Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Morfogeneza jajowodów jest podstawowym wymogiem dla rozwoju większości organów ssaków, w tym męskiego układu rozrodczego. Najądrze, integralna część męskiego układu rozrodczego, jest odpowiedzialna za przechowywanie, dojrzewanie i transport plemników. Dorosły najądrze jest silnie zwiniętą rurką, która rozwija się z prostego i prostego prekursora embrionalnego znanego jako przewód Wolffa (WD). Prawidłowe zwijanie się najądrza jest niezbędne dla męskiej płodności, ponieważ plemniki w jądrze nie są w stanie zapłodnić oocytu. Jednak mechanizm odpowiedzialny za rozwój i zwijanie się najądrzy pozostaje niejasny, częściowo z powodu braku hodowli całego narządu i metod obrazowania. W tym badaniu opisujemy system hodowli in vitro i protokół immunofluorescencji całego mount, aby lepiej zobrazować proces zwijania i rozwoju WD, który można również zastosować do badania innych narządów rurkowych.
Wprowadzenie
Męski układ rozrodczy składa się głównie z jąder, miejsca rozwoju i różnicowania komórek rozrodczych, oraz złożonego systemu przewodowego, który jest niezbędny do dojrzewania, transportu i przechowywania plemników. Najądrze to narząd rurkowy, który łączy jądra z nasieniowodami i bierze głównie udział w rozwoju pozajądrowym i dojrzewaniu komórek rozrodczych 1. Silnie zwinięty najądrze dorosłej myszy rozwija się z prostej i prostej rurki prekursorowej, przewodu Wolffa (WD) 1. Złożona i zwinięta struktura najądrza jest niezbędna, aby plemniki nabrały zdolności do zapłodnienia żeńskich komórek rozrodczych 2. To, w jaki sposób tak niezbędny....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle i potwierdzone przez Ustawę o Badaniach nad Zwierzętami w Nowej Południowej Walii, Przepisy o Badaniach nad Zwierzętami w Nowej Południowej Walii oraz australijski kodeks opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych. Wszystkie procedury przeprowadzone na myszach zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle.
1. Czas krycia
- Para 6-8 tygodniowych samców i samic myszy tuż przed końcem cyklu dziennego.
- Spraw....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podczas rozwoju WD przechodzi znaczące zmiany, w wyniku których prosta rurka przekształca się w wysoce złożony i zwinięty przewód. Stosując opisane powyżej metody, WD ulegają podobnej transformacji w warunkach hodowli. Przedstawiono tutaj wyniki dla WD hodowanych przez 3 dni (Rysunek 3). Aby zbadać mechanizmy molekularne zaangażowane w morfogenezę WD, do pożywki hodowlanej można dodać inhibitory i aktywatory ukierunkowane na różne szlaki sygnałowe. Rysunek 3C przedstawia niezwinięty WD p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
System hodowli narządowej ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym systemem hodowli komórkowych. System ten zachowuje pierwotne relacje strukturalne i interakcje między różnymi typami komórek. Naśladuje systemy in vivo i dostarcza dokładniejszych informacji niż badania nad hodowlami komórkowymi, w których nie ma czynnika niszowego. Stosowanie systemów hodowli narządów ma nawet przewagę nad wykorzystaniem całego zwierzęcia. Należą do nich wyższe koszty użytkowania całego zwierzęcia, łatwa pielęgnacja i utrzymani.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom grupy ginekologiczno-onkologicznej za krytyczną lekturę tego manuskryptu. Praca ta jest częściowo wspierana przez fundusze z National Health and Medical Research Council, Australian Research Council oraz Cancer Institute NSW (P.S.T). M.K. jest stypendystką University of Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytki 24-dołkowe | Corning, USA | 3524 | można kupić u innych sprzedawców |
| Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | można kupić u innych dostawców |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS stosowany w pożywce hodowlanej |
| L-glutamina | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | Stosowane stężenie 1% |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco, USA | 15070-063 | Stężenie 1% używane |
| Whatman Nuclepore Poliwęglan Track-Etch | Whatman, USA | 110409 Membrana (0,8 &mikro; m) | |
| IWR1 | Sigma, Stany Zjednoczone | 10161-5mg | 100 &mikro; Stężenie M używane |
| Paraformaldehyd (PFA) | Mikroskopia elektronowa Sciences, USA | 15710 | 16% zapasu, 4% w PBS do stosowania. TOKSYCZNY - nosić rękawiczek i nie można wyrzucać do zlewu |
| Etanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, zrobić 25, 50 i 75% z wodą miliQ. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Bardzo lepki, ostrożny podczas dozowania |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Bardzo lepki, ostrożny podczas dozowania |
| wodorofosforanu sodu | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | można kupić u innych dostawców |
| Di-wodorofosforan sodu | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | można kupić od innych dostawców |
| Chlorek sodu | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | można kupić od innych dostawców |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 w buforze blokującym |
| aktywny i beta; Katenina | Technologia sygnalizacji komórkowej, USA | D13A1 | 1:200 w buforze blokującym |
| fosfo-histon 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 w buforze blokującym |
| Alexa488 Koza anty-królicza IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 w buforze blokującym |
| Alexa594 Goat anty-Rat | IgG Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 w buforze blokującym |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | można kupić od innych dostawców |
| Galan n-propylu | Sigma, USA | 2370-2 | |
| -(4-amidinofenylo)-1H -indolo-6-karboksyamidyna (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Służy do barwienia kwasów nukleinowych (DNA) |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | |
| Solvent Szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Bibliografia
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
