Artykuł metodologiczny

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55119

⸱

18 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Streszczenie

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości wykorzystujący zautomatyzowane obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białkowych za pomocą opartych na rezonansie Förstera odczytów transferu energii (FRET) stałych lub żywych komórek na płytkach wielodołkowych. Zapewnia to środki do badań przesiewowych procesów sygnalizacji komórkowej odczytywanych za pomocą wewnątrzcząsteczkowych bioczujników FRET lub międzycząsteczkowych FRET interakcji białkowych, takich jak oligomeryzacja lub heterodimeryzacja, które można wykorzystać do identyfikacji partnerów wiążących. Opisujemy tutaj funkcjonalność tego zautomatyzowanego oprzyrządowania FLIM z płytką wielodołkową i prezentujemy przykładowe dane z naszych badań oligomeryzacji białka HIV Gag oraz przebiegu w czasie biosensora FRET w żywych komórkach. Następnie znajduje się szczegółowy opis praktycznej implementacji wraz z odniesieniem do listy komponentów sprzętowych oraz opisem oprogramowania do akwizycji danych typu open source napisanego w μManagerze. Przedstawiono również zastosowanie FLIMfit, klienta opartego na otwartym kodzie źródłowym MATLAB dla platformy OMERO, do analizy tablic danych FLIM z płytek wielodołkowych. Przedstawiono protokoły obrazowania komórek stałych i żywych oraz demonstrację zautomatyzowanego eksperymentu FLIM z płytką wielodołkową z wykorzystaniem komórek eksprymujących fluorescencyjne konstrukty FRET oparte na białkach. Uzupełnieniem jest przegląd analizy danych dla tego konkretnego zestawu danych FLIM FRET.

Wprowadzenie

Rosnące wykorzystanie zautomatyzowanej analizy wysokiej zawartości (HCA) w odkrywaniu leków1 do oznaczania bibliotek związków jest uzupełniane przez trend w podstawowych badaniach nauk przyrodniczych w kierunku zautomatyzowanych eksperymentów obrazowania dla systematycznych badań, np. dla fenotypowych ekranów bibliotek siRNA. Zautomatyzowany HCA staje się również coraz ważniejszy w badaniach biologicznych na mniejszą skalę, które zwykle były wdrażane za pomocą ręcznych eksperymentów z dziesiątkami szalek komórek obrazowanych za pomocą konwencjonalnych mikroskopów. Moc statystyczna wynikająca z możliwości oznaczania i analizowania setek do tysięcy pól widzenia umożliwia uśrednianie szumów eksperymentalnych (w tym "szumów biologicznych"), a automatyzacja pozyskiwania danych obrazowych i analizy dużych matryc próbek może pomóc w wyeliminowaniu stronniczości operatora i często może być wykorzystywana do wykrywania występowania błędów systematycznych. takich jak zmiana profilu IRF podczas przejęcia. Testy oparte na fluorescencji są szeroko stosowane w HCA, a większość dostępnych na rynku oprzyrządowań HCA obejmuje obrazowanie intensywności fluorescencji w jednym lub więcej kanałach spektralnych w celu mapowania względnej dystrybucji i kolokalizacji znakowanych białek. Bardziej wyrafinowane metody obrazowania fluorescencyjnego, takie jak obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM), obrazowanie anizotropii polaryzacji i obrazowanie anizotropii fluorescencji w czasie rozdzielczym, nie są szeroko stosowane w komercyjnych instrumentach HCA, chociaż oferują potężne odczyty ilościowe, np. interakcji białek. Poniżej przedstawiamy podejście open source do implementacji FLIM w zautomatyzowanym mikroskopie dla HCA.

Czas życia fluorescencji zapewnia z natury ratiometryczny odczyt spektroskopowy, który może być używany do rozróżniania różnych gatunków molekularnych lub do badania lokalnego środowiska molekularnego fluoroforu i jest niewrażliwy na stężenie fluoroforu, na skuteczność wzbudzenia/wykrywania oraz na wpływ rozpraszania i absorpcji próbki2. Ponadto, ponieważ pomiary czasu życia fluorescencji mogą być wykonywane w jednym kanale spektralnym, są one bezpośrednio porównywalne między różnymi instrumentami i próbkami bez kalibracji. Można je stosować do endogennych fluoroforów, w tym niektórych metabolitów komórkowych, lipidów i składników macierzy zewnątrzkomórkowej, w celu zapewnienia wewnętrznych odczytów procesów biologicznych i patologii. W ten sposób bezznacznikowy FLIM może mapować zmiany metaboliczne w komórkach3,4 i jest stosowany do monitorowania różnicowania komórek macierzystych5,6 i wzrostu rusztowań kolagenowych7. Niedawno wykazaliśmy, że FLIM HCA może być stosowany do automatycznych, bezznacznikowych testów metabolizmu komórkowego z wykorzystaniem autofluorescencji8. Częściej jednak pomiary czasu życia fluorescencji i FLIM stosuje się do egzogennych fluoroforów, które znakują określone biomolekuły, często realizowane przy użyciu barwników barwiących przedziały komórkowe, przy użyciu barwników sprzężonych z przeciwciałami, które celują w określone białka w utrwalonych komórkach lub przy użyciu genetycznie wyrażonych fluoroforów sprzężonych z określonymi białkami. Czas życia fluorescencji może być wykorzystany do zapewnienia solidnych odczytów ilościowych sond fluorescencyjnych wykrywających ich środowisko fizyczne lub chemiczne. Na przykład barwniki zostały wykorzystane do wykrywania lokalnej fazy lipidowej błon komórkowych9 lub lepkości komórek10, a biosensory oparte na białkach fluorescencyjnych o ekspresji genetycznej zostały opracowane w celu raportowania stężeń cząsteczek sygnalizacji komórkowej, w tym IP311, PIP212 i kalpainy13 lub jonów, takich jak wapń14,15, potas16 i chlorek17.

Wiele takich biosensorów wykorzystuje Förster Resonance Energy Transfer (FRET)18,19 do dostarczania odczytów zmian w budowie biosensora. FRET między fluoroforami "donorowymi" i "akceptorowymi" zachodzi poprzez bezpośrednie oddziaływanie dipol-dipol krótkiego zasięgu, dla którego fluorofory są zwykle oddalone od siebie o mniej niż ~10 nm. W ten sposób wykrycie FRET wskazuje na bliskie sąsiedztwo odpowiednio znakowanych białek, a tym samym zapewnia środki do odczytania interakcji białko-białko20, takich jak wiązanie lub oligomeryzacja - albo jako punkty końcowe w stałych komórkach, albo jako dynamiczne zdarzenia w pomiarach przebiegu czasu żywych komórek. Poprzez znakowanie odpowiedniego konstruktu molekularnego zarówno fluoroforami donorowymi, jak i akceptorowymi, możliwe jest również odczytanie zmian konformacyjnych - lub rozszczepienia - konstruktu poprzez zmianę FRET i jest to podstawa wielu biosensorów21. Pomiary wydajności FRET mogą dostarczyć informacji na temat odległości dawca-akceptor oraz frakcji populacji fluoroforów donorowych poddawanych FRET. W związku z tym techniki obrazowania oparte na FRET mogą być wykorzystywane do mapowania i ilościowego określania interakcji molekularnych w przestrzeni i czasie, np. w celu wyjaśnienia procesów sygnalizacji komórkowej22. Automatyzacja takich technik obrazowania może zapewnić testy o wysokiej przepustowości oparte na odczytach szlaków sygnałowych lub sieci.

W HCA, najczęściej stosowanym odczytem FRET jest obrazowanie spektralne ratiometryczne, gdzie mapowane są zmiany w stosunku intensywności akceptora do dawcy. Chociaż podejście to jest łatwo wdrażane – i jest dostępne w wielu dostępnych na rynku czytnikach płytek wielodołkowych – ilościowe pomiary FRET o rozdzielczości spektralnej wymagają kalibracji odpowiedzi spektralnej systemu23. Obejmuje to przesłuchy spektralne wynikające z przebijania widmowego i bezpośredniego wzbudzenia akceptora, a także charakterystykę transmisji przyrządu i próbki (efekt filtra wewnętrznego). Zasadniczo wiąże się to z pomiarem dodatkowych próbek "kontrolnych", które są oznaczone jako tylko dawca lub tylko akceptor.

Z takich spektralnych ratiometrycznych pomiarów FRET można uzyskać efektywną wydajność FRET (iloczyn rzeczywistej wydajności FRET i frakcji cząsteczek donora/akceptora FRET) wraz ze względną proporcją cząsteczek donorowych i akceptorowych24. Spektralnie ratiometryczne FRET jest często stosowane z jednocząsteczkowymi biosensorami FRET, w których można założyć, że znana jest stechiometria donora/akceptora. Aby określić frakcje populacji dawcy i akceptora FRET, np. w celu uzyskania krzywej dawka-odpowiedź, wymagana jest wiedza na temat rzeczywistej skuteczności FRET. Można to uzyskać, mierząc dodatnią próbkę kontrolną FRET o znanych właściwościach lub stosując inną metodę pomiaru wydajności FRET, taką jak fotowybielanie akceptorowe lub FLIM.

Korzystając z odczytów czasu życia fluorescencji, FRET może być wykrywany i kwantyfikowany przez pomiary samej emisji donorowej — eliminując potrzebę kalibracji spektralnej i dalszych próbek kontrolnych. W ten sposób odczyty FLIM FRET mogą być porównywane między instrumentami i między różnymi próbkami, co pozwala na porównanie danych z endoskopii lub tomografii żywych modeli choroby25 z pomiarami testów opartych na komórkach. Dopasowując profile rozpadu fluorescencji donora do odpowiedniego modelu rozpadu wielowykładniczego odpowiadającego populacjom dawców FRET i nie-FRET, można w zasadzie uzyskać wydajność FRET i frakcje populacji bezpośrednio bez dalszych pomiarów. Te znaczące zalety odbywają się jednak kosztem FLIM, który wymaga większej liczby wykrytych fotonów na piksel niż obrazowanie o intensywności spektralnie rozdzielczej - zazwyczaj setki fotonów są wymagane do osiągnięcia dokładności wyznaczania czasu życia wynoszącej 10% przy dopasowaniu do pojedynczego modelu rozpadu wykładniczego i przy dopasowywaniu profili rozpadu fluorescencji do złożonych (rozpadów wielowykładniczych) modeli. Liczba wymaganych wykrytych fotonów wzrasta do tysięcy. Tradycyjnie prowadziło to do długich czasów akwizycji (dziesiątki do setek sekund na pole widzenia) dla FLIM, szczególnie w przypadku stosowania skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) realizowanego z sekwencyjną akwizycją pikseli w laserowych mikroskopach skaningowych. Próby zwiększenia prędkości obrazowania poprzez zastosowanie wyższych intensywności wzbudzenia mogą prowadzić do znacznego fotowybielania i/lub fototoksyczności. Wraz z brakiem odpowiedniego dostępnego na rynku oprzyrządowania i narzędzi programowych, utrudnia to wykorzystanie FLIM w HCA do odkrywania leków lub biologii systemów, gdzie mają być obrazowane setki do tysięcy pól widzenia. Skanowanie laserowe TCSPC FLIM zostało zaimplementowane w zautomatyzowanym wielodołkowym mikroskopie płytkowym26 do pomiarów wtórnych po identyfikacji "trafień" za pomocą obrazowania anizotropii fluorescencji w stanie ustalonym z rozdzielczością polaryzacji27, które może osiągać podobne prędkości obrazowania do spektralnego obrazowania ratiometrycznego28, z którym ma wiele zalet i wad. Obrazowanie anizotropii fluorescencji wykorzystuje spadek anizotropii fluorescencji akceptora w obecności FRET i jest również wrażliwe na przesłuchy spektralne (np. bezpośrednie wzbudzenie akceptora). Wymaga kalibracji w celu uwzględnienia przesłuchu polaryzacyjnego i nie zapewnia bezpośredniego pomiaru wydajności FRET.

Aby zdać sobie sprawę z zalet FLIM dla HCA, pracowaliśmy nad rozwiązaniem problemów związanych z szybkością pozyskiwania obrazów i szerszym dostępem do technologii. W tym miejscu przedstawiamy pełną listę komponentów oprogramowania i sprzętu typu open source, które można wykorzystać do wdrożenia zautomatyzowanego szybkiego czytnika płytek wielodołkowych FLIM, który opisano poniżej, wraz z przykładowymi testami opartymi na FRET. W naszym podejściu29 FLIM jest realizowany przy użyciu obrazowania bramkowanego w czasie o szerokim polu przy użyciu bramkowanego optycznego wzmacniacza obrazu (GOI), który jest zilustrowany na rysunku 1, który może zapewnić szybsze tempo obrazowania i niższe fotowybielanie niż skanowanie pojedynczą wiązką TCSPC ze względu na równoległe badanie pikseli. Nasz instrument openFLIM-HCA może zapewnić nienadzorowany FLIM, potrzebując tylko kilku sekund na uzyskanie danych FLIM wykrywających kilka 100 fotonów na piksel (w zależności od jasności próbki). W połączeniu z czasem wymaganym do przesunięcia próbki z poprzedniego pola widzenia, dostosowania ustawień akwizycji i utrzymania ostrości próbki, zwykle daje to czas akwizycji płytki wielodołkowej wynoszący ~10 s na pole widzenia25,28. Cięcie optyczne można zrealizować za pomocą quasi-szerokokątnego skanera Nipkow ("wirującego dysku")30.

Do analizy danych FLIM opracowaliśmy narzędzie open source o nazwie FLIMfit31, które jest w stanie szybko analizować zestawy danych FLIM z płytkami wielodołkowymi na konwencjonalnych stacjach roboczych PC i jest wtyczką do OMERO32. FLIMfit zapewnia globalne możliwości analityczne (omówione w sekcji 1.2), które umożliwiają dopasowanie danych FLIM do złożonych modeli z zaledwie kilkoma 100 fotonami na piksel przy założeniu, że składowe czasu życia fluorescencji są niezmienne w całym obrazie lub regionie zainteresowania (ROI), zmniejszając w ten sposób wymaganą liczbę wykrywanych fotonów, ekspozycję na światło próbki i czas akwizycji obrazu. Uruchomienie FLIMfit na standardowym komputerze stacjonarnym wymaga tylko 10 sekund czasu obliczeniowego do analizy zestawów danych zawierających setki pól widzenia. W ten sposób zarówno akwizycja, jak i analiza danych FLIM mogą być przeprowadzane w terminach, które są praktyczne dla HCA.

sprzęt openFLIM-HCA

Nasza implementacja FLIM HCA składa się z sześciu kluczowych elementów: (i) ramki mikroskopu fluorescencyjnego z optycznym autofokusem; (ii) stolik mikroskopowy z napędem silnikowym (x-y-z); (iii) źródło lasera wzbudzającego; (iv) szerokokątny, bramkowany czasowo system FLIM z bramkowanym wzmacniaczem optycznym (GOI), generatorem opóźnienia i kamerą; (v) komputer do akwizycji i analizy danych oraz (vi) skaner dysków Nipkow do obrazowania z podziałem optycznym w celu stłumienia nieostrego światła. Może to być ważne podczas obrazowania słabych sygnałów, np. z bioczujników FRET na błonie komórkowej komórki, które mogą zostać zalane przez fluorescencję cytoplazmatyczną lub tło z szkiełek nakrywkowych lub pożywki hodowlanej. Dane FLIM bramkowane w czasie są pozyskiwane poprzez oświetlenie próbki ultrakrótkim impulsowym promieniowaniem wzbudzenia, obrazowanie emisji fluorescencji do fotokatody GOI i uzyskanie serii obrazów CCD luminoforu GOI dla szeregu ustawień opóźnienia czasowego bramki wzmacniacza optycznego po nadejściu impulsów wzbudzenia. Wraz ze wzrostem opóźnienia bramki czasowej po wzbudzeniu, sygnał fluorescencji zmniejsza się, a seria obrazów intensywności fluorescencji bramkowanych w czasie uzyskanych na CCD tworzy zestaw danych wymaganych do analizy profili rozpadu wszystkich fluoroforów w polu widzenia. Bramkowanie GOI jest zsynchronizowane z impulsami wzbudzenia, a dla serii akwizycji CCD opóźnienie bramki czasowej względem impulsów wzbudzenia jest ustawione na serię rosnących wartości w pożądanym zakresie. Synchronizację tę uzyskuje się za pomocą generatora opóźnień, który składa się z "szybkiej skrzynki opóźniającej" (zapewniającej opóźnienia do 20 ns w krokach co 1 ps) i "zgrubnej skrzynki opóźniającej", która zapewnia opóźnienia z minimalnym krokiem 25 ps.

Dla FLIM, wzbudzenie może być zapewnione przez dowolny ultraszybki laser. Dla wygody zazwyczaj stosujemy źródło superkontinuum pompowane laserem światłowodowym, które dostarcza impulsy pikosekundowe przestrajalne w całym widmie widzialnym, z których można wybrać odpowiednie promieniowanie wzbudzenia dla dowolnego fluoroforu za pomocą zmotoryzowanego koła filtrów z różnymi filtrami pasmowo-przepustowymi. Zazwyczaj używamy średniej mocy ~100-200 μW na próbce z impulsami z częstotliwością powtarzania 40 lub 60 MHz. Takie moce wzbudzenia mogą być również zapewnione przez ultraszybkie źródła laserowe oparte na podwojeniu częstotliwości laserów szafirowych domieszkowanych tytanem z synchronizacją modów. Należy pamiętać, że czas trwania impulsu wzbudzenia poniżej ~100 ps jest wystarczający dla większości eksperymentów. Drugie zmotoryzowane koło filtrowe wyposażone w filtry o neutralnej gęstości służy do regulacji intensywności wzbudzenia. Dla bezpieczeństwa i wygody promieniowanie wzbudzenia może być dostarczane za pomocą światłowodu jednomodowego. Konfiguracje dla FLIM szerokokątnego i FLIM z podziałem optycznym przedstawiono odpowiednio na rysunkach 2 i 3. Aby uzyskać więcej informacji na temat konkretnych użytych komponentów, odwiedź openFLIM-HCA wiki33. Kopia aktualnej listy części znajduje się w materiałach uzupełniających.

Dla FLIM o szerokim polu, promieniowanie wzbudzenia jest wymagane, aby oświetlić całe pole widzenia tak równomiernie, jak to tylko możliwe. W tym celu kierujemy wiązkę lasera wzbudzającego do holograficznego dyfuzora "cylindra", który jest obracany z częstotliwością 10-50 Hz, aby uśrednić w czasie plamkę lasera, przy czym płaszczyzna dyfuzora jest obrazowana do tylnej płaszczyzny ogniskowej soczewki mikroskopu obiektywowego. Obraz fluorescencyjny z portu wyjściowego mikroskopu jest przekazywany na fotokatodę GOI, a luminofor GOI (obszar aktywny o przekątnej 18 mm) jest obrazowany na czujniku chłodzonej naukowej kamery CCD (rozmiar chipa 10,2 mm x 8,3 mm) za pomocą pary obiektywów kamery zapewniających powiększenie 0,7. System jest sterowany przez standardowy komputer PC, który jest połączony z oprzyrządowaniem za pomocą protokołów RS232. Ponadto mikroprocesor Arduino służy do sterowania migawką w ścieżce światła wzbudzenia, która jest zamknięta, z wyjątkiem sytuacji, gdy kamera CCD pozyskuje dane FLIM oraz do rejestrowania sygnału z fotodiody, który służy do pomiaru średniej mocy ze źródła wzbudzenia superkontinuum z filtrem spektralnym. W przypadku optycznie przeciętego FLIM wzbudzenie laserowe promieniowanie jest sprzężone z jednomodowym światłowodem utrzymującym polaryzację, który łączy się bezpośrednio z jednostką skanera dysków Nipkow, jak pokazano na rysunku 3. Wyjściowy obraz fluorescencyjny ze skanera Nipkow jest przekazywany na fotokatodę GOI, a reszta systemu jest taka sama jak w przypadku FLIM o szerokim polu.

oprogramowanie openFLIM-HCA

Oprogramowanie do akwizycji danych jest napisane w μManager34. Zapewnia pełną funkcjonalność akwizycji danych HCA, w tym opcje zmiany kolejności, w jakiej obrazowane są dołki płytki, uzyskiwanie przebiegów czasowych dla dowolnego pola widzenia, automatyczne utrzymywanie ostrości podczas pomiarów oraz sterowanie kołami filtrów wzbudzenia i emisji oraz zmieniaczem dichroicznym do automatycznego obrazowania wielokolorowego. Możliwe jest również przeprowadzenie akwizycji intensywności fluorescencji "prescan" w celu automatycznej identyfikacji i zarejestrowania pozycji odpowiednich FOV do późniejszej akwizycji FLIM zgodnie z kryteriami, np. w oparciu o intensywność. Dane FLIM HCA mogą być zapisywane jako seria plików TIFF, jako seria plików OME-TIFF (tj. po jednym na FOV) lub jako pojedynczy plik OME-TIFF zawierający wszystkie dane z płytki wielodołkowej. Więcej informacji oraz szczegółowy opis oprogramowania μManager można znaleźć na wiki33 openFLIM-HCA.

Oprogramowanie do analizy danych, FLIMfit31, klient oparty na otwartym kodzie źródłowym MATLAB dla platformy zarządzania danymi obrazowymi OMERO32, jest w stanie odczytać dane FLIM z serwera OMERO lub z dysku komputera, jak pokazano na rysunku 4. Został zaprojektowany do analizy danych z TCSPC lub instrumentów FLIM z bramkowaniem czasowym o szerokim polu i zapewnia wiele możliwości dopasowania danych z openFLIM-HCA, w tym dopasowania do monowykładniczych profili zaniku oraz podwojenia wykładniczych i bardziej złożonych profili zaniku, w tym modeli takich jak profile rozpadu fluorescencji z rozdzielczością polaryzacji. Może również uwzględniać stałe i zmienne w czasie sygnały tła i może wykorzystywać mierzoną funkcję odpowiedzi instrumentu czasoprzestrzennego (IRF) lub może pasować za pomocą wyidealizowanego IRF, który może być przesunięty w czasie na podstawie pikseli o wartość określoną na podstawie pełnego eksperymentalnego pomiaru IRF. Globalną różnicę czasu (t0) między IRF a próbką fluorescencyjną można wyznaczyć na podstawie pomiaru wzorca fluorescencji. Można również wziąć pod uwagę różnice przestrzenne w sygnałach tła i IRF. FLIMfit jest w stanie dopasować dane FLIM pod względem pikseli lub za pomocą "globalnego binningu" lub "globalnego dopasowania", aby ułatwić dopasowanie danych FLIM o skromnych (setkach) liczbach fotonów do złożonych modeli rozpadu.

Globalne binning polega na agregowaniu wszystkich wykrytych fotonów z pikseli w ramach zdefiniowanego przez użytkownika ROI w każdym punkcie czasowym, aby zapewnić wystarczającą liczbę fotonów, aby umożliwić dopasowanie do złożonych modeli rozpadu. ROI może być całym polem widzenia (FOV), może być zdefiniowany ręcznie przez użytkownika lub może być określony za pomocą narzędzi do segmentacji obrazu. Zwrot z inwestycji można również zdefiniować za pomocą masek zaimportowanych do FLIMfit z innego oprogramowania do segmentacji obrazów. W przypadku zastosowań FRET często stosuje się globalne kategoryzowanie w celu dopasowania do modelu podwójnego rozpadu wykładniczego w celu określenia składników czasu życia fluorescencji odpowiadających fluoroforom donorowym FRETing i nie-FRETing, które zakłada się, że są niezmienne przestrzennie w całym ROI, a następnie ponownego dopasowania na podstawie pikseli z ustalonymi wartościami składników czasu życia w celu uzyskania frakcji populacji dawcy FRETing w każdym pikselu.

Globalne dopasowanie polega na jednoczesnym dopasowaniu składników czasu życia i pikselowych frakcji populacji dawców FRETing na całym FOV- lub w zestawie danych FLIM, który może zawierać wiele FOV, np. z eksperymentu z płytką wielodołkową lub serii czasowej obrazów czasu życia fluorescencji. Globalne dopasowanie jest w stanie wykorzystać przestrzenną zmienność frakcji populacji na obrazie, która jest tracona w podejściu do globalnego kategoryzacji, aby zapewnić silniejsze ograniczenia w szacowaniu czasu życia komponentu – a tym samym bardziej wiarygodne wyniki – aczkolwiek kosztem znacznie większej liczby obliczeń35. FLIMfit może szybko analizować zestawy danych FLIM z płytkami wielodołkowymi z globalnym dopasowaniem na konwencjonalnych stacjach roboczych PC, na przykład z wielodołkowym zestawem danych FLIM bramkowanych czasowo, uzyskanymi z pięcioma bramkami czasowymi dla każdej z 394 FOV, z których każda składa się z 672 x 512 pikseli, wymagając tylko 32 sekund i 2 GB pamięci, aby dopasować się do modelu podwójnego rozpadu wykładniczego31. Udało się to osiągnąć dzięki wykorzystaniu rozłącznego nieliniowego algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów zaimplementowanego przy użyciu wielowątkowych algorytmów równoległych, aby umożliwić efektywne skalowanie na procesorach wielordzeniowych, a kod FLIMfit został zoptymalizowany w celu zminimalizowania zużycia pamięci. Rysunek 5 przedstawia migawkę graficznego interfejsu użytkownika FLIMfit, a więcej szczegółów można znaleźć na stronie internetowej podanej w odnośniku 36. Więcej informacji na temat globalnego dopasowania i globalnego kategoryzacji można znaleźć w odnośniku 31.

Następujący protokół dla FLIM HCA przy użyciu naszego oprzyrządowania i oprogramowania openFLIM-HCA może być dostosowany do szerokiego zakresu eksperymentów obrazowania komórek z odczytami FLIM. Ogólnie rzecz biorąc, wielodołkowe eksperymenty FRET na płytkach powinny być zaprojektowane tak, aby obejmowały powtórzone studzienki pozytywnych i ujemnych kontroli biologicznych, oprócz badanych warunków. W tym miejscu opisujemy konkretną implementację do wykonywania optycznie sekcjonowanego FLIM (patrz ryc. 3) komórek Cos eksprymujących konstrukty FRET składające się z białka fluorescencyjnego mTurquoise i białka fluorescencyjnego Venus połączonych krótkim łącznikiem peptydowym. W tym przypadku konstrukcje mTq32V, mTq17V i mTq5V FRET (omówione w sekcji Reprezentatywne wyniki) zapewniają niską, średnią i wysoką sprawność FRET wraz z konstrukcją mTq5A bez FRET. Te konstrukcje i inne materiały wymagane do przestrzegania tego protokołu są wymienione w Wykazie materiałów.

Protokół

1. Przygotowanie tablicy płytek wielodołkowych

  1. Przygotować roztwór 75 μM kumaryny 6 w etanolu (τ ~ 2,43 ns) do pomiarów referencyjnych w celu umożliwienia wyznaczenia t0.
  2. Wysiewaj 150 000 komórek Cos do czterech dołków na płytce 6-dołkowej i pozostaw na noc do przyczepienia w pożywce hodowlanej (patrz Lista materiałów).
  3. Transfekować po jednym dołku za pomocą mTq5A, mTq5V, mTq17V i mTq32V przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta i hodowli przez 24 godziny.
  4. Odłącz komórki za pomocą komercyjnego roztworu trypsyny/EDTA zgodnie z protokołem producenta.
  5. Odpipetuj 5,000 komórek Cos zawieszonych w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) wyrażającym mTq5A do każdej z dołków A1-G3 na 96-dołkowej płytce wielodołkowej o grubości #1,5 ze szklanym dnem, która została wcześniej potraktowana poli-L-lizyną. Powtórz dla komórek wykazujących ekspresję mTq5V w studzienkach A4-G6, mTq17V w studzienkach A5-G9 i mTq32V w studzienkach A10-G12.
  6. Pozostawić studzienkę H1 pustą (w celu umożliwienia pomiaru tła statycznego z płytki wielodołkowej).
  7. Odpipetować 200 μl HBSS tylko do studzienki H2 (w celu zapewnienia pomiaru dowolnego sygnału tła z pożywki do hodowli komórkowych).
  8. Odpipetować 5 000 nietransfekowanych komórek w HBSS do studzienki H3 (w celu zapewnienia pomiaru dowolnego sygnału tła z autofluorescencji komórkowej).
  9. Odpipetować 200 μl roztworu barwnika kumaryny o stężeniu 75 μM do dołka H4 (w celu sprawdzenia wszelkich zmian t0 podczas pobierania płytki wielodołkowej, np. spowodowanych zmianami temperatury otoczenia lub fluktuacjami w obwodzie laserowym lub czasowym.

2. Akwizycja danych openFLIM-HCA

UWAGA: Szczegółowe informacje można znaleźć na wiki openFLIM-HCA33.

  1. Uruchom program μManager i wtyczkę OpenFLIM-HCA
  2. Wybierz plik kalibracyjny dla określonej kombinacji generatora opóźnienia i częstotliwości powtarzania lasera w sekcji "Sterowanie FLIM: Plik kalibracji skrzynki opóźniającej: Pliki kalibracyjne" .
  3. Ustaw folder, w którym zostaną zapisane dane, w polu "Plik: Ustaw folder podstawowy".
  4. Sprawdź ścieżkę wiązki wzbudzenia, aby upewnić się, że sprzężenie ze światłowodem dostarczającym jest stabilne i że wydajność sprzężenia jest maksymalizowana poprzez pomiar mocy przesyłanej przez światłowód dostarczający za pomocą miernika mocy. Dopuszczalne są wahania mniejsze niż 5%.
  5. Sprawdź, czy wyzwalanie GOI jest stabilne, wyświetlając sygnał wyjściowy monitora z GOI na oscyloskopie wyzwalanym przez sygnał wyzwalający wejście GOI.
  6. Sprawdź obrazowanie luminoforu GOI na czujniku CCD, zakrywając fotokatodę GOI, ustawiając jej wzmocnienie na 750 V i skupiając jedną z soczewek przekaźnikowych w taki sposób, aby obrazy rzadkich pojedynczych fotonów (z powodu światła tła przeciekającego przez pokrywę GOI) zarejestrowane na CCD były tak ostre, jak to możliwe.
  7. Sprawdzić, czy pole widzenia próbki jest równomiernie oświetlone, poprzez obrazowanie jednorodnej próbki fluorescencyjnej, takiej jak kropla roztworu barwnika odniesienia na szkiełku nakrywkowym, przy użyciu wystarczająco niskiej mocy wzbudzenia (< 1 μW), aby zapewnić, że rząd Indii nie jest nasycony.
  8. Należy wybrać odpowiedni plik definicji płytki, tj. wybrać opcję dla płytek 96-dołkowych ("Plik: Załaduj właściwości płytki").
  9. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, upewnij się, że w ramce mikroskopu nie ma kostki rozdzielacza wiązki dichroicznej, wybierając pustą pozycję.
  10. Ręcznie wybierz szerokość bramki 4 ns w GOI dla całego eksperymentu.
  11. Pobieranie danych obrazu IRF:
    1. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, upewnij się, że na ścieżce wiązki nie ma obiektywu mikroskopu, wybierając pustą pozycję. Ręcznie umieść anodowany blok wiązki nad wieżyczką obiektywu, aby zapobiec ucieczce światła laserowego i ustawić go pod kątem, aby zminimalizować odbicie z powrotem w ramie mikroskopu.
    2. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, ustaw filtry w CSUX (wzbudzenie, dichroik, emisja) w taki sposób, aby można było zobrazować część światła wzbudzenia rozproszonego od wirującego dysku Nipkowa, ale upewnij się, że intensywność nie jest wystarczająca do nasycenia systemu na czas integracji CCD wynoszący 200 ms. Ma to na celu uniknięcie wystawiania fotokatody GOI na zbyt dużo światła, które mogłoby uszkodzić fotokatodę.
    3. Użyj funkcji Znajdź maxpoint w pełnym zakresie opóźnień objętych programowalną skrzynką szybkiego opóźnienia. Sprawdź wyświetlony schemat wyjściowy, a następnie wyreguluj ręczną skrzynkę opóźnienia kursu, naciskając przycisk do przodu, tak aby pełny profil IRF znajdował się w zasięgu skanowania skrzynki szybkiego opóźnienia.
    4. Dostosuj parametry akwizycji (gęstość neutralna, czas ekspozycji, akumulacja klatek), aby CCD nie był nasycony w najjaśniejszej bramce czasowej, a efektywny czas integracji wynosił >200 ms.
    5. Ustaw kroki opóźnienia 25 ps w pełnym zakresie opóźnienia ("Sterowanie FLIM: Pole szybkiego opóźnienia: Wypełnij opóźnienia").
    6. Uzyskaj obraz IRF, naciskając "Snap FLIM image".
    7. Uzyskaj obraz tła, blokując laser ("Kontrola ścieżki światła: Gęstość neutralna: zablokowana"), zmniejszając liczbę opóźnień ("Sterowanie FLIM: Skrzynka szybkiego opóźnienia: Ustawienie aktualnego opóźnienia (ps)"), pozostaw wszystkie inne właściwości niezmienione i naciśnij "Snap FLIM image".
  12. Uzyskaj referencyjne dane barwnika:
    1. Wybierz dobrze H4 za pomocą graficznego interfejsu użytkownika μManager ("Kontrolka XYZ: Przejdź do studni: H4").
    2. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika μManager, wybierz filtry (wzbudzenie 434/17 nm, dichroiczne, emisja 482/25 nm) do obrazowania mTqFP.
    3. Użyj funkcji Znajdź punkt maksimum w pełnym zakresie pola szybkiego opóźnienia, a następnie dostosuj zgrubne pole opóźnienia tak, aby pełny profil zaniku mieścił się w zakresie opóźnienia pola szybkiego opóźnienia.
    4. Ustaw opóźnienie do punktu maksymalnej intensywności, zmieniając "Sterowanie FLIM: Skrzynka szybkiego opóźnienia: Ustawienie aktualnego opóźnienia (ps)". Dostosuj parametry akwizycji (gęstość neutralna, czas ekspozycji) tak, aby matryca CCD nie była nasycona.
    5. Ustaw kroki opóźnienia na 25 ps w pełnym zakresie opóźnienia ("Sterowanie FLIM: Pole szybkiego opóźnienia: Wypełnij opóźnienia).
    6. Uzyskaj referencyjne dane barwnika, naciskając "Snap FLIM image".
    7. Uzyskać drugi obraz z kamery CCD w tle, blokując laser wzbudzający (patrz 2.11.7)
  13. Pozyskanie danych FLIM próbki płytki wielodołkowej za pomocą oprogramowania do akwizycji μManager:
    1. Ustaw, które dołki powinny być obrazowane i liczbę FOV do uzyskania na odwiert ("Ustaw sekwencjonowaną akwizycję HCA: pozycje XYZ").
    2. Ręcznie wybierz przykładowe pole widzenia zawierające próbkę, która ma zostać zobrazowana. Użyj tego pola widzenia, aby określić optymalny filtr o neutralnej gęstości, szerokość bramki w GOI i czas integracji kamery, tak aby osiągnąć 75% zakresu dynamiki kamery CCD.
    3. Ustaw autofokus ("Sterowanie XYZ: Autofokus"): Naciśnij "Tylko przywróć kontrolę ostrości", a następnie ręcznie ustaw ostrość na interesujących komórkach lub strukturze. Ustaw "Zakres wyszukiwania autofokusa" na 2000 μm i naciśnij "Enter". Naciśnij "AF teraz", aby rozpocząć procedurę autofokusa. Wartość przesunięcia pojawi się w polu "FocusOffset (Autofocus)".
    4. Wprowadź wartość przesunięcia uzyskaną w 2.13.3 w polu "Przesunięcie AF" i powtórz procedurę autofokusa dwukrotnie ("AF teraz"), aby sprawdzić, czy wartość przesunięcia wynosi teraz zero, co wskazuje na prawidłowe działanie systemu autofokusa.
    5. Użyj funkcji "AutoGate" w oprogramowaniu do akwizycji OpenFLIM-HCA, aby wybrać logarytmiczne próbkowanie punktów opóźnienia. Alternatywnie można je wybrać ręcznie, więcej informacji można znaleźć w odnośniku 36.
    6. Ustaw wartość "Akumulacja ramek" na wartość, która daje żądany całkowity czas pozyskiwania danych. Zwiększenie liczby akumulowanych ramek zwiększa stosunek sygnału do szumu danych FLIM kosztem wydłużenia całkowitego czasu pozyskiwania danych FLIM.
    7. Uruchom akwizycję FLIM płytki wielodołkowej, naciskając przycisk "Rozpocznij sekwencję HCA".
  14. Uzyskać dalszy obraz z kamery CCD w tle, blokując laser wzbudzający (patrz 2.11.7) z identycznymi ustawieniami akwizycji, jakie są używane do akwizycji danych FLIM.

3. Analiza danych openFLIM-HCA za pomocą FLIMfit

  1. Sprawdź, czy dostępne są niezbędne pliki pomocnicze do analizy danych FLIM (tj. IRF i referencyjny pomiar barwnika).
  2. Załaduj dane z pustej studzienki (H1), studzienki zawierającej pożywkę hodowlaną (H2) i studzienki zawierającej nieznakowane komórki w pożywce hodowlanej (H3) do FLIMfit ("Plik: Załaduj dane FLIM"), aby sprawdzić, czy nie ma żadnych wkładów tła większych niż 1% sygnału z komórek wyrażających "tylko dawcę", tj. w studzienkach A1-G3.
  3. Przygotuj plik tła zmiennego w czasie (TVB), ładując studzienkę z pożywką hodowlaną do FLIMfit ("Plik: Załaduj dane FLIM"). Załaduj dane tła kamery uzyskane w sekcji 2.14 ("Tło: Załaduj tło") i użyj opcji FLIMfit "Narzędzia: Utwórz mapę intensywności TVB", aby wygenerować TVB. Więcej informacji na temat TVB można znaleźć w odnośniku 31.
  4. Przygotuj przestrzennie zróżnicowaną mapę przesunięcia IRF, wczytując dane IRF uzyskane w sekcji 2.11 i odejmując tło kamery CCD uzyskane w sekcji 2.11.7. Użyj opcji FLIMfit "Narzędzia: Utwórz mapę przesunięcia IRF", aby obliczyć przestrzennie zmienną mapę przesunięcia IRF. Zobacz odniesienie [31], aby uzyskać więcej szczegółów na temat Mapy Przesunięcia IRF.
  5. Dopasuj rozpad monowykładniczy do danych referencyjnych barwnika uzyskanych w sekcji 2.12. Załaduj barwnik odniesienia i przestrzennie zmieniającą się mapę IRF obliczoną w sekcji 3.4, ustaw parametry dopasowania ("Żywotność: Nie. Exp:1") z t0 ustawionym jako dopasowany parametr ("Lifetime: FIT IRF Shift: Fitted"). Uzyskana wartość t0 jest następnie podawana w tabeli przedstawionej w zakładce "Parametry".
  6. Przeanalizować dane FLIM, wczytując eksperymentalne dane FLIM uzyskane w sekcji 2.13, przestrzennie zmieniającą się mapę IRF obliczoną w sekcji 3.4, tło kamery uzyskane w sekcji 2.14, plik TVB przygotowany w sekcji 3.3 i wpisać ujemną wartość t0 uzyskaną w sekcji 3.5 ("IRF: przesunięcie IRF: t0"). Następnie dopasuj dane eksperymentalne do pożądanego modelu rozpadu za pomocą FLIMfit36 zgodnie z wymaganiami eksperymentu.

Wyniki

Aby zilustrować możliwości aparatury openFLIM-HCA, przedstawiamy trzy przykładowe zastosowania FRET. Pierwsze z nich dotyczy konstruktów FRET zaadaptowanych z modelowych konstruktów FRET opracowanych w laboratorium Stephena Vogela38. Składają się one z serii genetycznie ekspresowalnych konstruktów fluorescencyjnych, w których białko fluorescencyjne donora (mTurquoise) jest połączone z fluoroforem akceptorem (Venus) krótkimi, kontrolowanymi łącznikami o długości 5, 17 i 32 aminokwasów (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Różne długości łączników między fluoroforami donora i akceptora skutkują różną wydajnością FRET, a tym samym różnym czasem życia donora. W celu zapewnienia kontroli negatywnej, w konstrukcie z krótkim, 5-aminokwasowym łącznikiem, Venus został zastąpiony białkiem Amber — niefluorescencyjną mutacją YFP (mTq5A), która nie może pełnić roli akceptora FRET38. Zastąpiliśmy białko Cerulean w oryginalnych wektorach pCXV i pC5A poprzez trawienie restrykcyjne wektorów enzymami NheI i BglII oraz ligację fragmentów mTurquoise, trawionych tymi samymi enzymami z wektora pmTurquoise-N1. Obszar łącznika nie został zmodyfikowany podczas tej substytucji.

Rysunek 6 przedstawia przykładowy pomiar FLIM FRET z wykorzystaniem tego modelu systemu wyrażonego w komórkach Cos, w którym na płytce wielodobkowej rozmieszczono po 3 kolumny komórek przetransfekowanych odpowiednio: kontrolą negatywną (kolumny 1-3), konstruktem FRET z linkerem o długości 5 aminokwasów (kolumny 4-6), konstruktem FRET z linkerem o długości 17 aminokwasów (kolumny 7-9) oraz konstruktem FRET z linkerem o długości 32 aminokwasów (kolumny 10-12). Wiersz H zawiera studzienki do szacowania TVB. Rysunek 6(a) pokazuje przykłady automatycznie pozyskanych obrazów czasu życia fluorescencji z typowych pól widzenia w każdej studzience. Widać, że kontrola negatywna (kolumny 1-3) wykazuje najdłuższe czasy życia, a czas życia donora jest najniższy dla konstruktu FRET z najkrótszym linkerem (kolumny 4-6). Rysunek 6(b) pokazuje, jak średni czas życia uśredniony dla wszystkich pól widzenia w każdej studzience zmienia się na całej płytce wielodobkowej. Rysunki 6(c) oraz (d) przedstawiają przykładowe mapy czasu życia z nałożoną intensywnością fluorescencji donora dla pola widzenia odpowiednio mTq5A i mTq17V. Rysunek 6(e) pokazuje profil zaniku intensywności fluorescencji donora uśredniony dla wszystkich komórek obrazowanych w studzience A1, wraz z dopasowaniem do monoeksponencjalnego modelu zaniku oraz IRF (która jest zdominowana przez szerokość bramki GOI). Rysunek 6(f) przedstawia średni czas życia fluorescencji dla każdej kolumny płytki wielodobkowej, uzyskany z pikselowego dopasowania monoeksponencjalnego. Tabelę średniego czasu życia i odchylenia standardowego (STD) można znaleźć w Tabeli 1 poniżej. Pozyskanie danych dla obrazów pokazanych na Rysunku 6 trwało około 160 min. Analiza zajęła 92 s na komputerze 2,6 GHz z 10 rdzeniami i 64 GB pamięci RAM.

Drugi przykładowy test demonstruje zastosowanie FLIM FRET do odczytu oligomeryzacji białka HIV-1 Gag podczas składania wirionów HIV-1 jako sposobu testowania inhibitorów tego procesu25,42. Ekspresja HIV-1 Gag w odpowiednich komórkach gospodarza stanowi system modelowy dla tego etapu cyklu życiowego HIV-1, ponieważ prowadzi do powstawania cząsteczek przypominających wirusy (VLP), które są podobne do niedojrzałych wirionów HIV-1. W tym teście wyeksponowano białko HIV-1 Gag połączone z CFP w komórkach HeLa i porównano działanie różnych inhibitorów poprzez analizę ich wpływu na sygnał FRET wynikający z oligomeryzacji białka Gag. Szczegółowe informacje na temat zastosowanych inhibitorów znajdują się w materiale referencyjnym 42.

Szczegóły przygotowania próbek i pomiarów eksperymentalnych zostały szczegółowo opisane w referencji 25, gdzie wykazaliśmy, że FLIM można wykorzystać do odczytu zarówno heteroFRET pomiędzy agregującymi białkami Gag znakowanymi stochastycznie CFP i YFP, jak i homoFRET w komórkach wykazujących ekspresję wyłącznie białka Gag znakowanego CFP. Chociaż homoFRET zazwyczaj nie powoduje zmiany czasu życia donora, ma to miejsce w szczególnym przypadku CFP, gdzie fluorofor występuje w postaci dwóch izomerów o różnych średnich czasach życia fluorescencji40,41. Odczyt homo-FRET dla CFP charakteryzuje się zaletami w postaci uproszczonego przygotowania próbek w porównaniu do hetero-FRET CFP/YFP oraz większą wydajnością spektralną, co może być istotne w przypadku multipleksowych odczytów FRET.

W naszych poprzednich badaniach zastosowano technikę FLIM FRET w celu oceny oligomeryzacji białka Gag w obecności inhibitora N-mirystylotransferazy (NMT)42. Inhibitor ten zaburza działanie endogennych enzymów odpowiedzialnych za przyłączanie kwasu mirystylowego do białka Gag, co umożliwia wiązanie białek Gag z błoną plazmatyczną i jest warunkiem niezbędnym43 do formowania wirionów HIV lub VLPs. Wykazaliśmy, że odczyty zarówno heteroFRET, jak i homoFRET mogą osiągnąć wartość Z' >0,6 w badaniach zależności dawka-odpowiedź z inhibitorem NMT. Z' jest parametrem stosowanym w przemyśle farmaceutycznym do określania jakości testu; reprezentuje on różnice w wartościach średnich kontroli pozytywnej i negatywnej oraz ich względne rozrzuty, tworząc pojedynczą miarę jakości testu — przy czym wartość Z' > 0,5 jest uznawana za „doskonałą” w przypadku testów farmaceutycznych44. Zauważamy, że tak wysoka wydajność została osiągnięta w próbkach, w których zmiana średniego czasu życia donora wynosiła rzędu 300 ps — co dowodzi statystycznej mocy analizy danych FLIM dla dużej liczby komórek, co pozwala na uzyskanie użytecznych odczytów przy znacznie mniejszych zmianach czasu życia fluorescencji, niż jest to możliwe przy typowej liczbie komórek obrazowanych w manualnych eksperymentach mikroskopowych.

W niniejszym materiale przedstawiamy zestaw danych FLIM FRET z płytki wielodołkowej, w którym porównano cztery związki hamujące oligomeryzację białka Gag HIV (oznaczone jako ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). W tym eksperymencie wykorzystano odczyt homoFRET w komórkach HeLa przejściowo transfekowanych plazmidem Gag-CFP. Zgodnie ze standardowym protokołem opisanym w referencji 32, zastosowano łącznie dziewięć różnych dawek każdego inhibitora, przewidując dwie powtórne studzienki na warunek. Jako kontrolę pozytywną w kolumnie 1 przedstawiono komórki wykazujące ekspresję myr-Gag, zmutowanego białka Gag pozbawionego grupy kwasu mirystynowego, które nie może tworzyć VLP, co symuluje całkowite zahamowanie. Kontrolę negatywną stanowiły komórki wykazujące ekspresję Gag-CFP, którym podano wyłącznie nośnik wykorzystany do wprowadzenia inhibitorów w pozostałych kolumnach (kolumna 11). W każdej studzience pozyskano łącznie osiem pól widzenia (FOV).

Dane dopasowano do modelu pojedynczego rozpadu wykładniczego w skali poszczególnych pikseli, a mapa płyty czasu życia fluorescencji przedstawiająca średni czas życia na studzienkę (uśredniony dla wszystkich pikseli powyżej progu intensywności we wszystkich ośmiu polach widzenia) jest przedstawiona poniżej na Rysunku 7(a). Rysunek 7(b) przedstawia odpowiadający temu wykres czasu życia fluorescencji w funkcji stężenia inhibitora. Trzy z inhibitorów wykazują efekt hamujący (ICL13, ICL15 & ICL16) podczas inkubacji z komórkami wykazującymi ekspresję Gag-CFP. Jeden inhibitor (ICL14) nie wykazuje żadnego efektu przy żadnej badanej dawce. Wartość Z' obliczona dla tej płyty wyniosła 0,51. Wartości uzyskane dla kontroli pozytywnej i negatywnej są przedstawione na Rysunku 7(b) jako punkty w kolorze czarnym przy 100 µM i 0,1 nM.

Krzywe zależności dawka-odpowiedź dla związków ICL13, ICL15 i ICL16 przedstawione na Rysunku 7(b) dopasowano do czteroparametrowego logistycznego modelu regresji nieliniowej z współczynnikiem Hilla ustalonym na 145, przy czym maksymalny i minimalny czas życia ustalono odpowiednio na wartościach uzyskanych z kontroli pozytywnej (kolumna 1) i negatywnej (kolumna 11). Uzyskane wartości IC50 dla tych trzech krzywych wyniosły odpowiednio: 38 nM, 24 nM i 116 nM dla ICL13, ICL15 i ICL16. W celu porównania z wartościami IC50 otrzymanymi za pomocą wewnątrzkomórkowych pomiarów FLIM FRET, określiliśmy IC50 dla hamowania aktywności enzymatycznej rekombinowanej ludzkiej NMT1 w naszym wcześniej opisanym biochemicznym teście enzymatycznym42. Trzy związki, które okazały się aktywne w teście FLIM FRET, są również najaktywniejsze w tym teście (wartości IC50 wynoszące odpowiednio 17 nM, 51 nM i 39 nM dla ICL13, ICL15 i ICL16), podczas gdy związek ICL14, który nie wykazał istotnej odpowiedzi w teście FLIM FRET, był ca. 100-krotnie mniej aktywny wobec NMT1 (IC50 wynoszące 1700 nM). W przypadku związków aktywnych wartości IC50 uzyskane za pomocą tych niezależnych metod analitycznych są niezwykle zbliżone, a niewielkie różnice można prawdopodobnie przypisać odmiennym różnicom w pobieraniu lub metabolizmie związku w komórkach.

Niniejsze niewielkie badanie podkreśla zdolność metody FLIM HCA do rozróżniania potencji różnych związków działających na ten sam wybrany cel. W naszej ocenie jest to pierwsza demonstracja przesiewu z wykorzystaniem zautomatyzowanego FLIM w kontekście wysokiej zawartości danych (high content) w celu wygenerowania wielu krzywych zależności dawka-odpowiedź, co ilustruje potencjał zastosowania FLIM do poszukiwania i/lub charakteryzowania użytecznych związków terapeutycznych.

Trzeci przykładowy eksperyment FLIM FRET dotyczy genetycznie ekspresyjnego biosensora FRET dla białka EPAC (Exchange protein activated by cyclic adenosine monophosphate), które jest czynnikiem wymiany guaniny dla Rap-1, wiążącym specyficznie cAMP. Ten biosensor FRET EPAC (EPAC-SH188) wykorzystuje białko fluorescencyjne mTurquoise2 (mTq2FP) jako fluorofor donora i zawiera dwa białka Venus-FP w celu stworzenia złożonego akceptora46. cAMP jest powszechnym drugim przekaźnikiem i bierze udział w wielu procesach wewnątrzkomórkowych u wielu różnych organizmów. Jest on syntetyzowany przez cyklazę adenylanową z ATP w błonie komórkowej. Tutaj demonstrujemy możliwość odczytu i kwantyfikacji jego aktywności w żywych komórkach HEK293T po dodaniu forskoliny, aktywatora cyklazy adenylanowej, który zwiększa wewnątrzkomórkową produkcję cAMP, a tym samym podnosi jego stężenie w cytoplazmie. Sensor EPAC wykazuje zjawisko FRET w stanie nieaktywnym (niezwiązanym), a czas życia donora wzrasta wraz ze stężeniem cAMP, ponieważ cAMP prowadzi do otwarcia biosensora. Monoeksponencjalny profil zaniku mTq2FP sprawia, że biosensor ten jest lepiej dostosowany do ilościowej analizy czasu życia niż biosensory oparte na CFP 45. Rysunek 8 przedstawia przykład przebiegu czasowego zarejestrowanego za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu FLIM z płytką wielodołkową, gdzie wykreślono zmianę średniego czasu życia oraz zmianę frakcji populacji donora uczestniczącego w FRET w czasie po dodaniu 100 µM forskoliny. Dla uproszczenia przyjmujemy, że całkowity sygnał można opisać jako mieszaninę monoeksponencjalnych donorów uczestniczących i nieuczestniczących w FRET, a frakcję populacji aktywowanego biosensora FRET EPAC uzyskano poprzez dopasowanie profilu zaniku dwueksponencjalnego w całej serii czasowej.

Do akwizycji danych cAMP (EPAC) wybrano pięć opóźnień bramki przy szerokości bramki 4,000 ps, z czasem opóźnienia ustawionym na 1,300 ps, 4,300 ps (intensywność szczytowa), 4,919 ps, 6,656 ps, 8,035 ps, 1,0391 ps oraz 16,000 ps. Czas integracji kamery dla każdego opóźnienia wynosił 250 ms. W jednej studience zarejestrowano przebieg czasowy FLIM, wykonując obrazy co 10 s przez 10 min. Punkty danych uzyskane w czasie 120 s i 130 s zostały usunięte, ponieważ dodanie forskoliny spowodowało niewielkie przesunięcie pozycji ogniskowej próbki, a tym samym intensywności fluorescencji rejestrowanej podczas akwizycji FLIM w tych punktach czasowych.

Do analizy danych obrazy wczytano do programu FLIMfit i przeprowadzono segmentację na poziomie pojedynczych komórek. Dane dotyczące czasu życia fluorescencji dopasowano do modelu podwójnego rozpadu wykładniczego z wykorzystaniem IRF oraz stałej wartości t0 uzyskanej z barwnika referencyjnego (75 µM Coumarin 6). Średni czas życia fluorescencji donora uśredniony dla wszystkich komórek przedstawiono na Rysunku 8(a). Rysunek 8(b) przedstawia zmianę frakcji populacji wykazującej FRET w czasie, obliczoną poprzez dopasowanie tych samych danych FLIM do tego samego modelu podwójnego rozpadu wykładniczego

figure-results-1

gdzie β to frakcja donora uczestniczącego w FRET. W przypadku punktów czasowych poprzedzających dodanie forskoliny przyjęto istnienie mieszaniny elementów uczestniczących i nieuczestniczących w FRET. W celu wyznaczenia tych czasów życia, do trzech pierwszych punktów czasowych zastosowano dopasowanie dwueksponencjalne, co pozwoliło uzyskać czasy życia τ1 = 3,964 ± 21 ps dla donora nieuczestniczącego w FRET oraz τ2 = 3,022 ± 27 ps dla donora uczestniczącego w FRET. Wartości te zostały ustalone dla późniejszego dopasowania całego zestawu danych w celu uzyskania wartości β dla każdego punktu czasowego.

Podsumowując, zaprezentowaliśmy przykładowe wyniki HCA metodą FLIM dla trzech próbek eksperymentalnych. Pierwszą była płytka 96-dołkowa z komórkami Cos wykazującymi ekspresję konstruktów FRET, składających się z donora mTqFP połączonego z akceptorem Venus FP lub niefluorescencyjnym konstruktem Amber za pomocą łączników peptydowych o różnej długości. Zmiana wydajności FRET, a tym samym czasu życia donora w zależności od długości łącznika, jest wyraźnie widoczna, a odchylenie standardowe średniego czasu życia dla każdego konstruktu wynosiło mniej niż 36 ps. Drugim przykładowym badaniem był „przesiew” czterech potencjalnych inhibitorów mirystoilacji białka Gag HIV, dla których obliczono % inhibicji na podstawie zmienności średniego czasu życia fluorescencji donora w zależności od stężenia inhibitora, zmierzonego w komórkach Hela wykazujących ekspresję białka Gag znakowanego CFP. Odczyt ten opiera się na homoFRET, który zazwyczaj nie powoduje zmiany czasu życia donora, jednak w przypadku CFP następuje ona, ponieważ białko to występuje w wielu izomerach o różnych czasach życia fluorescencji. Może to być użyteczne pod kątem wydajności spektralnej, np. przy multipleksowaniu różnych odczytów FRET25. Trzecim przykładowym badaniem był monitoring w czasie rzeczywistym żywych komórek HEK293T wykazujących ekspresję biosensora FRET dla cAMP, EPAC. Wykazano oczekiwaną odpowiedź po zastosowaniu forskoliny oraz wykorzystaniu programu FLIMfit z modelem podwójnego wykładniczego zaniku, przy czym liczba wykrytych fotonów była współmierna do obrazowania żywych komórek — co wykazaliśmy wcześniej w przypadku biosensora FRET LIBRA dla IP347.

figure-results-2
Rycina 1. Schemat szerokopolowego czasowo-bramkowanego FLIM z wykorzystaniem bramkowanego wzmacniacza obrazu optycznego (GOI). Po lewej stronie znajduje się schemat układu doświadczalnego. W prawym górnym rogu schemat impulsu wzbudzenia, położenie obrazów czasowo-bramkowanych oraz dopasowanie monoeksponencjalne do danych. W prawym dolnym rogu rysunek przedstawiający zanik fluorescencji dwóch obiektów ukazanych w układzie doświadczalnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 2. Schemat szerokopolowego openFLIM-HCA z wykorzystaniem bramkowanego wzmacniacza obrazu optycznego (GOI). Szczegółowy opis komponentów systemu znajduje się w tekście głównym. Aby wyświetlić ten rysunek w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rysunek 3. Schemat optycznie sekcjonowanego systemu openFLIM-HCA z wykorzystaniem bramkowanego wzmacniacza obrazu optycznego (GOI) z jednostką skanera z tarczą Nipkowa. Szczegółowy opis komponentów systemu znajduje się w tekście głównym. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-5
Rysunek 4. Schemat przepływu danych obrazowych z programu akwizycyjnego Manager do serwera OMERO lub dysku komputera oraz do programu FLIMfit w celu analizy.Przepływ danych rozpoczyna się w lewym górnym rogu, gdzie surowe dane obrazowe są pozyskiwane w oprogramowaniu akwizycyjnym μ-Manager. Elementy wewnątrz przerywanej ramki reprezentują etapy analizy danych FLIM, natomiast elementy na zewnątrz odpowiadają akwizycji i przechowywaniu danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 5. Zrzut ekranu interfejsu użytkownika FLIMfit. W lewym górnym rogu lista obecnie załadowanych pól widzenia oraz obraz intensywności fluorescencji dla aktualnie wybranego pola widzenia. W lewym dolnym rogu wybór modelu dopasowania i warunków dopasowania. W prawym górnym rogu zanik fluorescencji dla aktualnego obszaru zainteresowania (niebieskie okręgi), dopasowanie do danych (czerwona linia), IRF (czerwona przerywana linia) oraz rezydua dopasowania poniżej (niebieska linia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 6. FLIM na płytce wielodołkowej dla modelowych konstruktów FRET mTq5V, mTq17V, mTq32V ekspresowanych w komórkach Cos. (a) przykładowe obrazy czasu życia fluorescencji dla pól widzenia (FOV) w każdej dołku dla różnych konstruktów FRET ekspresowanych w komórkach Cos, zgodnie z opisem w tekście. (b) mapa ciepła średnich czasów życia fluorescencji Venus uśrednionych dla wszystkich komórek w każdym dołku. (c) obraz intensywności mTurquoise Amber nałożony na mapę czasu życia (skala 20 µm). (d) obraz intensywności mTurquoise Venus (17 aminokwasów) nałożony na mapę czasu życia (skala 20 µm). (e) zmierzony profil zaniku intensywności (niebieskie kółka) fluorescencji konstruktu mTq5A (kontrola negatywna) uśredniony dla wszystkich komórek obrazowanych w dołku A1, wraz z dopasowaniem danych do zaniku monoeksponencjalnego (niebieska linia ciągła) oraz IRF (pomarańczowa linia przerywana). (f) wykres średniego czasu życia uśrednionego dla każdej kolumny na płytce wielodołkowej, z słupkami błędów reprezentującymi odchylenie standardowe czasu życia fluorescencji między polami widzenia. Dla (a-d) wartości czasu życia przedstawiono za pomocą fałszywej skali kolorów z wskazanymi granicami w pikosekundach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 7. Przykładowy screening FLIM inhibitorów Gag na płytce wielodołkowej z użyciem komórek HeLa eksponujących Gag-CFP. (a) Mapa ciepła średniego czasu życia fluorescencji donora na dołek dla płytki wielodołkowej, w której kolumna 1 przedstawia komórki transfekowane myr-Gag-CFP jako kontrolę pozytywną inhibicji, kolumna 11 przedstawia komórki transfekowane Gag-CFP poddane działaniu samego nośnika, a przerywane kolorowe kwadraty wskazują dołki, w których zastosowano jeden z czterech różnych inhibitorów w stężeniach od wysokiego w kolumnie 2 do niskiego w kolumnie 10. Fałszywa skala kolorów reprezentuje średni czas życia fluorescencji w zakresie od 2,200 ps do 3,100 ps. (b) Wykresy czasu życia fluorescencji dla każdego inhibitora z paskami błędów reprezentującymi odchylenie standardowe między powtórzeniami w dołkach. Czarne punkty w położeniach 2 i -4 na osi poziomej to odpowiednio punkty kontroli pozytywnej i negatywnej, uzyskane z kolumn 1 i 11. Linie ciągłe wskazują dopasowanie do danych krzywej odpowiedzi na dawkę dla różnych inhibitorów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-9
Rysunek 8. Przykładowe zastosowanie FLIM do odczytu biosensora FRET EPAC w pomiarze time-lapse z wykorzystaniem komórek HEK293T. Zmiana (a) średniego czasu życia fluorescencji oraz (b) frakcji donora uczestniczącego w FRET w funkcji czasu po dodaniu forskoliny, zaznaczonej zielonym paskiem. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy na komórkę. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

na dołekSTDBŁĄDna dołekSTDBłąd
mT5A40083212mT17V30042610
mT5V27173513mT32V31333011

Tabela 1. Średni czas życia i odchylenie standardowe (STD) konstruktów FRET.

Dyskusja

Opisaliśmy zautomatyzowany wielodołkowy mikroskop płytkowy przeznaczony dla HCA przy użyciu bramkowanego czasowo FLIM. Sterowanie tym urządzeniem odbywa się za pomocą oprogramowania open source napisanego w μManager z opcją zapisywania danych na serwerze OMERO i przeprowadzania analizy danych FLIM za pomocą FLIMfit36, programu open source napisanego w MatLab i dostępnego jako klient OMERO32 Oprogramowanie do sterowania przyrządami μManager , openFLIM-HCA, jest dostępne online33 wraz z listą komponentów systemu48 aby umożliwić naukowcom akademickim konstruowanie własnych instrumentów FLIM HCA.

W celu uzyskania wiarygodnych danych FLIM konieczna jest optymalizacja ustawień akwizycji IWP i CCD oraz uwzględnienie wszelkich zmian w t0. Jak opisano w 3.8.2, ustawienie wzmocnienia GOI i czas integracji kamery CCD powinny być ustawione tak, aby osiągały ~75% zakresu dynamiki CCD. Użycie wyższych napięć GOI i wielokrotnej akumulacji ramek CCD przy każdym opóźnieniu bramki czasowej zwiększa stosunek sygnału do szumu49 , ale zwiększa to całkowity czas akwizycji FLIM (ponieważ mniej fotonów fluorescencyjnych jest rejestrowanych na klatkę przed nasyceniem kamery CCD, a więc liczba akumulacji klatek powinna zostać zwiększona), a więc ten kompromis powinien być ustalany dla każdego eksperymentu. Kalibracja generatora opóźnienia zależy od częstotliwości powtarzania lasera i dlatego konieczne jest upewnienie się, że do oprogramowania akwizycyjnego został załadowany prawidłowy plik kalibracyjny dla zastosowanej częstotliwości powtarzania. Procedurę kalibracji skrzynki opóźniającej można znaleźć na wiki openFLIM-HCA33.

Jeśli autofluorescencja komórkowa jest niska w porównaniu z sygnałem fluorescencyjnym, używamy sygnału z dołka zawierającego tylko pożywkę hodowlaną, aby zapewnić tło zmieniające się w czasie (TVB). Aby zminimalizować fluorescencję tła z pożywki do hodowli komórkowych, unikamy pożywek zawierających czerwień fenolową. Jeśli autofluorescencja komórkowa jest znacząca, wówczas LZA może pochodzić z pomiarów nieznakowanych komórek. Jednak w tym przypadku należy zachować ostrożność, ponieważ zakłada się, że tło autofluorescencji jest takie samo dla każdego piksela na obrazie. Założenie to nie będzie ważne, jeśli autofluorescencja zmienia się znacznie w komórce lub jeśli wiązka wzbudzająca lub czułość wykrywania nie są jednakowe w polu widzenia.

Akwizycja obrazu IRF za pomocą rozproszonych impulsów świetlnych wzbudzenia zapewnia czasowy profil IRF, który jest konwolucyjny z modelem danych w procesie dopasowania, a także zapewnia mapę przestrzennej zmienności IRF w całym polu widzenia. IRF można zmierzyć, obrazując próbkę rozpraszającą, taką jak zawiesina koloidalna, chociaż w naszym instrumencie użycie światła wzbudzenia rozproszonego z dysku Nipkowa zapewnia czystszy pomiar IRF. Dokładne określenie czasu IRF jest ważne, ponieważ błędy w opóźnieniu czasowym między wzbudzeniem a bramkowaniem czasowym mogą znacząco wpłynąć na proces dopasowania, szczególnie w przypadku dopasowania do złożonych modeli rozpadu wykładniczego. IRF uzyskany za pomocą rozproszonego światła wzbudzenia nie jest dokładnie tym, co jest potrzebne w procesie dopasowania, ponieważ jest rejestrowany na długości fali wzbudzenia, a nie na długości fali emisji fluorescencji, co może wpływać na jego czas, chociaż przestrzenna zmienność IRF powinna być taka sama na obu długościach fal. Ponadto, rozproszony IRF może być globalnie przesunięty w czasie w stosunku do prawdziwego IRF ze względu na różną długość ścieżki optycznej od obiektu rozpraszającego, jak ma to miejsce w przypadku IRF uzyskanego z dysku Nipkowa w optycznie przekrojonym FLIM. Ta poprawka, t0, która jest wymaganym globalnym przesunięciem czasowym, które powinno być zastosowane do nabytego rozproszonego światła wzbudzenia IRF, oblicza się na podstawie danych dotyczących monowykładniczego barwnika referencyjnego, jak wskazano w kroku 4.4 protokołu. Następujące barwniki mogą być stosowane dla różnych długości fal wzbudzenia: do wzbudzenia w zakresie 295-442 nm można użyć roztworu kumaryny 153 o sile 75 μM w metanolu (τ ~ 4,3 ns50); do wzbudzenia w zakresie 430-500 nm można użyć roztworu kumaryny 6 o stężeniu 75 μM w etanolu (τ ~ 2,43 ns37); i 75 μM roztwór rodaminy B w wodzie (τ ~ 1,7 ns37) może być użyty do wzbudzenia w zakresie 488-575 nm. Zwracamy uwagę, że chociaż w FLIMfit możliwe jest użycie innego IRF dla każdego piksela systemu, zwykle rozsądne jest założenie, że przestrzennie zmienny IRF ma ten sam profil czasowy dla każdego piksela na obrazie, ale prezentuje zakres przestrzennie zmieniających się przesunięć czasowych względem globalnego t0. Opisujemy to jako mapę przesunięcia IRF, która jest wyznaczana na podstawie IRF światła rozproszonego. Profil IRF, t0 i mapa przesunięcia IRF są używane razem, aby zapewnić, że każdy piksel w polu widzenia jest wyposażony w odpowiedni IRF. Co ważne, t0 może zmieniać się powoli w czasie, dlatego należy je zmierzyć przed akwizycją danych FLIM.

Użytkownik powinien zdecydować, w jaki sposób próbkować profile zaniku fluorescencji i jest zobowiązany do ustawienia szerokości bramek czasowych i ich względnych opóźnień po wzbudzeniu. Ogólnie rzecz biorąc, pożądane jest stosowanie szerokich szerokości bramek, aby zmaksymalizować wykrywany sygnał i zazwyczaj używamy szerokości bramki ustawionej na 4 ns dla FLIM komórek znakowanych białkami fluorescencyjnymi. Liczba opóźnień bramki czasowej powinna być wystarczająca do pobrania próbki profilu zaniku fluorescencyjnego (w tym jednego zestawu bramek do pomiaru sygnału tuż przed impulsem wzbudzenia), biorąc pod uwagę złożoność modelu dopasowania, który zostanie użyty w analizie. Optymalna wartość może zależeć od czasu życia i względnych amplitud składników rozpadu. Ogólnie rzecz biorąc, 4 bramki są wystarczające do dopasowania rozpadów monowykładniczych, podczas gdy 7 lub więcej bramek może być używanych do bardziej złożonych modeli rozpadu.

Zwracamy uwagę, że FLIM może być zaimplementowany przy użyciu szeregu technik w dziedzinie czasu lub częstotliwości, a zautomatyzowany FLIM HCA wielodołkowych tablic płytek został po raz pierwszy zaimplementowany w (niesekcyjnym) mikroskopie szerokokątnym przy użyciu odczytów czasu życia w dziedzinie częstotliwości FRET51. Następnie zgłoszono pierwszy zautomatyzowany czytnik wielodołkowych płytek FLIM do sekcji optycznej dla HCA wykorzystujący obrazowanie bramkowane czasowo w szerokim polu28 . Następnie, FLIM HCA w dziedzinie częstotliwości o szerokim polu (bez sekcji) zastosowano do badań przesiewowych pod kątem modyfikacji potranslacyjnych (fosforylacja tyrozyny) w bibliotece genów przy użyciu FRET52 , a bramkowany czasowo FLIM HCA zastosowano do testów FRET oligomeryzacji HIV-1 Gag53 i SUMOylacji FOXM154 oraz biosensorów Raichu RhoA i Rac133. Możliwe jest również zastosowanie TCSPC do płytek wielodołkowych FLIM26 , ale do tej pory okazało się, że trudno jest dorównać przepustowości technikom wykorzystującym detekcję w szerokim polu. Jednym z pojawiających się podejść, które może rozwiązać ten problem, jest wykorzystanie matryc detektorów zliczających pojedyncze fotony, takich jak tablice55.

Zwracamy uwagę, że wszelkie odczyty FRET przy użyciu białek fluorescencyjnych powinny być traktowane z ostrożnością, a bezwzględne wartości parametrów uzyskane z FLIMfit lub innego oprogramowania do analizy FLIM będą zależeć od założeń związanych z modelem dopasowania. Na przykład, gdy dawca FRET ma znaczący drugi składnik rozpadu, zastosowanie modelu dwuwykładniczego w celu dopasowania danych FRET FLIM może spowodować, że udział szybszego składnika rozpadu, zwykle związany z populacją FRET, wydaje się wyższy niż powinien. Dlatego pożądane jest stosowanie dawców o monowykładniczym czasie życia, takich jak mTq2FP. Nawet wtedy ostatnie badania wykazały, że na analizę FRET mogą nadal wpływać ciemne stany akceptorowych białek fluorescencyjnych lub niejednorodność czynnika orientacji κ2 ze względu na rozkład konformacji fluoroforów z różnymi kątami i odległościami chromoforu56. Niemniej jednak my i inni wykazaliśmy, że odczyty czasu życia fluorescencji FRET dają użyteczne wyniki, które korelują z pomiarami biochemicznymi i mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych interakcji białek lub do śledzenia dynamiki bioczujników. W ten sposób ta platforma openFLIM HCA może być stosowana do szerokiej gamy testów opartych na żywotności fluorescencji z wykorzystaniem FRET lub autofluorescencji komórkowej8, a także zapewnia ilościowe odczyty sond na bazie barwników25.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Podziękowania

Autorzy dziękują za dofinansowanie od United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 i BB/M006786/1), UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, we współpracy z AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) oraz Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG potwierdza stypendium doktoranckie brytyjskiej Rady ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC). DA, DK i SW uznają stypendia doktoranckie w Centrum Kształcenia Doktorantów finansowanym przez EPSRC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ramka mikroskopuOlympusIX81http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
autofokus optycznyOlympusZDChttp://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
zmotoryzowany (x-y-z) stolikmikroskopowy Marzhauser00-24-565-0000Stolik ze źródłem
lasera wzbudzającegoControl FianiumSC400-4Wzmacniacz optyczny z bramką laserową http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ Supercontinuum
 Generatory opóźnień KentechHigh Rate Imager (HRI)
Kentech---Zobacz zwinny generator opóźnienia i kamerę precyzyjnego generatora opóźnienia
HamamatsuORCA-ER-II
Nipkow YokogawaCSU-X1 http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Dyfuzorcylindra ThorlabsED1-S20-MDDyfuzory inżynieryjne
mTq5V Oxford GeneticsP3850mTurkusowy konstrukt Wenus z łącznikiem 5 aminokwasów
mTq17VOxford GeneticsP3847mTurkusowy konstrukt Wenus z 17-aminokwasowym łącznikiem
mTq32VOxford GeneticsP3848turkusowy konstrukt Wenus z 32-aminokwasowym łącznikiem
mTq5AOxford GeneticsP3849mturkusowy bursztynowy konstrukt
HEK293T------typ komórki używany
bez czerwieni fenolowej HBSSSigma Aldrich55021C-1000MLpożywka do obrazowania
pożywkahodowlana DMEM + 10% FBS + 0,5% Antybiotyki
DMEMSigma AldrichD6046-500MLdo pożywek hodowlanych
FBSSigma Aldrich12003C-500MLdo pożywek hodowlanych
xTremeGene9Sigma Aldrich6.37E+09do transfekcji postępuj zgodnie z protokołem online z La Roche
trypsin/EDTA SolutionThermo FischerR001100do odłączania komórek, postępuj zgodnie z protokołem online z Thermo Fischer
Corvus

Bibliografia

  1. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  3. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
  4. Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848(2015).
  5. König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
  6. Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
  7. Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
  8. Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
  9. Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
  10. Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
  11. Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor "LIBRA" for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
  12. Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
  13. Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
  14. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/full/388882a0.html 882-887 (1997).
  15. Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  16. Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
  17. Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
  18. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  19. Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/bookseries/00757535 (2009).
  20. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
  21. Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
  22. Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
  23. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2(2006).
  24. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  25. Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
  26. Barber, P. R., et al. The Gray Institute "open" high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
  27. Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
  28. Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231(2012).
  29. Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
  30. Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
  31. Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687(2013).
  32. OpenMicroscopy.org. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/site/products/omero (2016).
  33. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016).
  34. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11(2014).
  35. Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  36. FLIMFit webpage. , Available from: http://www.flimfit.org (2016).
  37. Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, Ø Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
  38. Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
  39. Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
  40. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
  41. Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204(2008).
  42. Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
  43. Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
  44. Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z'Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
  45. Alibhai, D. Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , Imperial College London. PhD thesis, https://spiral.imperial.ac.uk:8443/handle/10044/1/26843 (2013).
  46. Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513(2015).
  47. Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
  48. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016).
  49. McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103(2009).
  50. Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
  51. Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
  52. Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
  53. Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
  54. Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
  55. Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
  56. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593(2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zautomatyzowana p ytka wielodo kowaoprogramowanie otwarto r d owebiosensory FREToligomeryzacja bia ekanaliza FLIMfunkcja odpowiedzi instrumentureferencyjne dane o czasie zanikuoprogramowanie FLIMfitbia ko Gag HIV

Powiązane artykuły