotnej akumulacji ramek CCD przy każdym opóźnieniu bramki czasowej zwiększa stosunek sygnału do szumu49 , ale zwiększa to całkowity czas akwizycji FLIM (ponieważ mniej fotonów fluorescencyjnych jest rejestrowanych na klatkę przed nasyceniem kamery CCD, a więc liczba akumulacji klatek powinna zostać zwiększona), a więc ten kompromis powinien być ustalany dla każdego eksperymentu. Kalibracja generatora opóźnienia zależy od częstotliwości powtarzania lasera i dlatego konieczne jest upewnienie się, że do oprogramowania akwizycyjnego został załadowany prawidłowy plik kalibracyjny dla zastosowanej częstotliwości powtarzania. Procedurę kalibracji skrzynki opóźniającej można znaleźć na wiki openFLIM-HCA33.

Jeśli autofluorescencja komórkowa jest niska w porównaniu z sygnałem fluorescencyjnym, używamy sygnału z dołka zawierającego tylko pożywkę hodowlaną, aby zapewnić tło zmieniające się w czasie (TVB). Aby zminimalizować fluorescencję tła z pożywki do hodowli komórkowych, unikamy pożywek zawierających czerwień fenolową. Jeśli autofluorescencja komórkowa jest znacząca, wówczas LZA może pochodzić z pomiarów nieznakowanych komórek. Jednak w tym przypadku należy zachować ostrożność, ponieważ zakłada się, że tło autofluorescencji jest takie samo dla każdego piksela na obrazie. Założenie to nie będzie ważne, jeśli autofluorescencja zmienia się znacznie w komórce lub jeśli wiązka wzbudzająca lub czułość wykrywania nie są jednakowe w polu widzenia.

Akwizycja obrazu IRF za pomocą rozproszonych impulsów świetlnych wzbudzenia zapewnia czasowy profil IRF, który jest konwolucyjny z modelem danych w procesie dopasowania, a także zapewnia mapę przestrzennej zmienności IRF w całym polu widzenia. IRF można zmierzyć, obrazując próbkę rozpraszającą, taką jak zawiesina koloidalna, chociaż w naszym instrumencie użycie światła wzbudzenia rozproszonego z dysku Nipkowa zapewnia czystszy pomiar IRF. Dokładne określenie czasu IRF jest ważne, ponieważ błędy w opóźnieniu czasowym między wzbudzeniem a bramkowaniem czasowym mogą znacząco wpłynąć na proces dopasowania, szczególnie w przypadku dopasowania do złożonych modeli rozpadu wykładniczego. IRF uzyskany za pomocą rozproszonego światła wzbudzenia nie jest dokładnie tym, co jest potrzebne w procesie dopasowania, ponieważ jest rejestrowany na długości fali wzbudzenia, a nie na długości fali emisji fluorescencji, co może wpływać na jego czas, chociaż przestrzenna zmienność IRF powinna być taka sama na obu długościach fal. Ponadto, rozproszony IRF może być globalnie przesunięty w czasie w stosunku do prawdziwego IRF ze względu na różną długość ścieżki optycznej od obiektu rozpraszającego, jak ma to miejsce w przypadku IRF uzyskanego z dysku Nipkowa w optycznie przekrojonym FLIM. Ta poprawka, t0, która jest wymaganym globalnym przesunięciem czasowym, które powinno być zastosowane do nabytego rozproszonego światła wzbudzenia IRF, oblicza się na podstawie danych dotyczących monowykładniczego barwnika referencyjnego, jak wskazano w kroku 4.4 protokołu. Następujące barwniki mogą być stosowane dla różnych długości fal wzbudzenia: do wzbudzenia w zakresie 295-442 nm można użyć roztworu kumaryny 153 o sile 75 μM w metanolu (τ ~ 4,3 ns50); do wzbudzenia w zakresie 430-500 nm można użyć roztworu kumaryny 6 o stężeniu 75 μM w etanolu (τ ~ 2,43 ns37); i 75 μM roztwór rodaminy B w wodzie (τ ~ 1,7 ns37) może być użyty do wzbudzenia w zakresie 488-575 nm. Zwracamy uwagę, że chociaż w FLIMfit możliwe jest użycie innego IRF dla każdego piksela systemu, zwykle rozsądne jest założenie, że przestrzennie zmienny IRF ma ten sam profil czasowy dla każdego piksela na obrazie, ale prezentuje zakres przestrzennie zmieniających się przesunięć czasowych względem globalnego t0. Opisujemy to jako mapę przesunięcia IRF, która jest wyznaczana na podstawie IRF światła rozproszonego. Profil IRF, t0 i mapa przesunięcia IRF są używane razem, aby zapewnić, że każdy piksel w polu widzenia jest wyposażony w odpowiedni IRF. Co ważne, t0 może zmieniać się powoli w czasie, dlatego należy je zmierzyć przed akwizycją danych FLIM.

Użytkownik powinien zdecydować, w jaki sposób próbkować profile zaniku fluorescencji i jest zobowiązany do ustawienia szerokości bramek czasowych i ich względnych opóźnień po wzbudzeniu. Ogólnie rzecz biorąc, pożądane jest stosowanie szerokich szerokości bramek, aby zmaksymalizować wykrywany sygnał i zazwyczaj używamy szerokości bramki ustawionej na 4 ns dla FLIM komórek znakowanych białkami fluorescencyjnymi. Liczba opóźnień bramki czasowej powinna być wystarczająca do pobrania próbki profilu zaniku fluorescencyjnego (w tym jednego zestawu bramek do pomiaru sygnału tuż przed impulsem wzbudzenia), biorąc pod uwagę złożoność modelu dopasowania, który zostanie użyty w analizie. Optymalna wartość może zależeć od czasu życia i względnych amplitud składników rozpadu. Ogólnie rzecz biorąc, 4 bramki są wystarczające do dopasowania rozpadów monowykładniczych, podczas gdy 7 lub więcej bramek może być używanych do bardziej złożonych modeli rozpadu.

Zwracamy uwagę, że FLIM może być zaimplementowany przy użyciu szeregu technik w dziedzinie czasu lub częstotliwości, a zautomatyzowany FLIM HCA wielodołkowych tablic płytek został po raz pierwszy zaimplementowany w (niesekcyjnym) mikroskopie szerokokątnym przy użyciu odczytów czasu życia w dziedzinie częstotliwości FRET51. Następnie zgłoszono pierwszy zautomatyzowany czytnik wielodołkowych płytek FLIM do sekcji optycznej dla HCA wykorzystujący obrazowanie bramkowane czasowo w szerokim polu28 . Następnie, FLIM HCA w dziedzinie częstotliwości o szerokim polu (bez sekcji) zastosowano do badań przesiewowych pod kątem modyfikacji potranslacyjnych (fosforylacja tyrozyny) w bibliotece genów przy użyciu FRET52 , a bramkowany czasowo FLIM HCA zastosowano do testów FRET oligomeryzacji HIV-1 Gag53 i SUMOylacji FOXM154 oraz biosensorów Raichu RhoA i Rac133. Możliwe jest również zastosowanie TCSPC do płytek wielodołkowych FLIM26 , ale do tej pory okazało się, że trudno jest dorównać przepustowości technikom wykorzystującym detekcję w szerokim polu. Jednym z pojawiających się podejść, które może rozwiązać ten problem, jest wykorzystanie matryc detektorów zliczających pojedyncze fotony, takich jak tablice55.

Zwracamy uwagę, że wszelkie odczyty FRET przy użyciu białek fluorescencyjnych powinny być traktowane z ostrożnością, a bezwzględne wartości parametrów uzyskane z FLIMfit lub innego oprogramowania do analizy FLIM będą zależeć od założeń związanych z modelem dopasowania. Na przykład, gdy dawca FRET ma znaczący drugi składnik rozpadu, zastosowanie modelu dwuwykładniczego w celu dopasowania danych FRET FLIM może spowodować, że udział szybszego składnika rozpadu, zwykle związany z populacją FRET, wydaje się wyższy niż powinien. Dlatego pożądane jest stosowanie dawców o monowykładniczym czasie życia, takich jak mTq2FP. Nawet wtedy ostatnie badania wykazały, że na analizę FRET mogą nadal wpływać ciemne stany akceptorowych białek fluorescencyjnych lub niejednorodność czynnika orientacji κ2 ze względu na rozkład konformacji fluoroforów z różnymi kątami i odległościami chromoforu56. Niemniej jednak my i inni wykazaliśmy, że odczyty czasu życia fluorescencji FRET dają użyteczne wyniki, które korelują z pomiarami biochemicznymi i mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych interakcji białek lub do śledzenia dynamiki bioczujników. W ten sposób ta platforma openFLIM HCA może być stosowana do szerokiej gamy testów opartych na żywotności fluorescencji z wykorzystaniem FRET lub autofluorescencji komórkowej8, a także zapewnia ilościowe odczyty sond na bazie barwników25.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za dofinansowanie od United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 i BB/M006786/1), UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, we współpracy z AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) oraz Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG potwierdza stypendium doktoranckie brytyjskiej Rady ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC). DA, DK i SW uznają stypendia doktoranckie w Centrum Kształcenia Doktorantów finansowanym przez EPSRC.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ramka mikroskopuOlympusIX81http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
autofokus optycznyOlympusZDChttp://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
zmotoryzowany (x-y-z) stolikmikroskopowy Marzhauser00-24-565-0000Stolik ze źródłem
lasera wzbudzającegoControl FianiumSC400-4Wzmacniacz optyczny z bramką laserową http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ Supercontinuum
 Generatory opóźnień KentechHigh Rate Imager (HRI)
Kentech---Zobacz zwinny generator opóźnienia i kamerę precyzyjnego generatora opóźnienia
HamamatsuORCA-ER-II
Nipkow YokogawaCSU-X1 http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Dyfuzorcylindra ThorlabsED1-S20-MDDyfuzory inżynieryjne
mTq5V Oxford GeneticsP3850mTurkusowy konstrukt Wenus z łącznikiem 5 aminokwasów
mTq17VOxford GeneticsP3847mTurkusowy konstrukt Wenus z 17-aminokwasowym łącznikiem
mTq32VOxford GeneticsP3848turkusowy konstrukt Wenus z 32-aminokwasowym łącznikiem
mTq5AOxford GeneticsP3849mturkusowy bursztynowy konstrukt
HEK293T------typ komórki używany
bez czerwieni fenolowej HBSSSigma Aldrich55021C-1000MLpożywka do obrazowania
pożywkahodowlana DMEM + 10% FBS + 0,5% Antybiotyki
DMEMSigma AldrichD6046-500MLdo pożywek hodowlanych
FBSSigma Aldrich12003C-500MLdo pożywek hodowlanych
xTremeGene9Sigma Aldrich6.37E+09do transfekcji postępuj zgodnie z protokołem online z La Roche
trypsin/EDTA SolutionThermo FischerR001100do odłączania komórek, postępuj zgodnie z protokołem online z Thermo Fischer
Corvus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  3. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
  4. Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848(2015).
  5. König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
  6. Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
  7. Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
  8. Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
  9. Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
  10. Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
  11. Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor "LIBRA" for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
  12. Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
  13. Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
  14. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/full/388882a0.html 882-887 (1997).
  15. Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  16. Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
  17. Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
  18. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  19. Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/bookseries/00757535 (2009).
  20. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
  21. Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
  22. Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
  23. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2(2006).
  24. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  25. Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
  26. Barber, P. R., et al. The Gray Institute "open" high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
  27. Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
  28. Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231(2012).
  29. Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
  30. Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
  31. Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687(2013).
  32. OpenMicroscopy.org. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/site/products/omero (2016).
  33. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016).
  34. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11(2014).
  35. Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  36. FLIMFit webpage. , Available from: http://www.flimfit.org (2016).
  37. Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, Ø Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
  38. Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
  39. Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
  40. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
  41. Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204(2008).
  42. Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
  43. Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
  44. Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z'Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
  45. Alibhai, D. Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , Imperial College London. PhD thesis, https://spiral.imperial.ac.uk:8443/handle/10044/1/26843 (2013).
  46. Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513(2015).
  47. Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
  48. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016).
  49. McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103(2009).
  50. Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
  51. Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
  52. Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
  53. Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
  54. Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
  55. Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
  56. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAutomated Multiwell PlateOpen Source SoftwareFRET BiosensorsProtein OligomerizationFLIM AnalysisInstrument Response FunctionReference Die DataFLIMfit SoftwareHIV Gag Protein

Related Articles