Artykuł metodologiczny

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55187

⸱

27 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Streszczenie

Współekspresja wielu białek jest coraz bardziej istotna dla biologii syntetycznej, badania kompleksów białko-białko oraz charakteryzowania i wykorzystywania szlaków biosyntezy. W pracy opisano zastosowanie wysoce efektywnego systemu do budowy wielogenowych operonów syntetycznych pod kontrolą indukowalnej polimerazy T7 RNA. System ten pozwala na jednoczesną ekspresję wielu genów z jednego plazmidu. Tutaj ujawniono zestaw czterech powiązanych wektorów, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K i pMGX-hisK, z markerem selektywnym oporności na ampicylinę lub kanamycynę (A i K) i posiadającymi lub nieposiadającymi N-końcowego znacznika heksahistydyny (his). Szczegółowe protokoły budowy syntetycznych operonów przy użyciu tego systemu wektorowego są dostarczane wraz z odpowiednimi danymi, pokazującymi, że system oparty na pMGX zawierający pięć genów może być łatwo skonstruowany i wykorzystany do produkcji wszystkich pięciu kodowanych białek w Escherichia coli. Ten system i protokół umożliwia naukowcom rutynową ekspresję złożonych, wieloskładnikowych modułów i szlaków w E. coli.

Wprowadzenie

Koekspresja wielu białek staje się coraz bardziej istotna, szczególnie w zastosowaniach biologii syntetycznej, gdzie konieczna jest ekspresja wielu modułów funkcjonalnych1; w badaniach nad kompleksami białko-białko, w których ekspresja i funkcja często wymagają koekspresji2,3; a także w charakteryzacji i wykorzystywaniu szlaków biosyntetycznych, gdzie każdy gen w szlaku musi zostać wyekspresowany4,5,6,7,8. Opracowano szereg systemów do koekspresji, szczególnie w organizmie gospodarza Escherichia coli, będącym podstawowym narzędziem w laboratoryjnej ekspresji białek rekombinowanych9. Na przykład do ekspresji poszczególnych białek można wykorzystać wiele plazmidów z różnymi markerami selekcyjnymi, korzystając z bogatego wyboru różnych wektorów ekspresyjnych10,11. Systemy jednoplazmidowe do ekspresji wielu białek wykorzystują albo wiele promotorów do kontroli ekspresji każdego genu10,12; operony syntetyczne, w których wiele genów jest zakodowanych w jednym transkrypcie2,13; lub w niektórych przypadkach pojedynczy gen kodujący polipeptyd, który jest następnie przetwarzany proteolitycznie, dając pożądane białka docelowe14.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat pMGX przedstawiający konstrukcję wektora policistronowego.System pMGX zapewnia elastyczną i łatwą w użyciu strategię budowy syntetycznych operonów pod kontrolą indukowalnego promotora T7. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

W niniejszym manuskrypcie opisano zastosowanie wysoce efektywnego systemu do konstruowania syntetycznych operonów wielogenowych pod kontrolą indukowalnej polimerazy RNA T7 (Rycina 1). System ten umożliwia jednoczesną ekspresję wielu genów z jednego plazmidu. Opiera się on na systemie plazmidowym, pierwotnie nazwanym pKH22, który z powodzeniem stosowano w wielu różnych zastosowaniach6,7,8. W tej pracy zestaw plazmidów został rozszerzony o cztery powiązane wektory: pMGX-A, wektor ekspresyjny pozbawiony znaczników C- lub N-końcowych z markerem oporności na ampicylinę; pMGX-hisA, wektor ekspresyjny kodujący N-końcowy znacznik heksahistydynowy z markerem oporności na ampicylinę; pMGX-K, wektor ekspresyjny pozbawiony znaczników C- lub N-końcowych z markerem oporności na kanamycynę; oraz pMGX-hisK, wektor ekspresyjny kodujący N-końcowy znacznik heksahistydynowy z markerem oporności na kanamycynę. W badaniu tym zaprezentowano metodę generowania wektora policistronowego zawierającego pięć genów z wykorzystaniem systemu pMGX, a konkretnie pMGX-A, wraz z pomyślną produkcją każdego z poszczególnych białek w Escherichia coli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pozyskiwanie interesujących genów

  1. Projektowanie syntetycznych genów.
    1. Zoptymalizuj sekwencję genów pod kątem ekspresji E. coli.
    2. Usuń wszystkie problematyczne miejsca ograniczeń z sekwencji (AvrII, NdeI, EcoRI i XbaI).
    3. Włączenie miejsc ograniczeń do klonowania; zalecane jest stanowisko 5′-NdeI i stanowisko 3′-EcoRI. W razie potrzeby można skorzystać z innych witryn; odnoszą się do regionu multiklonowania wybranego plazmidu (Rysunek S1-S4). W razie potrzeby dołącz znacznik kodowania 5′ lub 3′ do wykrywania Western blot.
    4. Zamów komercyjnie zaprojektowany gen.
    5. Albo tępo sklonować gen do wektora za pomocą zestawu do klonowania, zgodnie z instrukcjami producenta; zaprojektować startery do amplifikacji genu (następnie przejść do kroku 1.2.2); lub dodać dodatkowe końce 5′ i 3′ do bezpośredniego klonowania do plazmidu pMGX i przejść do kroku 2. W tym przypadku reprezentatywne wyniki pochodzą z klonowania genów, które są przedmiotem zainteresowania.
  2. Amplifikuj pożądany gen (z zaprojektowanego i zoptymalizowanego genu syntetycznego lub z matrycowego DNA zawierającego pożądany gen)15.
    1. Zaprojektuj podkłady z miejscami ograniczeń do klonowania; zalecane jest stanowisko 5′-NdeI i miejsce 3′-EcoRI. W razie potrzeby można skorzystać z innych witryn; odnoszą się do regionu multiklonowania wybranego plazmidu (Rysunek S1-S4). W razie potrzeby dołącz znacznik kodujący 5′ lub 3′ do wykrywania Western blot.
    2. PCR amplifikuje pożądany gen 15.
    3. Przeanalizuj PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym16.
    4. Jeśli amplifikacja jest niespecyficzna, oczyść amplifikowany gen przez ekstrakcję żelu. Jeśli nie, użyj zestawu do czyszczenia enzymów.
    5. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru, sprawdzając absorbancję przy długości fali 260 nm; ślepa próba z buforem elucyjnym17.

2. Klonowanie interesujących genów do wektora wielogenowego systemu ekspresji, pMGX18

  1. Restrykcyjne trawienie uzyskanego genu będącego przedmiotem zainteresowania i pożądanego wektora, pMGX, z NdeI i EcoRI.
    UWAGA: Jeśli otrzyma się dużą ilość plazmidów recyrkularyzowanych, przed dodaniem EcoRI pozwól reakcji NdeI postępować przez 1 godzinę.
    1. Stosować 40 μl reakcji trawienia zawierającej 0,5-1,5 μ5 μg DNA i 1 μl każdego enzymu z 4 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu.
    2. Do trawienia NdeI i EcoRI użyj buforu EcoRI i najpierw dodaj endonukleazę NdeI. Trawić przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj endonukleazę EcoRI i pozwól trawieniu postępować przez dodatkową godzinę. NdeI jest wrażliwe na rozszczepienia w pobliżu końca DNA, więc wstępne trawienie przez EcoRI może uniemożliwić skuteczne trawienie przez NdeI.
  2. Elektroforeza trawienia restrykcyjnego w żelu agarozowym (dla genu 1 kb należy użyć 0,7% żelu agarozowego pod napięciem 110 V przez 55 minut; aby wybrać procent żelu agarozowego dla różnych rozmiarów genów, patrz odniesienie16.
  3. Za pomocą czystego skalpela lub żyletki należy wprowadzić wkładkę akcyzową i wektor, a wycięty segment żelu umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml.
  4. Ekstrakcję DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
  5. Zliguj interesujący nas gen do wektora pMGX przy użyciu stosunku insercji do wektora 3:1; ustaw ujemną ligację strawionego pMGX bez wstawki.
    1. Ustaw 20 μl reakcji ligacji zawierającej 1 μl ligazy DNA T4, 0,15-0,5 μg wektorowego DNA (~5 μl) i odpowiednią ilość insertu w oparciu o stosunek insercji do wektora 3:1 i wielkość wstawianego genu; szkielety pMGX mają wielkość od 5,312 do 5,504 pz. Uwzględnij reakcję kontroli negatywnej, która zawiera wszystko oprócz wprowadzanego genu. Upewnij się, że ilość DNA wektora jest równoważna w reakcjach ligacji kontroli ujemnej i ligacji wektora plus insercji.
  6. Przekształć reakcje ligacji w XL1-Blue chemicznie kompetentne komórki E. coli i ligowane plazmidy pMGX-yfg1 (zawierające gen zainteresowania 1), pMGX-yfg2 (zawierające gen zainteresowania 2) ... pMGX-yfgn (zawierające gen zainteresowania n). Stosuj technikę aseptyczną (w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub pod płomieniem).
    1. Rozmrozić 100 μl podwielokrotności chemicznie kompetentnej XL1-Blue E. coli na lodzie przez 5 minut, a następnie dodać 5 μl reakcji ligacji. Inkubować przez 30 minut na lodzie.
    2. Szokować termiczne komórki przez 45 s w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 42 °C, a następnie dodać 200 μl zimnego LB. Inkubować je na lodzie przez 2 minuty.
    3. Potrząsać komórkami w temperaturze 37 °C, 220 obr./min przez 1 godzinę, a następnie rozprowadzić płytkę o objętości 100 μl na płytce z agarem LB zawierającej odpowiedni marker do wyboru (ampicylinę lub kanamycynę).
  7. Przesiewaj klony pod kątem dodatnich transformantów.
    1. Porównaj liczbę kolonii na płytkach kontroli ujemnej i podwiązania. Pożądany jest stosunek liczby kolonii większy niż 1:2. Jeśli na płytce kontroli ujemnej znajduje się duża liczba kolonii, wróć do kroku 2.1 i przejrzyj notatkę.
    2. Wybierz 4-8 indywidualnych kolonii (w zależności od stosunku kontroli ujemnej do ligacji) z każdej reakcji ligacji różnych genów wstawionych do badań przesiewowych (1 n) i zaszczepij 4 ml LB i odpowiednią antybiotykową kulturę nocną / indywidualną kolonię. Hoduj kultury przez noc, wytrząsając w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.
    3. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta.
    4. Przygotuj 20 μl NdeI + EcoRI reakcji trawienia zawierającej 150-500 ng DNA i 1 μl każdego enzymu z 2 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu. W takim przypadku należy dodać NdeI i EcoRI w tym samym czasie, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania będzie znajdował się pomiędzy miejscami restrykcyjnymi. Zalecana jest kontrola ujemna z pustym wektorem pMGX. Trawić przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.

3. Wstawienie genu 2 do wektora pMGX zawierającego gen 1, pMGX-yfg1

  1. Trawienie restrykcyjne pMGX-yfg1 z AvrII i leczenie fosfatazą jelitową cielęcej ().
    1. Stosować 40-μl reakcji trawienia zawierającej 0,5-1,5 μg wektorowego DNA (~5-10 μL wyizolowanego DNA) i 1 μl AvrII z 4 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu. Trawić przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 1,5 μl. Pozostaw w temperaturze 37 °C na dodatkowe 30 minut.
  2. Ograniczenie trawi pMGX-yfg2 z AvrII i XbaI, aby uwolnić interesujący gen.
    1. Stosować 40 μl reakcji trawienia zawierającej 0,5-1,5 μg DNA i 1 μl każdego enzymu z 4 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu. Trawienie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Ograniczenie elektroforezy trawi odpowiedni procent (0,7%) żelu agarozowego i wycina wkładkę i pasma wektorowe za pomocą czystego skalpela/żyletki (patrz kroki 2.2-2.3).
  4. Wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta i określ ilościowo klasę<="xref">17.
  5. Zligować gen 2 do pMGX-yfg1 przy użyciu stosunku insercji do wektora 3:1. Ustawić ujemną ligację strawionego pMGX-yfg1 bez dodatkowej wkładki. Skonfiguruj jak powyżej w kroku 2.5.
  6. Przekształć 5 μl reakcji ligacji w chemicznie kompetentne komórki E. coli XL1-Blue, ligowane plazmidy pMGX-yfg1,2 (zawierające gen zainteresowania 1 i 2) i ujemną kontrolę pMGX-yfg1, jak pokazano w kroku 2.6.
  7. Porównaj liczbę kolonii na płytkach kontroli ujemnej i podwiązania. Pożądany jest stosunek liczby kolonii większy niż 1:2. Jeśli na płytce kontroli ujemnej znajduje się duża liczba kolonii, wróć do kroku 3.1 i dokonaj przeglądu leczenia.
  8. Wybrać 4-8 pojedynczych kolonii (w zależności od stosunku kontroli ujemnej do ligacji) z reakcji ligacji i zaszczepić 4 ml LB plus odpowiedni antybiotyk na pojedynczą kolonię i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.
  9. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta i określ ilościowo DNA17.
  10. Badanie przesiewowe skutecznej insercji drugiego genu poprzez przeprowadzenie trawienia restrykcyjnego pMGX-yfg1,2 za pomocą EcoRI.
    1. Użyć 20 μl reakcji trawienia zawierającej 150-500 ng DNA i 1 μl enzymu EcoRI z 2 μl buforu EcoRI 10x. Trawienie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  11. Elektroforezę przetrawienia restrykcji na odpowiednim procencie żelu agarozowego; poszukać prążka, która odpowiada wielkości genu 2 (patrz Krok 2.2). Gen może wstawiać się do wektora w niepożądanej, odwróconej orientacji.

4. Dodanie trzeciego genu do wektora pMGX zawierającego geny 1 i 2, pMGX-yfg1,2

  1. Ograniczenie trawić pMGX-yfg1,2 z AvrII i leczyć, jak pokazano w kroku 3.1.
  2. Skrót ograniczeń pMGX-yfg3 z AvrII i XbaI, jak pokazano w kroku 3.2.
  3. Elektroforeza ograniczenie trawi odpowiedni procent żelu agarozowego oraz wkładkę akcyzową i opaski wektorowe za pomocą czystego skalpela/żyletki; patrz kroki 2.2-2.3.
  4. Wyekstrahuj DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i określ ilościowo DNA17.
  5. Zligować gen 3 do pMGX-yfg1,2 przy użyciu stosunku 3:1 insertu do wektora i ustawić ujemną ligację strawionego pMGX-yfg1,2 bez dodatkowej insercji, jak pokazano w kroku 3.5.
  6. Przekształć 5 μl reakcji ligacji w chemicznie kompetentne komórki E. coli XL1-Blue, zligowany plazmid pMGX-yfg1,2,3 (zawierający geny będące przedmiotem zainteresowania 1, 2 i 3) i ujemną kontrolę pMGX-yfg1,2, jak pokazano w kroku 2.6.
  7. Porównaj liczbę kolonii na płytkach kontroli ujemnej i podwiązania. Jeśli na płytce kontroli ujemnej znajduje się duża liczba kolonii, wróć do kroku 4.1 i przejrzyj leczenie.
  8. Wybrać 4-8 pojedynczych kolonii (w zależności od stosunku kontroli ujemnej do ligacji) z reakcji ligacji i zaszczepić 4 ml LB plus odpowiedni antybiotyk na pojedynczą kolonię; rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.
  9. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta.
  10. Badanie przesiewowe skutecznej insercji trzeciego genu poprzez przeprowadzenie trawienia restrykcyjnego pMGX-yfg1,2,3 za pomocą EcoRI, jak pokazano w kroku 3.10.
  11. Elektroforezę przetrawienia restrykcji na odpowiednim procencie żelu agarozowego; poszukać prążków, które odpowiadają rozmiarom genu 2 i genu 3 (patrz krok 2.2). Uwaga: gen 3 może wstawiać się do wektora w niepożądanej, odwróconej orientacji. Jeśli geny 2 i 3 są tej samej wielkości, należy wybrać inne odpowiednie miejsce trawienia restrykcyjnego do badań przesiewowych.
    UWAGA: Powtórz w razie potrzeby dla każdego nowego genu.

5. Wytwarzanie interesujących białek za pomocą wielogenowego systemu ekspresji i ocena produkcji za pomocą Western blotting

  1. Przekształć dodatni klon zawierający wszystkie interesujące geny w chemicznie kompetentną E. coli produkującą białka, taką jak BL21-(λDE3).
    1. Rozmrozić 100 μl podwielokrotności chemicznie kompetentnej BL21-(λDE3) E. coli na lodzie przez 5 minut, a następnie dodać 1 μl dodatniego sklonowanego plazmidowego DNA; inkubować przez 30 minut na lodzie.
    2. Szok termiczny komórek przez 45 s w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 42 °C, a następnie dodać 200 μl zimnego LB. Inkubować na lodzie przez 2 minuty.
    3. Potrząsać komórkami w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 1 godzinę, a następnie rozprowadzić płytkę o objętości 100 μl na płytce z agarem LB zawierającej odpowiedni marker do wyboru (ampicylinę lub kanamycynę).
  2. Ekspresja białka przez indukcję izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
    1. Wybrać wyizolowaną kolonię z płytki transformacyjnej B21-(λDE3) i zaszczepić 4 ml LB wraz z odpowiednim antybiotykiem; rosnąć przez noc, wstrząsając w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.
    2. Zaszczepić 100 ml LB plus odpowiednią kulturę antybiotykową, używając 1 ml kultury na noc.
    3. Rosnąć w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min do OD600 0,6.
    4. Indukować kulturę za pomocą 100 μM IPTG i rosnąć przez 15 godzin w temperaturze 25 °C i 220 obr./min.
    5. Usunąć 1 ml kultury i odwirować ją przy 13 000 x g przez 1 minutę; wyrzucić supernatant.
  3. Poddaj komórki lizie za pomocą roztworu do lizy zgodnie z instrukcjami producenta i przygotuj Western blot rozpuszczalnego lizatu komórkowego, aby określić, czy wszystkie białka zostały pomyślnie wyprodukowane19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego badania była koekspresja pięciu białek z jednego plazmidu. Syntetyczne fragmenty genów zoptymalizowane pod kątem pięciu kodonów, kodujące znaczniki heksahistydynowe na N- lub C-końcu, zostały zakupione komercyjnie. Syntetyczne geny zostały namnożone metodą PCR, a następnie indywidualnie sklonowane do wektora PCR-blunt i zsekwencjonowane. W celu wytworzenia plazmidu policistronowego, pięć genów docelowych sklonowano najpierw do odpowiedniego plazmidu pMGX, pMGX-A. Na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Koekspresja wielu genów jest coraz bardziej istotna, szczególnie w charakterystyce i odtwarzaniu złożonych, wielogenowych szlaków metabolicznych 3,4,5. System pMGX sprawia, że wielogenowa koekspresja w E. coli jest rutynowa 6,7,8 i dostępna dla różnych badaczy. W tym badaniu wykazano, że pięć interesujących białek jest jednocze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Enzymes
Jelito cielęce ()New England BiolabsM0290S
AvrIINew England BiolabsR0174S
EcoRINew England BiolabsR0101S
NdeINew England BiolabsR0111S
XbaINowość Anglia BiolabsR0145S
Herculase II Fusion DNA PolimerazaAgilent Technologies600677
T4 DNA LigazaNew England BiolabsM0202S
NazwaFirma<strong>Numer katalogowyKomentarze
Odczynniki
1 kb drabinka DNANew England BiolabsN3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein GelsBio-Rad456-8095
50x TAEFisher Thermo ScientificBP1332-4
AgarFisher Thermo ScientificBP1423-500
AgarozaFisher Thermo ScientificBP160-500
AmpicilinSigma-AlrichA9518-5G
BL21 (DE3) chemicznie kompetentne ogniwaKompensata przygotowana w domu
B-PER Odczynnik do ekstrakcji białek bakteryjnychFisher Thermo ScientificPI78243
dNTP mixAgilent TechnologiesDostarczany z
zestawemdo ekstrakcji żelu polimerazyOmegaD2500-02E.Z.N.A Ekstrakcja żelem, dostarczana przez VWR Cat 3: CA101318-972
GlycineFisher Thermo ScientificBP381-1
His Tag Przeciwciało [HRP], mAb, MouseGenScriptA00612
Immobilon Western Chemiluminescencyjny substrat HRPEMD MilliporeWBKLS0100
IPTGSigma-Alrich15502-10G
LBFisher Thermo ScientificBP1426-500
MetanolFisher Thermo ScientificA411-20
Pasteryzowane odtłuszczone mleko w proszkuinstant Lokalny sklepMleko w sklepie spożywczym bez nazwy jest wystarczające
Membrana nitrocelulozowaAmersham Protran (GE Healthcare, Life Sciences)10600007Membrana PT 0,45 i mikro; m 200 mm x 4 m, dostarczone przez VWR Cat #: CA10061-086
Zestaw do izolacji plazmidowego DNAOmegaD6943-02E.Z.N.A. Plasmid DNA MiniKit I, dostarczony przez VWR Cat #: CA101318-898
pMGXBoddy LabProśba z Boddy Lab Skontaktuj się z cboddy@uottawa.ca
Starters Zintegrowane technologieProjektuj startery zgodnie z potrzebami dla pożądanego genu
Technologie syntetycznego życia genówZaprojektuj i zoptymalizuj zgodnie z potrzebami
Bibuła filtracyjna z grubymi plamamiBio-Rad1703932
Tris baseBioShopTRS001.1
Tween-20Sigma-AlrichP9416-50ML
XL1-Blue chemicznie kompetentne ogniwaKompensata przygotowana w domu
Nazwa FirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
BioSpectrometerEppendorfRK-83600-07
Gel box - PAGEBio-Rad1658005Mini-PROTEIN Tetra Pionowy żelowy do elektroforezy komórkowej
Alpha InnotechAlphaImager
EC Inkubator-piekarnikFisher Thermo Scientific11-690-650D
Inkubator-wytrząsarkaFisher Thermo ScientificSHKE6000-7MaxQ 6000
Personna Maszynki do goleniaFisher Thermo ScientificS04615
Power PackBio-RadS65533QFB300
TransilluminatorVWR InternationalM-10E,6W
ThermocylcerEppendorfZ316091Mastercycler Personal, dostarczany przez Sigma
UV Face-Shield18-999-4542
Kąpiel wodnaFisher Thermo Scientific15-460-2SQ
Zachodni aparat transferowyBio-Rad1703935Mini-Trans Blot Cell
Alkalic Phosphataza, spożywczy DNA izotemperaturowa

Bibliografia

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Syntetyczne operonykonstrukcja plazmid wklonowanie gen wtrawienie restrykcyjnereakcja ligacjitransformacja E colianaliza Western blotselekcja antybiotykowa

Powiązane artykuły