Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Męski układ rozrodczy składa się głównie z jąder, miejsca rozwoju i różnicowania komórek rozrodczych, oraz złożonego systemu przewodowego, który jest niezbędny do dojrzewania, transportu i przechowywania plemników. Najądrze to narząd rurkowy, który łączy jądra z nasieniowodami i bierze głównie udział w rozwoju pozajądrowym i dojrzewaniu komórek rozrodczych ¹. Silnie zwinięty najądrze dorosłej myszy rozwija się z prostej i prostej rurki prekursorowej, przewodu Wolffa (WD) ¹. Złożona i zwinięta struktura najądrza jest niezbędna, aby plemniki nabrały zdolności do zapłodnienia żeńskich komórek rozrodczych ². To, w jaki sposób tak niezbędny dla męskiej płodności narząd rozwija się i nabiera kształtu, nie jest dobrze poznane. Wykazano, że różne szlaki sygnałowe są zaangażowane w rozwój WD, takie jak szlak sygnałowy Wnt ^3,4 i szlak sygnałowy androgenów ⁵. Nasze ostatnie prace ustaliły wymóg zrównoważonej sygnalizacji Wnt dla zwijania WD podczas rozwoju prenatalnego ⁴. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby zrozumieć mechanizmy związane z poporodowym zwijaniem się najądrza, różnicowaniem komórkowym i komunikacją międzykomórkową w nabłonku najądrza i komórkami śródmiąższowymi.

Genetycznie modyfikowane modele myszy okazały się potężnym narzędziem do identyfikacji/walidacji mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju i choroby różnych układów narządów ⁶. Pomimo jego szerokiego zastosowania, istnieją znaczne ograniczenia genetycznie modyfikowanych modeli mysich, w tym nieprzewidywalny fenotyp docelowych mutantów myszy w odniesieniu do przypuszczalnej funkcji genów i brak fenotypu w mutantach zerowych w niektórych modelach, wpływ czynników genetycznych i środowiskowych, pracochłonny i czasochłonny proces opracowywania modeli mysich. W związku z tym interpretacja znaczenia wyników uzyskanych wyłącznie na genetycznie zmodyfikowanych modelach myszy nie zawsze jest prosta ⁶. Ograniczenia te można przezwyciężyć poprzez zastosowanie systemu hodowli narządów in vitro, który daje nam elastyczność w manipulowaniu wieloma szlakami sygnałowymi w czasie rzeczywistym w kontrolowanych warunkach hodowli. System hodowli narządów odgrywa zasadniczą rolę w zrozumieniu fizjologii i patologii całych narządów ⁷. Co więcej, obrazowanie całych narządów barwionych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem umożliwia nam wizualizację interesujących nas markerów w trójwymiarowym kontekście, tak jak to ma miejsce in vivo, zapewniając w ten sposób lepsze zrozumienie kształtu, struktury i funkcji narządu ⁸.

Tutaj opisaliśmy metody izolacji embrionalnych grzbietów gonad myszy, hodowli in vitro i obrazowania immunofluorescencyjnego całej góry WD, które mogą być zastosowane do odpowiedzi na różne pytania dotyczące morfogenezy narządów rurkowych, takich jak WD. W tym protokole wyizolowaliśmy mysie embrionalne grzbiety układu moczowo-płciowego od ciężarnych samic 15,5 dnia po stosunku (dpc) i hodowaliśmy je przez 3 dni, a następnie przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne dla markera komórek nabłonkowych (cytokeratyna 8, CK8), markera proliferacji komórek (fosfo-histon 3, PH3) i aktywna βkatenina.

Procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle i potwierdzone przez Ustawę o Badaniach nad Zwierzętami w Nowej Południowej Walii, Przepisy o Badaniach nad Zwierzętami w Nowej Południowej Walii oraz australijski kodeks opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych. Wszystkie procedury przeprowadzone na myszach zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle.

1. Czas krycia

1. Para 6-8 tygodniowych samców i samic myszy tuż przed końcem cyklu dziennego.
2. Sprawdzaj samice pod kątem obecności czopów dopochwowych wcześnie rano (najpóźniej o 8.00 rano), każdego dnia. Dzień wtyczki jest uważany za 0,5 dpc.
3. Przenieś samicę z czopem dopochwowym do nowej klatki (bez samca) i oznacz datę zatyczki.

2. Izolacja embrionalnych grzbietów gonad myszy

1. Wyizolować embrionalne grzbiety gonad myszy od ciężarnych samic o sile 15,5 dpc, jak opisano w ⁹, z kilkoma modyfikacjami opisanymi poniżej.
2. Sekcję należy przeprowadzić przed południem, ponieważ uważa się, że czas wejścia ciężarnych samic w następny dzień ciąży odbywa się po południu.
3. Uśmiercać ciężarne samice o nasileniu 15,5 dpc za pomocą zwichnięcia szyjki macicy (lub zgodnie z zatwierdzonym protokołem przez instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt).
4. Trzymaj mysz na plecach na chłonnej bibułce i spryskaj brzuszną stronę brzucha 70% etanolem.
5. Podnieś dolną część skóry brzucha (stronę brzuszną) za pomocą kleszczy i wykonaj boczne nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych, rozciągające się od otworu moczowo-płciowego do końca do klatki piersiowej. Pociągnij skórę w kierunku głowy zwierzęcia, aby odsłonić brzuch.
6. Przetnij mięśnie brzucha nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić jamę otrzewnej. Chwyć ciężką macicę kleszczami tuż nad szyjką macicy i wykonaj cięcie. Teraz podnieś macicę, trzymając się pęcherza moczowego i przetnij szerokie więzadło macicy, a następnie nacięcia w połączeniach macicowo-jajowych, aby oderwać macicę od przyczepu otrzewnej.
7. Przenieś macicę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej lodowaty HBSS (Zbilansowany Roztwór Soli Hanka). Delikatnie umyj ciążącą macicę lodowatym HBSS, aby usunąć nadmiar krwi.
8. Trzymaj macicę na szalce Petriego zawierającej lodowaty HBSS i trzymaj na lodzie. Przetnij ścianę macicy i wyjmij zarodki. Trzymaj zarodki na świeżej szalce Petriego z HBSS na lodzie.
9. Weź czystą, sterylną bibułkę i połóż ją na nowej szalce Petriego. Spryskaj bibułę 70% etanolem. Trzymaj zarodek na tej bibułce po bocznej stronie i odetnij go od dolnej części brzucha za pomocą sterylnego ostrza w kierunku pokazanym linią przerywaną na rysunku 1.
10. Umocuj zarodek na sterylnej podstawie z gąbki, przypinając kręgosłup
.
11. Umieść go pod mikroskopem stereoskopowym i ostrożnie przetnij wzdłuż brzusznej linii środkowej. Usuń wątrobę i jelita. Układ moczowo-płciowy myszy (nerka, moczowód, jądro, WD i nasieniowód) powinien być teraz widoczny.
12. Wytnij jądro i WD i trzymaj na świeżej szalce Petriego z HBSS, na lodzie. Aby usunąć WD i jądro, przeciąć nasieniowody w pobliżu jego przyczepu do cewki moczowej i odciąć przyczep dolnej części WD od gubernaculum.
13. Połączyć jądra i WD z zarodków z tej samej grupy (może się to różnić w zależności od planu eksperymentalnego).

3. Hodowla embrionalnych grzbietów gonad (Rysunek 2)

1. Przygotuj podłoże do hodowli embrionalnych grzbietów gonad, uzupełniając DMEM/F12 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
2. Dodać 300 μl pożywki na dołek 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
3. Weź świeżą szalkę Petriego i umieść na niej małą kroplę sterylnego HBSS. Umieść poliwęglanową membranę do wytrawiania ścieżek (0,8 μm) na tej kropli HBSS tak, aby jej błyszcząca powierzchnia była skierowana w stronę HBSS.
4. Za pomocą czystych kleszczyków umieść dwa WD i gonady na membranie (na jej szorstkiej powierzchni, skierowanej do góry) i usuń maksymalną ilość HBSS za pomocą sterylnych chusteczek/papieru chłonnego. Nie dotykaj chusteczki papierem chłonnym; W przeciwnym razie uszkodzi tkankę.
5. Upewnij się, że ani WD, ani gonady nie stykają się ze sobą. W przeciwnym razie będą się sklejać podczas kolejnej inkubacji.
6. Przenieść błonę z tkankami do dołka 24-dołkowej płytki zawierającej 300 μl pożywki hodowlanej i hodować je na granicy faz powietrze-pożywka. Zbyt duża ilość pożywki hodowlanej na błonach powoduje torbielowaty wzrost WD.
7. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, w obecności 5% CO₂ .
8. Codziennie zmieniaj pożywkę hodowlaną. Aby zmienić pożywkę za pomocą pipety, najpierw wyjmij pożywkę z dołka, a następnie dodaj 300 μl podgrzanej świeżej pożywki.
   Uwaga: W celu zbadania wpływu różnych szlaków sygnałowych na morfogenezę WD, do pożywki hodowlanej można dodać aktywatory chemiczne i/lub inhibitory w wymaganych stężeniach.
9. Hoduj tkanki przez 3 dni. W ciągu 3 dni rozwinięte WD pobrane z zarodka o nasileniu 15,5 dpc przekształcają się w wysoce pofałdowane rurki (ryc. 3B). Dodanie inhibitora Wnt, IWR1, powoduje zahamowanie zwijania WD (ryc. 3C).
10. Do pobrania tych tkanek należy wziąć szalkę Petriego z lodowatym PBS. Przenieś membranę z hodowaną gonadą i WD na płytkę Petriego. Membrana będzie unosić się na PBS. Naciśnij membranę, aby zanurzyć ją w PBS i wyjmij gonadę i WD.
11. Utrwalić tkanki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) O/N w temperaturze 4 °C lub przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby zrób zdjęcia WD w jasnym polu przed fiksacją.

4. Immunofluorescencja całego wierzchowca

1. Utrwalone chusteczki przemyć 3x za pomocą PBS-T (PBS + 1% Triton X-100) z powolnym kołysaniem, po 10 min każda, w temperaturze pokojowej.
2. Odwodnić tkanki w stopniowanej serii etanolu (25%, 50%, 75% i 100%), po 10 minut każda, w temperaturze 4 °C, z powolnym kołysaniem (~30 obr./min). Na tym etapie tkanki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w 75% etanolu.
   1. Aby zmienić etanol, utrzymuj tkanki w spokoju przez 2 minuty i pozwól tkankom się uspokoić. Usuń jak najwięcej supernatantu, a następnie dodaj następne wyższe stężenie etanolu. Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, końcówka pipety nie powinna dotykać tkanek na żadnym etapie.
3. Po odwodnieniu należy ponownie nawodnić tkanki w stopniowanej serii etanolu (100%, 75%, 50% i 25%), po 10 minut każda, w temperaturze 4 °C, powoli kołysząc.
4. Chusteczki umyć PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, po 20 min każda, w temperaturze RT, z delikatnym kołysaniem (~30 obr./min).
5. Blokować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z buforem blokującym (PBS + 1% BSA + 0,2% odtłuszczone mleko w proszku w proszku + 0,3% Triton X-100).
6. Po zablokowaniu przenieść tkanki do pierwszorzędowego roztworu przeciwciała (rozcieńczonego w buforze blokującym) i inkubować O/N w temperaturze 4 °C z delikatnym kołysaniem (~30 obr./min). Rozcieńczenia zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych są opisane w Tabeli Materiałów.
7. Następnego dnia umyj chusteczki higieniczne PBS-MT (PBS + 2% odtłuszczone mleko w proszku + 0,5% Tween-20), 4x, po 30 min, w temperaturze RT, z delikatnym kołysaniem (~30 obr./min).
8. Po tym etapie przemywania dodać przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:250 (ten etap wymaga optymalizacji dla poszczególnych przeciwciał) w buforze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc.
9. Od teraz utrzymuj tkanki przykryte folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są znakowane światłoczułymi fluoroforami.
10. Chusteczki myj 3x za pomocą PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20) po 30 minut, delikatnie kołysząc.
11. Przygotuj szkiełka do montażu poplamionych tkanek.
    1. W tym celu pokrój szklane szkiełka na cienkie paski za pomocą pisaka diamentowego i przyklej dwa paski jeden na drugim na szkiełku za pomocą emalii do paznokci. Zrób dwie granice i umieść tkanki między tymi dwiema granicami.
    2. Dodać DAPI zawierające podłoże montażowe i założyć szkiełko nakrywkowe. Nałóż emalię do paznokci w rogach szkiełka nakrywkowego, aby przymocować go do szkiełka.
       Uwaga: Tkanki są teraz gotowe do obrazowania. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Podczas rozwoju, WD przechodzi znaczące zmiany, w których prosta i prosta rura jest przekształcana w bardzo skomplikowany i zwinięty kanał. Stosując metody opisane powyżej, WD przechodzą podobną transformację w warunkach hodowli. Tutaj pokazaliśmy wyniki z WD hodowanych dla 3 d (Rysunek 3). Aby przeanalizować mechanizmy molekularne zaangażowane w morfogenezę WD, pożywkę hodowlaną można uzupełnić inhibitorami i aktywatorami ukierunkowanymi na różne szlaki sygnałowe. Rycina 3C przedstawia rozwinięte WD po 3 dniach hodowli w obecności specyficznego inhibitora sygnalizacji Wnt, IWR1 10. Strzałki oznaczają zwinięte (rysunek 3B) i rozwinięte WD (rysunki 3A i C), co wskazuje, że tłumienie sygnalizacji Wnt powoduje zahamowanie zwijania WD (rysunek 3C). W ten sposób ten system hodowli może być wykorzystany do analizy mechanizmów molekularnych zaangażowanych podczas rozwoju WD (lub innych narządów).

Aby oznaczyć różne typy komórek, przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne całej góry na WD (ryc. 4). W tym miejscu przedstawiamy dane potwierdzające zastosowanie tego protokołu do znakowania białek cytoszkieletu, cytoplazmatyki i jądra. Figura 4A przedstawia barwienie immunologiczne cytokeratyny 8 (CK8, marker komórek nabłonkowych) WD (oznaczone strzałką) hodowane przez trzy dni. Zastosowaliśmy również ten sam protokół do oceny proliferacji komórek poprzez barwienie immunologiczne dla PH3 (fosfo-histon 3, marker proliferacji komórek). Rycina 4B przedstawia reprezentatywny obraz barwienia immunologicznego całej góry PH3. Zielone kropki oznaczone strzałką reprezentują PH3 dodatnie, a więc proliferujące komórki. Rycina 4C przedstawia barwienie immunologiczne aktywnej β-kateniny na świeżo wyizolowanych WD z zarodków myszy o gęstości 18,5 dpc. Kontrola ujemna (kontrola IgG) na rysunku 4D nie wykazuje barwienia. Wyniki te podkreślają solidność całego protokołu barwienia immunologicznego mount, który może być również stosowany do wielu różnych przeciwciał.
 

Rysunek 1. Ilustracja miejsca nacięcia w celu wyizolowania gonad embrionalnej z zarodka 15,5 dpc. Biała przerywana linia oznacza miejsce wykonania nacięcia w zarodku o grubości 15,5 dpc w celu wyizolowania grzbietów układu moczowo-płciowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schemat przepływu opisujący etapową procedurę hodowli narządów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Prawidłowa morfogeneza WD w warunkach hodowli. (A) Jądro i WD wyizolowane z zarodka o gęstości 15,5 dpc. (B) Zwinięty WD po hodowli 3 d w obecności DMSO (kontrola). (C) Nie zaobserwowano zwijania WD podczas leczenia IWR1 (inhibitor Wnt). Strzałka oznacza WD; t, oznacza jądra. Słupki równe 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Znakowanie immunologiczne WD w całej górze. (A - B) Barwienie immunologiczne całej góry WD wyizolowane z zarodków 15,5 dpc i hodowane przez 3 dni dla CK8 (A) i PH3 (B). (C) Aktywna immunofluorescencja całej góry βkateniny na WD wyizolowana z zarodka 18,5 dpc. (D) Kontrola ujemna (kontrola IgG) dla aktywnej βkateniny na 18,5 dpc WD nie wykazująca barwienia. Strzałka oznacza zwinięty WD; t, oznacza jądra. Słupki równe 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.