Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55120

⸱

24 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Streszczenie

Inwazyjne nowotwory, poważne urazy i infekcje mogą powodować ubytki kostne, które są zbyt duże, aby można je było zrekonstruować z wcześniej istniejącej kości z własnego ciała pacjenta. Zdolność do wzrostu kości de novo przy użyciu własnych komórek pacjenta pozwoliłaby na wypełnienie ubytków kostnych odpowiednią tkanką bez chorobliwości związanej z pobieraniem rodzimej kości. Istnieje zainteresowanie wykorzystaniem komórek zrębu pochodzącego z tkanki tłuszczowej (ASC) jako źródła inżynierii tkankowej, ponieważ są one pozyskiwane z obfitego źródła: własnej tkanki tłuszczowej pacjenta. Jednak ASC są populacją niejednorodną, a niektóre subpopulacje mogą być bardziej skuteczne w tym zastosowaniu niż inne. Izolacja najbardziej osteogennej populacji ASC może poprawić wydajność i skuteczność procesu inżynierii kostnej. W tym protokole ASC są pozyskiwane z podskórnej tkanki tłuszczowej od ludzkiego dawcy. Subpopulację ASC wyrażających marker BMPR-IB izoluje się za pomocą FACS. Komórki te są następnie poddawane testowi gojenia defektów kalwarycznych in vivo i okazuje się, że mają lepszy osteogenny potencjał regeneracyjny w porównaniu z komórkami niesortowanymi.

Wprowadzenie

Główne wady kości wynikające z urazu, infekcji lub inwazyjnego raka mają znaczący wpływ na powrót pacjenta do zdrowia i jakość życia. Istnieją techniki wypełniania tych ubytków zdrową kością z innego miejsca w ciele pacjenta, ale ten transfer niesie ze sobą własną chorobowość i ryzyko powikłań1,2,3. Ponadto niektóre ubytki są tak duże lub złożone, że nie jest dostępna wystarczająca ilość kości dawcy, aby wypełnić ubytek. Protezy są potencjalną opcją do wypełniania ubytków kostnych, ale wiążą się one z kilkoma wadami, w tym ryzykiem infekcji, awarią sprzętu i reakcją na ciało obce4.

Z tych powodów istnieje duże zainteresowanie możliwością inżynierii biologicznych substytutów kości przy użyciu własnych komórek pacjenta5. Komórki zrębowe pochodzenia tłuszczowego (ASC) mają potencjał do tego zastosowania, ponieważ są obficie dostępne we własnej tkance tłuszczowej pacjenta i wykazały zdolność do leczenia ubytków kostnych poprzez generowanie nowej tkanki kostnej6,7. ASC to zróżnicowana populacja komórek, a kilka badań wykazało, że selekcja pod kątem określonych markerów powierzchni komórek może wytworzyć populacje komórek o zwiększonej aktywności osteogennej8,9. Wybór ASC o najwyższym potencjale osteogennym zwiększyłby prawdopodobieństwo, że rusztowanie wysiane tymi komórkami może zregenerować duży ubytek kostny.

Sygnalizacja białka morfogenetycznego kości (BMP) jest kluczowa dla regulacji różnicowania i tworzenia kości10 i wiadomo, że receptor BMP typu IB (BMPR-IB) jest ważny dla osteogenezy w ASCs11. Ostatnio wykazaliśmy, że ekspresja BMPR-IB może być wykorzystana do selekcji ASC o zwiększonej aktywności osteogennej12. Tutaj demonstrujemy protokół izolacji ASC z ekspresją BMPR-IB z ludzkiego tłuszczu, a następnie test ich aktywności osteogennej przy użyciu modelu ubytku kalwarialnego in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Próbki uzyskano od pacjentów, którzy wyrazili świadomą zgodę. Wszystkie protokoły zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Stanforda. Podczas obchodzenia się z ludzkimi tkankami i komórkami zawsze przestrzegaj środków ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), określonych przez Twoją instytucję.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować bufor FACS: Dodać 10 ml FBS, 5 ml Poloxameru 188 i 5 ml Pen-Strep do 500 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Przygotuj mieszankę mineralną: Dodaj 0,375 g proszku kolagenazy C. hemolyticum typu II i 5 ml Poloxameru 188 do 500 ml sterylnego podłoża 199/EBSS.
  3. Przygotuj standardowe podłoże: Dodaj 50 ml FBS i 5 ml Pen-Strep do 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium.

2. Zbieranie i izolacja ASC

UWAGA: Upewnij się, że istnieją odpowiednie instytucjonalne zgody na stosowanie tkanek ludzkich i izolowanie ludzkich komórek macierzystych. Uzyskaj ludzką podskórną tkankę tłuszczową z brzucha, boku lub uda od zdrowego dawcy poddanego planowej liposukcji. Trzymaj tłuszcz w plastikowym kanistrze ssącym.

  1. Dodaj sterylny PBS w stosunku 1:1 do tłuszczu w oryginalnym plastikowym kanistrze. (Jeśli jest 500 ml tłuszczu, dodaj 500 ml PBS). Mieszać przez delikatne mieszanie przez 30 s. Poczekaj, aż warstwa wodna osiądzie na dnie (rysunek 1), a następnie odessać i wyrzucić warstwę wodną za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml podłączonej do odsysania.
  2. Przelej tłuszcz do dużego plastikowego pojemnika i dodaj mieszankę mineralną w stosunku 1:1. Zamknij pojemnik i wyczyść zewnętrzną stronę 70% etanolem. Uszczelnij nakrętkę folią parafinową.
  3. Mieszać ten pojemnik w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Zneutralizuj trawienie, dodając standardową pożywkę w stosunku 1:1. (Jeśli jest 1,000 ml mieszaniny tłuszczu, dodaj 1,000 ml standardowej pożywki).
  5. Rozprowadzić mieszaninę równomiernie na parzystą liczbę stożkowych probówek wirówkowych z tworzywa sztucznego o pojemności 250 ml i odwirować mieszaninę przy 300 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C.
  6. Odessać supernatant i uważać, aby pozostawić osad nienaruszony. Zawiesić granulki w standardowym podłożu o pojemności 5 ml dla każdej stożkowej probówki.
  7. Przefiltruj zawiesinę przez filtr 100 mikronów do jednej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie odwirować przy 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforze do lizy RBC o temperaturze pokojowej. Pozostaw mieszaninę na 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj przy 300 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml roztworu wzorcowego. Ponownie przefiltruj przez filtr 100 mikronów do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  10. Do nowego stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml dodaj 15 ml roztworu polisacharozy przeznaczonego do rozdzielania na podstawie gęstości (patrz lista odczynników). Następnie, trzymając probówkę pod kątem 45°, ostrożnie odpipetować komórki na bok probówki, tak aby zawiesina komórek delikatnie nałożyła się na wierzch roztworu polisacharozy (Rysunek 2).
    UWAGA: Ważne jest, aby pipetować komórki na powierzchnię roztworu. Nie należy dodawać roztworu polisacharozy do zawiesiny komórek, ponieważ spowoduje to powstanie nieodwracalnej mieszaniny. Podobnie, nie należy pipetować komórek do środka roztworu polisacharozy.
  11. Odwirować tę mieszaninę przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyć niskiego przyspieszenia (2 - 3 z 10) i ustawić funkcję hamowania wirówki na zero na tym etapie.
    UWAGA: Widoczne będą trzy warstwy: przezroczysta na dole, mętna w środku i łososiowa na górze. Środkowa warstwa zawiera interesujące komórki.
  12. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml ostrożnie usuń środkową warstwę i przenieś do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Lepiej jest całkowicie przenieść środkową warstwę i w tym procesie wziąć część górnej i dolnej warstwy, niż pozostawić część środkowej warstwy.
  13. Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ całkowitą liczbę żywych komórek.
    UWAGA: Zwykle używamy błękitu trypanowego dodawanego do mieszaniny komórek do końcowego stężenia 0,8%, aby pomóc w liczeniu komórek. Żywe komórki nie wchłoną niebieskiego barwnika i będą wydawać się białe.

3. Sortowanie FACS dla komórek dodatnich BMPR-IB i przygotowanie rusztowań zawierających komórki

  1. Odwirować zawiesinę komórek przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS w stężeniu 1 miliona komórek na 100 μl (na podstawie liczby komórek przeprowadzonej w kroku 2.13).
  2. Przenieś co najmniej 10 milionów komórek do plastikowej probówki wirówkowej oznaczonej "BMPR-IB". Oddzielnie przenieś milion komórek z 100 μl buforu FACS do oddzielnej plastikowej probówki wirówkowej oznaczonej "Niebarwiona". Dodaj 1 ml buforu FACS do probówki "Niebarwiony". Pozostałe komórki w buforze FACS należy przechowywać na lodzie podczas wykonywania części eksperymentu dotyczącej sortowania FACS. Oznacz te komórki jako "Nieposortowane". Użyj ich jako kontrolek w dalszej części eksperymentu.
  3. Dodać odpowiednią ilość fluorescencyjnego przeciwciała anty-ludzkiego BMPR-IB do probówki "BMPR-IB" zgodnie z instrukcjami producenta. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby rozprowadzić przeciwciało.
    UWAGA: Używamy ludzkiego przeciwciała sprzężonego z APC BMPR-IB/ALK-6 w rozcieńczeniu 1:10 (szczegółowe informacje znajdują się na liście odczynników). Jednak przeciwciała różnych producentów będą miały różne zalecane stężenia.
  4. Przykryj wiaderko z lodem w taki sposób, aby nie przedostawało się światła. Pozostaw mieszaninę komórki/przeciwciała na 30 minut (lub zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciał).
    UWAGA: Jeśli przeciwciało anty-BMPR-IB występuje jako pierwszorzędowe niesprzężone przeciwciało, które wymaga przeciwciała drugorzędowego, należy wykonać oddzielny etap barwienia na lodzie z przeciwciałem drugorzędowym zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Odwirować obie probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, uważając, aby nie zassać osadu. Zawiesić granulowane komórki w 1 ml buforu FACS. Ponownie odwirować probówki o masie 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS do stężenia 1 miliona komórek na 1 ml.
  6. Przefiltruj komórki "BMPR-IB", "niebarwione" i "niesortowane" przez sitka do komórek o średnicy 40 mikronów do nowych oznakowanych szklanych probówek FACS. Przepłucz filtry buforem FACS o pojemności 500 μl, aby upewnić się, że komórki nie pozostały w filtrze. Dodaj również 2 ml standardowej pożywki do dwóch oddzielnych plastikowych probówek wirówkowych oznaczonych jako "BMPR-IB-dodatni" i "BMPR-IB-ujemny". Użyj tych dwóch, aby zebrać posortowane komórki w maszynie FACS.
  7. Na maszynie FACS użyj niebarwionych komórek, aby zdefiniować ujemną bramkę dla markera fluorescencyjnego.
  8. Za pomocą dyszy o średnicy 100 mikronów posortuj dodatnie i ujemne komórki BMPR-IB do odpowiednich probówek zawierających standardowe podłoże. Probówki te należy przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C podczas sortowania, jeśli maszyna FACS ma taką zdolność.
    UWAGA: Proszę zapoznać się z artykułem JOVE13 autorstwa Sharon et al., aby uzyskać doskonały protokół sortowania FACS.
  9. Za pomocą hemocytometru policz komórki w każdej probówce. Odwirować probówki "BMPR-IB-dodatnie", "BMPR-IB-ujemne" i "niesortowane" o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zassać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Następnie ponownie zawiesić komórki w standardowym podłożu do stężenia 1 miliona komórek na 250 μl.
  10. Otrzymać wstępnie pocięte 4 mm rusztowania PLGA (kwas poli[mlekowo-ko-glikolowy]) pokryte hydroksyapatytem. Umieść każde rusztowanie w studzience z 24-dołkową płytą. Przykryj każde rusztowanie 50 μl zawiesiny komórek (tj. 200 000 komórek) z jednej z trzech grup: niesortowane, BMPR-IB-dodatnie i BMPR-IB-ujemne (ryc. 3).
    UWAGA: Proszę zapoznać się z artykułem JOVE 14 autorstwa Lo et al., aby uzyskać szczegółowe informacje na temat budowy rusztowań PLGA.
  11. Częściowo napełnić otaczające puste studzienki standardową pożywką (aby zapobiec wysuszeniu rusztowań), przykryć płytkę pokrywką i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C przez 30 minut.

4. Tworzenie wad kalwarycznych i zastosowanie rusztowania zawierającego ACS

UWAGA: Upewnij się, że istnieją odpowiednie instytucjonalne zgody na tworzenie wad kalwarycznych u żywych myszy. Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanforda.

  1. Znieczulij nagą mysz CD-1 za pomocą wdychanego gazu izofluranowego lub wstrzykniętego długo działającego koktajlu znieczulającego.
    1. Aby użyć samego gazu, umieść mysz w komorze anestezjologicznej i rozpocznij przepływ tlenu z prędkością 2 - 3 l/min przy 2% stężeniu izofluranu. Gdy mysz jest całkowicie nieprzytomna, połóż ją na kocu z recyrkulacją ciepłej wody z podkładką absorpcyjną i umieść jej pysk w stożku do znieczulenia nosa o tym samym stężeniu tlenu i izofluranu. Uważnie monitorować częstość oddechów i w razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu.
    2. Aby użyć wstrzykniętego, długo działającego koktajlu znieczulającego, znieczul mysz w komorze anestezjologicznej, jak opisano powyżej, a następnie wstrzyknij koktajl znieczulający. Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i obserwuj jej zachowanie.
      UWAGA: Mysz może na chwilę wyjść ze znieczulenia, ale w ciągu kilku minut powinna być ponownie w pełni znieczulona pod wpływem wstrzykniętego środka znieczulającego. Przenieś mysz do koca z recyrkulacją ciepłej wody pokrytego podkładką chłonną.
      UWAGA: Do koktajlu znieczulającego zalecamy mieszankę zawierającą ketaminę 10 mg/ml i ksylazynę 1 mg/ml w soli fizjologicznej, podawaną dootrzewnowo. Standardowa dawka tej mieszanki to 300 μl dla myszy 30 g, co odpowiada ketaminie 100 mg/kg i ksylazynie 10 mg/kg. Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat środka znieczulającego do wstrzykiwań.
    3. Użyj manewru szczypania palców u stóp, aby określić głębokość znieczulenia. Odpowiednio znieczulona mysz nie cofnie łapy, gdy zostanie lekko uszczypnięta przez chirurga.
    4. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
    5. Podawać 1 mg/kg buprenorfiny SR podskórnie.
      UWAGA: Podanie środka przeciwbólowego przed zabiegiem powoduje lepszą ulgę w bólu.
    6. Podczas całego zabiegu monitoruj częstość oddechów myszy.
      UWAGA: Mysz prawidłowo znieczulona izofluranem powinna mieć częstość oddechów 50 - 100 oddechów/min. Zwiększona częstość oddechów wskazuje, że znieczulenie jest zbyt lekkie, podczas gdy zmniejszone tempo oddechów może wskazywać, że znieczulenie jest zbyt głębokie.
  2. Przygotuj skórę grzbietowej części czaszki roztworem jodu powidonu, a następnie trzykrotnie 70% etanolem. Ułóż sterylne serwety, pozostawiając odsłonięte pole operacyjne.
    UWAGA: Podczas zabiegu należy nosić sterylne rękawice chirurgiczne i utrzymywać sterylną technikę. Dotykaj wyłącznie sterylnych powierzchni i przedmiotów, takich jak sterylna serweta i narzędzia autoklawowane. Poproś asystenta o dostosowanie oświetlenia, otwarte pakiety szwów itp.
  3. Za pomocą skalpela z 15 ostrzami wykonaj strzałkowe nacięcie w linii środkowej, które rozciąga się na większą część czaszki grzbietowej. Za pomocą kleszczy o drobnych zębach cofnij skórę po prawej stronie nacięcia, aby odsłonić prawą kość ciemieniową.
  4. Za pomocą wiertła z autoklawowanym wiertłem trepanacyjnym o średnicy 4 mm pokrytym diamentem wywierć ubytek przez kość ciemieniową. Nie należy rozciągać ubytku poza kość do warstwy opony twardej. (Rysunek 4)
  5. Umieść rusztowanie w ubytku, a następnie zamknij nacięcie skóry za pomocą biegnącego nylonowego szwu.
  6. Monitoruj mysz i zapewnij standardową opiekę pooperacyjną zgodnie z wytycznymi instytucji.
    1. Trzymaj mysz na czystym ręczniku papierowym w czystej klatce podczas rekonwalescencji. Jedną połowę klatki należy umieścić na kocu z recyrkulacją ciepłej wody i mysz należy początkowo umieścić w tej połowie.
    2. Nie zostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby się poruszać. Nie należy zwracać myszy, która przeszła operację, do klatki z innymi myszami, dopóki nie zostanie w pełni wyleczona.
  7. Powtórz powyższe kroki z nową myszką dla każdego rusztowania, które ma być testowane. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne między operacjami za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami lub innej odpowiedniej metody.
  8. Krótko po zabiegu, a następnie w 2, 4, 6 i 8 tygodniu, użyj mikrotomografii komputerowej, aby przeanalizować szybkość zamykania się ubytku kalwarii.
    UWAGA: Zobacz artykuł Levi i wsp.6 dla opisu mikrotomografii komputerowej wad kalwarii.
  9. Po zakończeniu eksperymentu należy poddać myszy eutanazji, umieszczając je w czystej komorze eutanazyjnej i rozpoczynając przepływ gazowego dwutlenku węgla do komory z prędkością 2 l/min. Po całkowitym ustaniu oddychania (po około 10 minutach) należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić eutanazję.
  10. Opcjonalnie, po zakończeniu eksperymentu, należy zastosować sekcje i barwienie histologiczne, aby ocenić tworzenie się kości w obrębie ubytku.
    UWAGA: Zobacz artykuł McArdle i wsp.12 aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania próbek kości do badania histologicznego. Przegląd technik histologicznych i barwienia można znaleźć w podręczniku histologicznym, takim jak Manual of Surgical Pathology15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skan micro-CT wykonany w dniu operacji wyraźnie pokaże ubytek w czaszce. Na tym etapie nie będzie widocznego wrastania tkanki w obszar ubytku o rozmiarze 4 mm. Kolejne skany są wykonywane w odstępach czasowych, aby określić wielkość ubytku w czasie w porównaniu z wartością wyjściową. Ubytki zasiane komórkami BMPR-IB+ powinny wykazywać szybsze zamknięcie w porównaniu z komórkami BMPR-IB- oraz niesortowanymi (Rycina 5). Ponadto fragment czaszki zawierający ubytek można odwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Podczas zbioru ASC krytycznym etapem jest odpowiednie trawienie tłuszczu za pomocą kolagenazy. Nieodpowiednie trawienie spowoduje niską wydajność ASC. Podczas sortowania komórek BMPR-IB + metodą FACS ważne jest, aby dokładnie zdefiniować bramkę dla pozytywności. Zbyt luźne definiowanie bramek może spowodować, że posortowane populacje nie będą czyste. Podczas tworzenia ubytku kalwarycznego bardzo ważne jest, aby przewiercić ubytek przez kość czaszki, ale nie przed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

Podziękowania

C.D.M. był wspierany przez American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. był wspierany przez California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L. i M.T.L. byli wspierani przez American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. był wspierany przez grant NIH R01 GM087609 oraz prezent od Ingrid Lai i Billa Shu na cześć Anthony'ego Shu. H.P.L. i M.T.L. byli wspierani przez Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine i The Oak Foundation. M.T.L. był wspierany przez granty NIH U01 HL099776, R01 DE021683-01 i RC2 DE020771. D.C.W. był wspierany przez grant NIH 1K08DE024269, Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine oraz Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sitko do komórek 100 mikronówFalcon352360
Skalpel z 15 ostrzamiMiltex4-515
24-dołkowa płytkaCorning3524
Sitko do komórek 40 mikronówFalcon352340
50 ml stożkowe probówki wirówkoweFalcon352098
6-0 Ethilon nylon, 18", igła P-3, Ethicon1698G
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-BMPR-IBR& Systemy DFAB5051A
Rękawice chirurgiczne BioGel PIMö lnlycke Opieka zdrowotnaALA42675Z
Buprenorfina SRZooPharm
Castro-Viejo sterownik igiełFine Science Tools12565-14
CD1 naga myszCharles River086
Kolagenaza typu II w proszkuGibco17101-015
DMEM mediumGibco10564-011
Wiertło: Nóż tarczowy 4,0 mmXemax SurgicalCK40
Wiertło: Z500 Bezszczotkowy mikrosilnikNSKNSKZ500
FBSGicbo10437-077
Podkładki chłonne Fisherbrand, 20" x 24"Fisher Scientific14-206-62
Fisherbrand Sterylny bawełniany gazik, 4" x 4"Fisher Scientific22-415-469
Poduszka grzewczaKent ScientificDCT-20
Hyclone 199/EBSS mediumGE  Nauki biologiczneSH30253.01
Isothesia isofluranHenry Schein 
Mikro kleszcze z zębamiRobozRS-5150
Mikro kleszcze z zębamiRobozRS-5150
Folia parafinowa (Parafilm)BemisPM996
PBSGibco10010-023
Pen-StrepGibco15140-122
Rusztowania PLGAZastrzeżona formuła
Poloxamer 188, 10%SigmaP5556-100ML
Polylined Sterylne pole, 18" x 24"Busse Hospital Jednorazówki696Wytnij prostokątny otwór o odpowiednim rozmiarze
Roztwór polisacharozy: Histopaque 1119Sigma11191
Roztwór do przygotowania jodu powidonuMedlineMDS093944H
Maść okulistyczna Puralube petrolatum, tubka 1/8 uncjiDechra Veterinary Products
Bufor do lizy RBCSigma11814389001
Waciki nasączone alkoholem WebcolCovidien6818
050033

Bibliografia

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177(2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425(2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. Manual of surgical pathology. , Saunders/Elsevier. (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki BMPR IB dodatnieizolacja FACSmodel defektu czaszkowegoosteogenny potencja regeneracyjnyprotok trawienia tkanekprocedura sortowania kom rekanaliza mikro CTludzka tkanka t uszczowa podsk rnagojenie defekt w kostnych
Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.