Artykuł metodologiczny

Legionella pneumophila (Legionella pneumophila) Pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach

DOI:

10.3791/55146

⸱

22 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Lung Research, Universities of Giessen and Marburg Lung Center, Philipps-University Marburg, 2German Center for Lung Research, 3Department of Medicine, Pulmonary and Critical Care Medicine, University Medical Center Giessen and Marburg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy oczyszczanie pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila (L. pneumophila) z płynnych kultur. Te oczyszczone pęcherzyki są następnie wykorzystywane do leczenia makrofagów w celu analizy ich potencjału prozapalnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie są w stanie wydzielać różne cząsteczki za pośrednictwem różnych systemów wydzielniczych. Oprócz wydzielania cząsteczek do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub bezpośrednio do innej komórki, bakterie Gram-ujemne mogą również tworzyć pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV). Te pęcherzyki błonowe mogą dostarczać swój ładunek na duże odległości, a ładunek jest chroniony przed degradacją przez proteazy i nukleazy.

Legionella pneumophila (L. pneumophila) to wewnątrzkomórkowy, Gram-ujemny patogen, który powoduje ciężką postać zapalenia płuc. U ludzi infekuje makrofagi pęcherzykowe pęcherzyków płucnych, gdzie blokuje degradację lizosomalną i tworzy wyspecjalizowaną wakuolę replikacyjną. Ponadto L. pneumophila wytwarza OMV w różnych warunkach wzrostu. Aby zrozumieć rolę OMV w procesie infekcji ludzkich makrofagów, opracowaliśmy protokół oczyszczania pęcherzyków błony bakteryjnej z płynnej hodowli. Metoda opiera się na różnicowym ultrawirowaniu. Wzbogacone OMV zostały następnie przeanalizowane pod kątem zawartości białka i lipopolisacharydów (LPS), a następnie wykorzystano je do leczenia ludzkiej linii komórek monocytowych lub makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Odpowiedzi prozapalne tych komórek analizowano za pomocą testu immunoenzymatycznego. Ponadto przeanalizowano zmiany w późniejszej infekcji. W tym celu badano bakteryjną replikację L. pneumophila w makrofagach za pomocą testów jednostek tworzących kolonie.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół oczyszczania OMV L. pneumophila z płynnej hodowli za pomocą ultrawirowania oraz dalszej analizy ich potencjału prozapalnego na makrofagach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie mogą wydzielać czynniki wirulencji za pomocą różnych mechanizmów1. Oprócz dobrze znanych systemów wydzielniczych, bakterie Gram-ujemne mogą wymieniać informacje i dostarczać czynniki wirulencji za pośrednictwem pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV), które są małymi, sferoidalnymi pęcherzykami o średnicy 10-300 nm i dwuwarstwowej strukturze błony. Są wydzielane w różnych środowiskach wzrostu (kultura płynna, kultura stała i biofilmy) i we wszystkich fazach wzrostu2,3. OMV są ważnym środkiem transportu (np. dla białek, adhezyn, toksyn i enzymów, a także dla LPS, który znajduje się na powierzchni OMV)4. Ładunek wewnątrzświetlny jest chroniony przed degradacją proteolityczną, dzięki czemu jest w stanie działać na duże odległości, a pęcherzyki można znaleźć w płynach ustrojowych i odległych narządach5,6,7,8. Mogą być nie tylko rozpoznawane i wychwytywane przez komórki eukariotyczne9,10, ale ponadto są w stanie ułatwić wiązanie bakterii i ich inwazję do komórek gospodarza4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) jest bakterią Gram-ujemną, która może uwalniać OMV. W ludzkim płucu infekuje przede wszystkim makrofagi pęcherzykowe pęcherzyków płucnych, mimo że jego naturalnym gospodarzem są ameby słodkowodne11. Zakażenie L. pneumophila może powodować chorobę legionistów, ciężką postać zapalenia płuc12. Blokuje fuzję fagosomu i lizosomu w komórce gospodarza. Rekrutuje również organelle gospodarza, w wyniku czego tworzona jest nisza replikacyjna, wakuola zawierająca Legionellę (LCV)13,14. Degradacja lizosomów jest hamowana nie tylko przez translokację białek efektorowych przez system wydzielania typu IV, ale także przez uwalnianie OMVs15.

Oczyszczanie OMV z kultur bakteryjnych jest wymagane do analizy ich wpływu na komórki biorców. Wcześniejsze badania koncentrowały się na zawartości białka w OMV L. pneumophila oraz na wpływie pęcherzyków na komórki nabłonka pęcherzyków płucnych16, ale późniejsze badania z wykorzystaniem przeszczepów ludzkiej tkanki płucnej wykazały, że OMV L. pneumophila są wychwytywane przez makrofagi pęcherzykowe 17.

Ponieważ OMV prezentują wzorce molekularne związane z patogenami (PAMPs) i inne antygeny bakteryjne, mogą mieć wpływ na infekcję komórek eukariotycznych i modulować odpowiedź immunologiczną gospodarza18. L. pneumophila OMV szybko łączą się z błonami komórkowymi gospodarza, a ponadto aktywują błoniaste TLR219. Ponieważ wiadomo, że OMV L. pneumophila stymulują makrofagi i komórki nabłonkowe w sposób prozapalny16,17, przeanalizowaliśmy wpływ OMV na proces infekcji u makrofagów ludzkich i mysich.

Tutaj opisujemy protokół hodowli L. pneumophila w płynnej hodowli, aby wyizolować wydzielane OMV przez różnicowe ultrawirowanie i ocenić wpływ pęcherzyków na eukariotyczne komórki gospodarza, bezpośrednio lub po infekcji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj płytki z podłożem i agarem

  1. Przygotować 1 l podłoża bulionowego (YEB). Rozpuścić 10 g ACES i 10 g ekstraktu drożdżowego w 900 ml wody destylowanej. Doprowadzić pH do 6,9 za pomocą KOH (5 N). Dodać 10 ml L-cysteiny (0,4 g w 10 ml wody destylowanej) i 10 ml Fe(NO3)3x9H2O (0,25 g w 10 ml wody destylowanej). Napełnij do 1 l wodą destylowaną i przefiltruj, wysterylizuj roztwór (wielkość porów: 0,22 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj płytki agarowe z buforowanym ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego (BCYE). Rozpuścić 10 g ACES i 10 g ekstraktu drożdżowego w 900 ml wody destylowanej. Doprowadzić pH do 6,9 za pomocą KOH (5 N). Dodaj 15 g agaru i 2,5 g węgla aktywnego. Napełnij do 1 l wodą destylowaną i autoklawem.
    1. Dodać 10 ml L-cysteiny (0,4 g w 10 ml wody destylowanej) i 10 ml Fe(NO3)3x9H2O (0,25 g w 10 ml wody destylowanej, oba wysterylizowane przez filtrację przez pory 0,22 μm) do schłodzonego BCYE (około 50 °C). Wlać talerze i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Uprawiaj L. pneumophila

  1. Rozprowadzić szczep L. pneumophila Corby (typ dziki, WT) na płytkach agarowych BCYE i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 3 dni. Zaszczepić 10 ml YEB przy OD600 0,3 L. pneumophila z płytki prehodowlanej; inkubować bakterie w temperaturze 37 °C na obrotowej wytrząsarce (150 obr./min) przez 6 godzin.
  2. Sprawdzić czystość płynnej kultury, rozprowadzając 100 μl zawiesiny na płytce z agarem z krwią. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Dodać pozostałą płynną kulturę do 90 ml świeżej pożywki YEB i inkubować na obrotowej wytrząsarce (37 °C i 150 obr./min), aby osiągnąć OD600 3,0-3,5, co zajmuje około 16-20 godzin.

3. Przygotowanie i ilościowe określenie OMV L. pneumophila

UWAGA: Wszystkie poniższe etapy wirowania należy przeprowadzić w sterylnych warunkach i w temperaturze 4 °C.

  1. Odwirować płynną kulturę o sile 4 000 x g przez 20 minut, aby bakterie były granulowane. Przenieść supernatant do świeżych probówek wirówkowych, wyrzucić osad bakteryjny i powtórzyć wirowanie (4 000 x g przez 20 minut). Powtórz ten krok raz.
  2. Pozostały supernatant należy przefiltrować sterylnie dwukrotnie (wielkość porów: 0,22 μm). Przenieś wolny od bakterii supernatant do probówek ultrawirówek i ultrawiruj przy 100 000 x g przez 3 godziny.
  3. Zdekantować supernatant i wyrzucić go. Zawiesić osad OMV w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i ultrawirówce (100 000 x g przez 3 godziny) w celu usunięcia zanieczyszczających białek i LPS.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad OMV w 500 μl sterylnego PBS. Smugi 20 μl na płytce z agarem z krwią i na płytce agarowej BCYE, aby wykluczyć zanieczyszczenie bakteryjne przygotowanych pęcherzyków. Inkubować płytkę z agarem z krwią przez noc i płytkę z agarem BCYE przez 3 dni (obie w temperaturze 37 °C).
  5. Określić ilościowo ilość białka otrzymaną z preparatu OMV za pomocą testu kwasu bicinchoninowego zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Stężenie 100 ml kultury L. pneumophila wynosi zwykle 1 μg/μL. Przygotowane i oznaczone ilościowo OMV należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Wstępne traktowanie makrofagów

  1. Przygotuj komórki THP-1.
    UWAGA: THP-1 to monocytowa linia komórkowa pochodząca od pacjenta z białaczką.
    1. Dodaj 2x105 komórek THP-1 na 24 dołki i różnicuj je, dodając 20 nM 12-mirystynianu 13-octanu (PMA) do komórek podobnych do makrofagów. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Zastąp pożywkę 500 μl świeżej pożywki i inkubuj przez kolejne 24 godziny; optymalnym podłożem dla komórek THP-1 jest RPMI 1640 o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą.
  2. Wyizolować mysie makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (mBMDM), zgodnie z opisem w piśmiennictwie 20.
  3. Leczyć makrofagi pochodzące z THP-1 lub mBMDM za pomocą OMV.
    1. Rozmrozić OMV przygotowane w kroku 3 i dodać je zgodnie z ilością białka (0,1, 1 i 10 μg/ml) do ludzkich lub mysich makrofagów. Inkubować makrofagi z OMV w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 godzin. Użyj supernatantu do testu ELISA lub przejdź do kroku 5.

5. Infekuj makrofagi i oceniaj replikację bakterii za pomocą testu jednostki tworzącej kolonie (CFU)

  1. Użyj L. pneumophila z kroku 2.1, wstępnie potraktowanych komórek THP-1 lub mBMDM z kroku 4.3, a nie wstępnie potraktowanych makrofagów jako kontrolnych (2x105/24 dołki). Nie wymieniaj nośnika.
  2. Zakażone komórki THP-1 L. pneumophila Corby WT i mBMDM pozbawionym wiciowców mutantem L. pneumophila Corby (oba z wielokrotnością infekcji (MOI) 0,5; 1x105 L. pneumophila/24 dołki) i inkubować odpowiednio przez 24 i 48 godzin. Przygotować zarówno L. pneumophila Corby (WT lub mutant pozbawiony wiciowców) zgodnie z opisem w kroku 2.1.
  3. Poddać komórki lizie w pożywce przez dodanie saponiny (końcowe stężenie: 0,1%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  4. Zawiesić bakterie przez pipetowanie i przenieść zawiesinę do naczynia reakcyjnego. Przygotować seryjne rozcieńczenia pożywki zawierającej L. pneumophila w sterylnym PBS.
  5. Na płytkach agarowych BCYE rozprowadzić 50 μl wymaganych rozcieńczeń i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C.
  6. Wizualnie policz utworzone kolonie. Oblicz wynik zliczania CFU figure-protocol-1 Znormalizuj wynik zliczania CFU do makrofagów, które nie są wstępnie leczone, ale zakażone, które są ustawione na 100%.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalny układ do przygotowania OMV L. pneumophila i analizy ich wpływu na prozapalną odpowiedź makrofagów po zakażeniu jest przedstawiony na rysunku 1. Potencjał prozapalny przygotowanych OMV można analizować na komórkach THP-1 zróżnicowanych pod kątem PMA, co pokazano na rycinie 2. Komórki THP-1 reagują zależnym od czasu i dawki wzrostem wydzielania IL-8 i IL-6. Dodatkowo, wpływ różnych TLR na rozpoznawanie L. pneumophila OMV można analizować przy użyciu mBMDM z różnych środowisk genetycznych, jak pokazano w CXCL1 ELISA na rycinie 3. mBMDM od myszy WT wydzielał CXCL1 po stymulacji OMV, podczas gdy mBMDM TLR2/4-/- wydzielał znacznie mniej. Aby zbadać wpływ OMV L. pneumophila na replikację bakterii w makrofagach THP-1, komórki wstępnie inkubowano z OMV, a następnie dodatkowo zakażono L. pneumophila (Figura 4 A). Wstępna stymulacja makrofagów pochodzących z THP-1 najpierw zmniejsza replikację bakterii po 24 godzinach od infekcji, ale prowadzi do podwojenia liczby CFU w późniejszym czasie (48 godzin p.i.). Wpływ sygnalizacji receptora Toll-podobnego (TLR) na rozpoznawanie OMV po zakażeniu makrofagów można ocenić za pomocą mBMDM, jak pokazano na rysunku 4 B. Replikacja bakteryjna wzrasta dziesięciokrotnie w mBMDM od zwierząt WT po wstępnej inkubacji OMV, podczas gdy komórki TLR2-/- i TRIF/MyD88-/--nie wykazują tego wzrostu replikacji L. pneumophila.

figure-results-1
Rysunek 1: Procedura eksperymentalna. (A) L. pneumophila Corby WT z 10-centymetrowych płytek agarowych BCYE służy do inokulacji małej płynnej kultury (10 ml), którą po 6 godzinach przenosi się do 90 ml świeżej pożywki YEB. Niewielką objętość umieszcza się również na płytce z agarem z krwią w celu sprawdzenia czystości. Bakterie inkubuje się w temperaturze 37 °C aż do wczesnej fazy stacjonarnej (OD600 = 3,0-3,5). (B) Płynna kultura jest odwirowywana i sterylnie filtrowana w celu usunięcia bakterii. Supernatant wolny od bakterii Legionella jest następnie ultrawirowany w celu uzyskania granulki OMV, która jest ponownie zawieszana w PBS i ponownie ultrawirowana. Wyizolowane pęcherzyki są ponownie zawieszane, sprawdzane pod kątem czystości i oznaczane ilościowo pod kątem ilości białka. Pasek skali reprezentuje 2,5 cm. (C) Ludzkie lub mysie makrofagi są stymulowane za pomocą ilościowo oznaczonych OMV. Supernatant hodowli komórkowej może być użyty do testu ELISA lub makrofagi mogą być zakażone L. pneumophila w celu określenia replikacji bakterii za pomocą testu CFU na 10-centymetrowych płytkach agarowych BCYE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Prozapalna aktywacja komórek THP-1 przez OMV L. pneumophila. (A) W tym przypadku monocytowa linia komórkowa THP-1 jest używana jako model dla makrofagów pęcherzykowych. Komórki THP-1 zróżnicowane pod względem PMA traktowano zwiększającymi się dawkami OMV L. pneumophila (0,01-25 μg/ml) odpowiednio przez 24 i 48 godzin. Bezkomórkowy supernatant został użyty do testu IL-8 ELISA. Przedstawiono średnie wartości z trzech niezależnych eksperymentów ± SEM. Komórki THP-1 reagowały na zaledwie 0,01 μg/ml L. pneumophila OMV ze znacznym wydzielaniem IL-8, które było zależne od czasu i dawki. (B) L. pneumophila OMV (0,1-10 μg/ml) zastosowano do stymulacji komórek THP-1 zróżnicowanych PMA. Supernatant pobrano po 24 i 48 godzinach inkubacji, a uwolnioną IL-6 zmierzono w supernatancie za pomocą testu ELISA. Przedstawiono średnie wartości z trzech niezależnych eksperymentów ± SEM. Komórki THP-1 wydzielały znaczne ilości IL-6, nawet przy najniższej dawce OMV (0,1 μg/ml). Wydzielanie IL-6 zwiększało się wraz ze wzrostem dawek OMV i wydłużeniem czasu inkubacji. Statystyki: test Manna-Whitneya; *p < 0,05 i **p < 0,01 w porównaniu do odpowiadających 0 μg/ml OMV. Przedruk za zgodą Reference 20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Prozapalna aktywacja makrofagów zależy od TLR2/4. mBMDM z myszy WT i TLR2/4-/- inkubowano z OMV L. pneumophila (0,1 lub 1 μg/ml). Wydzielanie CXCL1 analizowano metodą ELISA odpowiednio po 24 i 48 godzinach. Przedstawiono średnie wartości ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów. mBMDM od myszy WT odpowiedział zależnym od dawki wydzielaniem CXCL1 po inkubacji L. pneumophila OMV. TLR2/4-/- mBMDM wydzielał istotnie mniej CXCL1 w porównaniu z WT mBMDM, a wydzielanie to nie zwiększało się w zależności od dawki. Statystyki: test Manna-Whitneya; *p < 0,05 w porównaniu do odpowiadającego mu 0 μg/ml OMV; #p < 0,05 w porównaniu z jednakowo traktowaną próbką WT. Przedruk za zgodą Reference 20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Wstępna inkubacja L. pneumophila OMV zwiększa replikację bakterii w makrofagach. (A) Zróżnicowane komórki THP-1 były wstępnie inkubowane z OMV (0,1, 1 lub 10 μg / ml) lub LPS / IFN-γ (200 ng / ml każdy) lub pozostawiono bez traktowania w celu kontroli. Po wstępnej inkubacji (20 godzin) komórki THP-1 były zakażone L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) odpowiednio przez 2, 24 i 48 godzin. Komórki THP-1 poddano lizie przez dodanie saponiny, a bakterie posiewano na płytkach agarowych BCYE. CFU obliczono w odniesieniu do 0 μg/ml OMV po każdym punkcie czasowym. Słupki reprezentują średnie wartości SEM ± trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy został przeprowadzony w duplikatach technicznych. Nie stwierdzono różnic w wychwytywaniu przez bakterie (2 godziny po zakażeniu (p.i.)) w porównaniu z komórkami, które nie były wcześniej leczone. Zmiany w replikacji bakterii określono odpowiednio po 24 i 48 godzinach. Wstępnie potraktowane komórki THP-1 LPS/IFN-γ wykazały zmniejszenie obciążenia bakteryjnego w ciągu 24 godzin p.i. Zaobserwowano to również w zależności od dawki w przypadku komórek wstępnie poddanych działaniu L. pneumophila OMV. W późniejszym okresie (48 godzin p.i.) wstępnie potraktowane komórki THP-1 poddane działaniu OMV wykazały podwojenie replikacji L. pneumophila, podczas gdy makrofagi poddane działaniu LPS / IFN-γ wykazały dalsze zmniejszenie obciążenia bakteryjnego. Statystyki: test Manna-Whitneya; *p < 0,05 i **p < 0,01 w porównaniu do odpowiadających 0 μg/ml OMV. (B) mBMDM od myszy o różnym pochodzeniu genetycznym (WT, TLR2-/- i TRIF/MyD88-/-) inkubowano wstępnie z 0,1 μg/mL L. pneumophila OMV przez 20 godzin, a następnie zakażono mutantem L. pneumophila Corby (MOI 0,5) z niedoborem wiciowców przez 48 godzin. mBMDM poddano lizie przez dodanie saponiny i Legionelli zostały posiane na płytkach agarowych BCYE. CFU obliczono w odniesieniu do 0 μg/ml OMV, oznaczonego linią ciągłą. Słupki reprezentują średnie wartości SEM ±± trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy został przeprowadzony w dwóch egzemplarzach. mBMDM od myszy WT wykazał wzrost replikacji L. pneumophila po wstępnym leczeniu OMV. Makrofagi TLR2-/- wykazywały znacznie zmniejszoną replikację Legionelli, która była porównywalna z TRIF/MyD88-/- mBMDM. Statystyki: test Manna-Whitneya; p < 0,05 w porównaniu z próbką WT. Przedruk za zgodą Reference 20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OMV patogenów bakteryjnych i wpływ tych pęcherzyków błonowych na ich komórki docelowe są obecnie intensywnie badane. Na przykład OMV pochodzące z Clostridium perfringens indukują wydzielanie cytokin w makrofagach, limfocyty B mogą być aktywowane przez OMV z Borrelia burgdorferi, a pęcherzyki błonowe uwalniane przez Helicobacter pylori mogą działać na komórki nabłonka żołądka 21,22,23. L. pneumophila, patogen wewnątrzkomórkowy, który może wywołać ciężką postać atypowego zapalenia płuc, uwalnia również OMV, które są w stanie aktywować komórki nabłonka płuc i makrofagi16,19. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji OMV L. pneumophila na małą skalę z płynnej hodowli w celu zbadania potencjalnej roli OMV w zapaleniu płuc. Bardzo ważne jest, aby pracować w sterylnych warunkach i wykluczyć zanieczyszczenie innymi bakteriami, aby uzyskać czysty preparat OMV pochodzący z L. pneumophila. Izolacja OMV obejmuje etap filtracji przez pory 0,22 μm w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu otrzymanej osadki OMV L. pneumophila, nawet jeśli zmniejsza to wydajność OMV, ponieważ największe OMV są tracone na tym etapie filtracji.

Ponadto przetestowaliśmy reakcję makrofagów ludzkich i mysich na te izolowane pęcherzyki i komórki zakażone L. pneumophila , aby bardziej zbliżyć się do sytuacji w zapaleniu płuc Legionella , gdzie OMV są uwalniane do wnętrza LCV przez bakterie zewnątrzkomórkowe15. Zastosowane dawki OMV oszacowano na podstawie ilości wolnego OMV w zakażeniu in vitro ludzkimi makrofagami po 24 godzinach inkubacji (opisanej w piśmiennictwie 20). Do stymulacji innych komórek biorcy lub eksperymentów in vivo mogą być konieczne i muszą być ustalone inne dawki OMV. Analiza wpływu OMV L. pneumophila stanowi postęp w stosunku do protokołu opisanego przez Jagera i Steinerta24.

W tym przypadku zróżnicowane PMA komórki THP-1 służą jako model dla makrofagów pęcherzykowych ze względu na ograniczoną dostępność pierwotnego materiału ludzkiego. Dodatek PMA różnicuje monocytowe komórki THP-1 w komórki podobne do makrofagów25. Co więcej, są one dobrze znaną modelową linią komórkową do badań nad L. pneumophila 26. Oprócz tej ludzkiej linii komórek monocytowych stosuje się komórki mBMDM. mBMDM są powszechnie akceptowane w badaniach nad skutkami L. pneumophila 27,28,29. Możliwość wykorzystania nokautów genetycznych dla różnych TLR lub innych białek sprawia, że są one cennym narzędziem do badania efektów OMV. W celu zmniejszenia liczby myszy w eksperymencie, mBMDM są używane zamiast makrofagów pęcherzykowych ze względu na ograniczenia makrofagów. Kluczowe eksperymenty mogą wymagać makrofagów pęcherzykowych do walidacji.

Oprócz opisanego w niniejszym dokumencie protokołu ultrawirowania w celu oczyszczenia OMV, możliwe jest przeprowadzenie wirowania w gradiencie gęstości, które jest zawarte w protokole przez Chutkan i wsp.30. Może to poprawić czystość otrzymanego preparatu OMV i zmniejszyć ilość współoczyszczonych agregatów białkowych, flageliny i LPS. Czystość otrzymanego preparatu OMV może być analizowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub analizy śledzenia nanocząstek jako dodatkowy etap kontroli jakości. Może to zapewnić dodatkowy sposób oceny ilościowej, wykraczający poza przedstawioną tutaj procedurę pomiaru białka. Opcjonalnie stężenie LPS można analizować za pomocą testu lizatu amebocytów limulusa. Jeśli uzysk OMV jest niski, można przeprowadzić dodatkowy etap zatężania za pomocą filtrów odśrodkowych, czego w tym przypadku nie zrobiono. Jeśli wydajność była niższa niż oczekiwano, OMV były odrzucane.

W ramach trwających wysiłków mających na celu wyjaśnienie mechanizmów i funkcji biologicznych stojących za OMV można przetestować wpływ różnych warunków stresowych na produkcję OMV. Niedobór składników odżywczych, zmiany temperatury inkubacji lub narażenie na czynniki szkodliwe mogą mieć wpływ na wydzielanie OMV31. Możliwe warunki naprężeń zostały omówione w protokole przez Klimentovą i Stulika32. Co więcej, można wygenerować hiper- lub hipopęcherzykowe mutanty L. pneumophila . Różne preparaty OMV mogą być następnie analizowane w eksperymentach z infekcją makrofagami, eksplantatami ludzkiej tkanki płucnej (opisanymi w Piśmiennictwie 17), a nawet w modelach in vivo . Oprócz roli OMV we wrodzonej sygnalizacji immunologicznej, ich wpływ na komunikację bakteryjną można zbadać eksperymentalnie. Co więcej, wpływ różnych wrodzonych kaskad sygnalizacji immunologicznej może być analizowany za pomocą mysich komórek nokautujących lub generowania nokautów CRISPR/Cas9 w ludzkich liniach komórkowych. Te podstawowe badania nad OMV pomogą w opracowaniu nowych strategii szczepień, które już istnieją w przypadku zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych typu B przenoszonego przez Neisseria meningitides33.

Wychodząc od protokołu izolacji i charakterystyki OMV, można go zastosować do innych bakterii Gram-ujemnych i innych komórek gospodarza; Wystarczy go dostosować do wzrostu bakterii w płynnej kulturze. Protokół opublikowany przez Chutkan i wsp. zawiera szczegółowe informacje na temat wytwarzania OMV z Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa30. Hodowla nie powinna osiągać późnej fazy stacjonarnej, aby uniknąć wzrostu liczby bakterii poddanych lizie oraz zanieczyszczania białek i błon. Dodatkowo, dawka OMV stosowana do stymulacji komórek gospodarza musi być określona w zależności od ilości OMV obecnych podczas infekcji in vivo , przy jednoczesnym zapewnieniu niskiego wskaźnika cytotoksyczności. W ten sposób można było zbadać patologiczną rolę OMV, ich wpływ na komunikację międzygatunkową oraz interakcje gospodarz-patogen.

Aby dalej badać rolę OMV L. pneumophila w zapaleniu płuc, potrzebne są standaryzowane preparaty OMV o wystarczającej wydajności i porównywalnych eksperymentach z infekcjami. Protokół ten pomoże ustandaryzować procedury izolacji i rozszerzyć badania OMV na inne bakterie Gram-ujemne i inne komórki gospodarza. Ponadto w badaniach wykorzystana zostanie szczegółowa wiedza z zakresu badań in vitro , która może zostać wykorzystana do rozszerzenia eksperymentów na warunki in vivo . W przyszłości protokół ten może zostać rozszerzony o izolację OMV z pierwotnego materiału biologicznego, takiego jak surowica lub płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, aby uzyskać wgląd w skład OMV uwalnianych w warunkach fizjologicznych. Pomoże to w określeniu kluczowych parametrów składu OMV i zrozumieniu właściwości OMV generowanych in vitro.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. Dr. Markusowi Schnare'owi za dostarczenie nam myszy TLR2-/- i TLR2/4-/- oraz Prof. Dr. Carsten Kirschning za myszy TRIF/MyD88-/-. Część tych prac została sfinansowana przez Bundesministerium für Bildung und Forschung (e:bio miRSys - FKZ 0316175B, e:Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) oraz Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03/00.001-(0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), wszystkie dla BS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 cm szalkaPetriego Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)82.1473
70 Ti rotorBeckman Coulter Incorporation (Kalifornia, USA)337922
ACESCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)9138.2
węgiel aktywnyCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)X865.2
agar-agar, Kobe ICarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)5210.2
Agar Columbia z 5% krwią owcząBecton Dickinson GmbH (Heidelberg, Niemcy)254005
kuwetySarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)67.742
ELISA (człowiek)BD OptEIA&handel;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Niemcy)IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (mysi)DuoSet, R& D (Minneapolis, USA)CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2OCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)5632.1
Surowica cielęca płodu (FCS)Life Technologies GmbH (Darmstadt, Niemcy)10270-106
Inkubator CO2 Heracell 240iThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)40830469
Heraeus Multifuge X3RThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)75004515
Pętla inokulacyjna Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)86.1567.010
KOHCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)6751.1
L. pneumophila Corby------uprzejmie dostarczone przez prof. dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Niemcy)
L. pneumophila Corby Δ flaA------uprzejmie dostarczone przez Prof. Dr Klausa Heunera (RKI, Berlin, Niemcy)
L-cysteinCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)
PBSBiochrom GmbH (Berlin, Niemcy)L 1825
12-mirystynian 13-octan forboluSigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Niemcy)P8139-1MG
Wytrząsarka obrotowa (MaxQ 6000)Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)SHKE6000
RPMI 1640 high glucoseLife Technologies GmbH (Darmstadt, Niemcy)11875-093
saponinCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)9622.1
Ultrospec 10Biochrom Ltd (Cambridge, Anglia)80-2116-30
sterylny filtr (wielkość porów: 0,22 i mikro; m)Corning Incorporated (Nowy Jork, USA)431096
THP-1Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Niemcy)88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SEThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)
ekstrakt drożdżowyCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)2363.2
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)23225
mBMDM------dzięki uprzejmości prof. dr Markusa Schnare'a (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Niemcy) i prof. dr Carstena Kirschninga (Uniwersytet Duisburg Essen, Essen, Niemcy)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).
  2. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).
  3. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  4. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).
  5. Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).
  6. Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).
  7. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  8. Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).
  9. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  10. Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).
  11. Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).
  13. Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).
  14. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).
  16. Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).
  17. Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).
  18. Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).
  19. Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. , (2014).
  20. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12 (4), (2016).
  21. Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).
  22. Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).
  23. Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).
  24. Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  26. Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).
  27. Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).
  28. Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).
  29. Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11 (3), 1004704(2015).
  30. Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).
  32. Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. Novartis.com. , Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ultrawirowanieinfekcja makrofag wodpowied prozapalnareplikacja bakteryjnajednostka tworz ca kolonireceptor Toll podobnytest ELISAwarunki sterylne

Powiązane artykuły