Artykuł metodologiczny

Metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55211

⸱

26 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Environmental Protection and Research (ISPRA), Rome (Italy), 2Department of Biology, Tor Vergata University, Rome (Italy), 3Department of Biology and Evolution of Marine Organisms, Stazione Zoologica, Anton Dohrn, Naples (Italy)

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje nowy protokół oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń, w tym pojawiających się zanieczyszczeń, takich jak nanomateriały, przy użyciu morskiej bakterii Vibrio anguillarum. Metoda ta pozwala na określenie LC50, czyli śmiertelności, stężenia, które powoduje 50% spadek zdolności hodowli bakterii, po 6 godzinach ekspozycji.

Streszczenie

Bakterie są ważnym składnikiem ekosystemu, a zmiany w zbiorowiskach mikroorganizmów mogą mieć znaczący wpływ na cykl biogeochemiczny i sieci pokarmowe. Testy toksyczności oparte na mikroorganizmach są szeroko stosowane, ponieważ są stosunkowo szybkie, powtarzalne, tanie i nie wiążą się z kwestiami etycznymi. W tym miejscu opisujemy ekotoksykologiczną metodę oceny odpowiedzi biologicznej bakterii morskiej Vibrio anguillarum. Metoda ta ocenia ostrą toksyczność związków chemicznych, w tym nowych zanieczyszczeń, takich jak nanocząstki, a także próbek środowiskowych. Punktem końcowym jest zmniejszenie zdolności do hodowli bakterii (tj. zdolności do replikacji i tworzenia kolonii) w wyniku narażenia na działanie substancji toksycznej. Spadek ten można ogólnie określić mianem śmiertelności. Test pozwala na określenie LC50, stężenia, które powoduje 50% spadek bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie, po 6 godzinach ekspozycji. Bakterie zdolne do hodowli są liczone w jednostkach tworzących kolonie (CFU), a "śmiertelność" jest oceniana i porównywana z kontrolą. W niniejszej pracy oceniono toksyczność siarczanu miedzi (CuSO4). Po trzech niezależnych testach zaobserwowano wyraźną zależność między dawką a reakcją, ze średnią LC50 wynoszącą 1,13 mg/l. Protokół ten, w porównaniu z istniejącymi metodami z mikroorganizmami, ma zastosowanie w szerszym zakresie zasolenia i nie ma ograniczeń dla próbek barwionych/mętnych. Jako medium ekspozycyjne wykorzystuje roztwór soli fizjologicznej, unikając ewentualnych zakłóceń podłoża wzrostowego z badanymi zanieczyszczeniami. Obliczenia LC50 ułatwiają porównania z innymi testami biologicznymi powszechnie stosowanymi do ocen ekotoksykologicznych środowiska morskiego.

Wprowadzenie

Ekotoksykologiczne testy biologiczne oceniają toksyczność substancji chemicznych lub próbek środowiskowych za pomocą standardowych modeli biologicznych, integrując wpływ fizycznych, chemicznych i biologicznych czynników stresogennych na ekosystemy. Ze względu na złożoność ekosystemów oceny ryzyka ekotoksykologicznego muszą uwzględniać zestaw testów biologicznych, które obejmują organizmy z różnych poziomów troficznych. Testy toksyczności na zwierzętach laboratoryjnych mogą być kosztowne, czasochłonne i wątpliwe etycznie. Dążenie do ograniczenia testów na zwierzętach i opracowania alternatywnych podejść (np. na bakteriach i zwierzętach bezkręgowych) jest obecnie kluczową kwestią, o czym informują obowiązujące prawodawstwo europejskie, w tym dyrektywa UE w sprawie ochrony zwierząt, 7. poprawka do dyrektywy kosmetycznej UE oraz REACH.

Skorupiaki, ryby i glony są głównie używane do pomiarów toksyczności w środowisku morskim1. Bakterie są ważnym elementem ekosystemu, a zmiany w zbiorowiskach mikrobiologicznych mogą mieć znaczący wpływ na cykl biogeochemiczny i inne krytyczne usługi ekosystemowe. Testy toksyczności oparte na mikroorganizmach zyskują na popularności, ponieważ są stosunkowo szybkie, powtarzalne i tanie oraz nie budzą wątpliwości etycznych2. Celem niniejszej pracy jest opisanie protokołu ekotoksykologicznego służącego do oceny odpowiedzi bakterii morskiej Vibrio anguillarum (Listonella anguillarum, Vibrionaceae) na narażenie na zanieczyszczenia środowiskowe.

V. anguillarum to Gram-ujemna, krótka, zakrzywiona bakteria pręcikowa (0,5 x 1,5 μm) z polarną wicią. Zazwyczaj występuje w słonawej lub słonej wodzie, jest halotolerancyjny, o optymalnym zasoleniu około 20 i optymalnej temperaturze między 25 a 30 °C3. Został wybrany jako model organizmu ze względu na jego wszechobecność i ważną rolę ekologiczną w oceanach na całym świecie4. Wiadomo, że niektóre serotypy V. anguillarum powodują wibriozę u różnych gatunków ryb morskich lub słonawych5,6. W tym celu niektóre etapy eksperymentu wymagają standardowych praktyk mikrobiologicznych, ale nie jest potrzebny żaden specjalny sprzęt ochronny ani środki ostrożności. Proponowany protokół badania toksyczności wykorzystuje zdolność do hodowli bakterii (tj. zdolność do replikacji i tworzenia kolonii) jako punkt końcowy i pozwala na określenie LC50, stężenia, które powoduje 50% redukcję bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie, po 6-godzinnej ekspozycji. W Vibrio, podobnie jak u innych drobnoustrojów, ta redukcja, którą ogólnie określamy jako śmiertelność, może być częściowo spowodowana przez osobniki w fazie żywotnej, ale niehodowlanej (VBNC)7. W tym badaniu zastosowaliśmy tę metodę do pomiaru toksycznego działania siarczanu miedzi (CuSO4), referencyjnego środka toksycznego.

Ta metoda została opracowana, aby zapewnić odpowiedni, oparty na mikroorganizmach test do oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń/związków chemicznych, w tym pojawiających się zanieczyszczeń, takich jak nanomateriały. Nowatorstwo tego protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami stosowanymi w odniesieniu do mikroorganizmów jest związane głównie z podłożem ekspozycyjnym i punktem końcowym. W rzeczywistości ekspozycja odbywa się w roztworze soli, unikając ewentualnej interferencji pożywki wzrostowej z badanymi zanieczyszczeniami, które mogą wpływać na odpowiedź biologiczną8. Punktem końcowym jest zmniejszenie zdolności do hodowli bakterii, które można łatwo porównać z innymi ostrymi punktami końcowymi stosowanymi do ekotoksykologicznych badań przesiewowych w środowiskach morskich/słonawych, w oparciu o przeżywalność/śmiertelność. Co więcej, w protokole wykorzystano technikę mikroliczenia ciecz do płytki, stosowaną już w przypadku E. coli9, zmniejszając objętość, a tym samym wysiłek eksperymentalny (szczegóły w krokach 3.3 i 3.4 protokołu).

Protokół

1. Przygotowanie odczynników/materiałów

  1. Przygotować (około 300) sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml do seryjnego rozcieńczania zawiesin bakteryjnych, a także sterylne probówki o pojemności 15 ml jako pojemniki testowe oznaczone stężeniami testowymi.
  2. Przygotuj 2% roztwór NaCl jako pożywkę ekspozycyjną i wysterylizuj go. Alternatywnie użyj sterylizowanej syntetycznej lub naturalnej wody morskiej o zasoleniu od 5 do 40.
  3. Przygotuj tryptyczny agar sojowy (TSA) z 2% NaCl zgodnie ze wskazówkami na etykiecie i biorąc pod uwagę ilość NaCl już obecnego w pożywce.
  4. Wlać TSA (chłodną, ale nadal płynną) do 90-milimetrowych szalek Petriego, uprzednio oznaczonych badanym stężeniem i czasem ekspozycji, liczbą powtórzeń i współczynnikiem rozcieńczenia; 19 ml to odpowiednia objętość.
  5. Przygotuj pożywkę do uprawy bulionu sojowego tryptycznego (TSB) zgodnie ze wskazówkami na etykiecie. Dodać odpowiednią ilość NaCl, aby uzyskać takie samo zasolenie jak podłoże ekspozycyjne.
  6. Przygotować roztwór podstawowyCuSO4 z wodą podwójnie destylowaną i wysterylizować (niezbędną) porcję za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. W przypadku próbek środowiskowych należy przygotować odpowiedni odstęp między rozcieńczeniami próbki i wysterylizować je za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
  7. Przygotować roztwory testowe w probówkach o pojemności 15 ml oznaczonych stężeniami testowymi. Wypełnić kontrolę ujemną 5 ml pożywki ekspozycyjnej (2% NaCl). Napełnić pozostałe probówki odpowiednią ilością pożywki ekspozycyjnej i roztworu podstawowegoCuSO4 w celu uzyskania badanych stężeń w końcowej objętości 5 ml.

2. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

  1. Na 12-18 godzin przed badaniem należy przygotować płynną świeżą kulturę Vibrio anguillarum. Za pomocą sterylnej pętli wybierz pojedynczą, dobrze odizolowaną kolonię z nocnej hodowli na stałym podłożu (TSA). Zaszczepić probówkę wypełnioną 10 ml TSB i inkubować kulturę bakteryjną w temperaturze 25 °C przez 12-18 godzin.
  2. Po 12-18 godzinach należy oszacujeć stężenie bakterii w inokulum spektrofotometrycznie. Wirować inokulum i zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 600 nm, używając TSB jako ślepej próby.
  3. Aby uzyskać znane stężenie bakterii, rozcieńczyć 2 ml inokulum z wirem, dodając ilość TSB obliczoną według tego wzoru:
    TSB ml = [(OD / 0,14) * 2] - 2.
  4. Sprawdzić, czy gęstość optyczna rozcieńczonego inokulum wynosi 0,140 (±0,005), co odpowiada 0,5 punktu na wzorcu nefelometrycznym McFarlanda.
  5. Odwirować rozcieńczony inokulum przez 10 minut w temperaturze 3 000 g. Wyeliminuj supernatant i ponownie zawiesić osad mikrobiologiczny w 1 ml 2% roztworu NaCl (pożywka ekspozycyjna).

3. Testowanie ekspozycji

  1. Dodać 150 μl ponownie zawieszonego inokulum bakteryjnego do każdej probówki, łącznie z kontrolą. Zawiesiny V. anguillarum inkubować przez 6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności i w ciągłym wstrząsaniu, aby uniknąć sedymentacji.
  2. Na początku (T0) i na końcu (T6) czasu narażenia należy przeprowadzić zliczanie bakterii we wszystkich narażonych zawiesinach bakteryjnych przy użyciu metod liczenia jednostek tworzących kolonie (CFU).
  3. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej odsłoniętej zawiesiny bakteryjnej w trzech egzemplarzach, stosując dziesięciokrotny współczynnik rozcieńczenia (do 10-5). Dodać 100 μl każdej zawiesiny bakteryjnej do odpowiedniej probówki już wypełnionej 900 μl pożywki ekspozycyjnej (2% NaCl). Kontynuuj seryjne rozcieńczanie, wirując na każdym kroku, aby ponownie zawiesić bakterie.
  4. Umieścić 10 μl rozcieńczeń 10-4 i 10-5 na płytkach Petriego TSA w odpowiednim segmencie. Szybko pozwól kroplom ślizgać się po małym okręgu, obracając płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 48 godzin.

4. Liczenie CFU

  1. Po 48 godzinach policz kolonie wyhodowane na szalkach Petriego; płytki zawierające od 5 do 50 kolonii są optymalne do dokładnego liczenia.
  2. Obliczyć liczbę żywotnych bakterii na ml każdej narażonej zawiesiny bakteryjnej, stosując następujące wzory:
    10-4 → jtk/ml = nr jtk x 100 x 10 000
    10-5 → jtk/ml = zero jtk x 100 x 100 000
  3. Średnią z liczb uzyskanych w równoległych powtórzeniach należy wykorzystać do oceny śmiertelności w porównaniu z kontrolą. Oblicz śmiertelność w procentach za pomocą następującego wzoru:
    M% = 100 - [(Nie dotyczy) * 100]
    UWAGA: Gdzie N = liczba jtk/ml wyhodowanych po narażeniu na działanie substancji toksycznej; C = liczba jtk wyhodowanych w pożywce kontrolnej.
  4. Oblicz LC50 (tj. stężenie substancji toksycznej, które zmniejsza liczbę aktywnie replikujących się bakterii o 50% na ml; CFU/ml) z analizą regresji nieliniowej przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów). Przeprowadź jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie testy t post-hoc parami, aby ocenić istotne różnice między terapiami.

Wyniki

Wyniki trzech niezależnych prób narażenia V. anguillarum na cztery stężenia CuSO4 wykazują wyraźną zależność od dawki oraz znaczący spadek liczby bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie wraz ze wzrostem stężenia toksykantu referencyjnego (Rycina 1; ANOVA, F = 20,28, p <0,001). Liczba CFU/mL jest znacząco zredukowana przy stężeniu 1,25 mg/L (test post-hoc Tukeya, p <0,05) w porównaniu z kontrolą (CNTR). Przy najwyższym testowanym stężeniu nie wykryto żadnych bakterii zdolnych do hodowli. Nie stwierdzono różnic w toksyczności CuSO4 w szerokim zakresie zasolenia medium ekspozycyjnego (tzn. 5, 20 lub 35 g/L NaCl, dane nie przedstawiono). Reprezentatywny wynik analizy statystycznej wykazujący regresję nieliniową przedstawiono na Rycynie uzupełniającej 1. Wartości LC50 obliczone dla trzech niezależnych prób (Tabela 1) potwierdzają wykonalność i powtarzalność tej metody.

Wykres hamowania wzrostu bakterii, stężenie CuSO4 w stosunku do liczby CFU, przedstawiający procentową redukcję.
Rycina 1: Vibrio anguillarum poddane działaniu CuSO4. Średnia liczba CFU/mL (CFU = jednostka tworząca kolonię) po ekspozycji na różne stężenia CuSO4 przez 6 h. Wartości przedstawiają średnią (±SD) z trzech niezależnych prób. Redukcję bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie w stosunku do kontroli (CNTR) podano w żółtych polach (jako wartości procentowe). Istotne różnice względem kontroli, określone na podstawie testu post-hoc Tukeya, zaznaczono gwiazdkami (* = p <0,05; ** = p <0,01). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela wyników toksyczności CuSO4 przedstawiająca wartości LC50, granice dolne i górne dla trzech prób oraz średnią ±SD.
Tabela 1: Wartości stężenia letalnego (LC50) dla Vibrio anguillarum wystawionych na działanie CuSO4. Przedstawiono wyniki trzech niezależnych prób oraz wartości średnie (± SD).


Rycina dodatkowa 1: Analiza regresji nieliniowej. Reprezentatywny wynik analizy regresji nieliniowej (model Logit-Hill) przeprowadzonej na wynikach testu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano nowy test biologiczny z bakterią morską V. anguillarum , który został z powodzeniem zastosowany do oceny toksycznego działania CuSO4, referencyjnego środka toksycznego, wykazując wyraźną zależność między dawką a reakcją. Bakteria morska V. anguillarum została wybrana jako organizm modelowy, ponieważ jest halotolerancyjna, wszechobecna i reprezentatywna dla ekosystemów morskich.

Test może być wykonywany w szerokim zakresie wartości zasolenia (5-40) i może wykorzystywać roztwory soli oraz syntetyczne lub naturalne wody morskie jako medium ekspozycyjne, o ile mikroorganizmy mogą z łatwością przetrwać przez cały czas trwania testu. Pozwala to na analizę różnego rodzaju próbek, w tym środowisk słonawych i morskich.

W fazie ekspozycji nie jest wymagana żadna pożywka wzrostowa, co pozwala uniknąć jego ingerencji w zanieczyszczenia8 i jego ewentualnego wpływu na odpowiedź biologiczną. Protokół jest niezawodny, szybki, opłacalny i stosunkowo łatwy. Procedura mikrozliczania cieczy na płytkę9 ma tę zaletę, że wykorzystuje małe objętości (próbki), chociaż oznacza to wysoki stopień dokładności i wytrzymałości. Wyniki trzech niezależnych badań i powtórzeń dla każdego leczenia wskazują na wysoką powtarzalność tej metody. Wykorzystanie bakterii jako modelu biologicznego, a także zdolność adaptacyjna tej techniki, sprzyjają ekologicznemu i środowiskowemu znaczeniu tej procedury. Innymi krytycznymi kwestiami technicznymi są dokładność w przygotowaniu inokulum bakteryjnego i sterylność wymagana na niektórych etapach procedury.

Proponowany test jest szybszy (6 godzin) niż inne morskie testy ekotoksykologiczne (24-96 godzin) i nie stwarza problemów etycznych wynikających z wykorzystania organizmów wyższych. Ponadto dane dotyczące referencyjnej substancji toksycznej wskazują na wartości LC50 porównywalne z wartościami uzyskanymi w ostrych badaniach na innych gatunkach morskich10,11, co świadczy o dobrej czułości. Wśród testów biologicznych bakterii test inhibicji luminescencji V. fischeri jest najbardziej powszechny i dobrze standaryzowany12. Ten test biologiczny jest bardzo szybki (15-30 min) i ważny do badania próbek w fazie stałej, ale mogą na niego wpływać kolorowe i mętne próbki, które zakłócają pomiary luminescencji. Zasolenie jest czynnikiem ograniczającym w stosowaniu wyżej wymienionego testu, przy czym wymagane jest 2% NaCl13. Wręcz przeciwnie, proponowany tutaj test z V. anguillarum daje przystępne cenowo wyniki w szerokim zakresie wartości zasolenia, nie ma ograniczeń w odniesieniu do mętnych lub kolorowych próbek i wymaga tańszego sprzętu w porównaniu z analizatorami luminescencji. Porównanie wyników naszego badania z wynikami dostępnymi w literaturze dla V. fisheri 14,15,16 pokazuje porównywalne wartości EC50, co dodatkowo potwierdza skuteczność tego testu biologicznego.

Ten test biologiczny ocenia zmniejszenie zdolności do hodowli bakterii, ogólnie określane jako śmiertelność, zamiast tempa wzrostu populacji lub zahamowania aktywności enzymatycznej, które są stosowane w obecnie dostępnych testach dla mikroorganizmów. Obliczenie LC50 pozwala na porównanie z innymi testami biologicznymi powszechnie stosowanymi do oceny ekotoksykologicznej środowisk morskich, w których często punktem końcowym jest przeżycie/śmiertelność. Pilnie konieczne jest przeprowadzenie ćwiczeń interkalibracyjnych w celu oceny/potwierdzenia wiarygodności i odtwarzalności tego testu oraz wsparcia jego standaryzacji i stosowania w protokołach regulacyjnych.

Coraz powszechniejsze stosowanie nanomateriałów i ich potencjalne uwalnianie do środowiska pociąga za sobą konieczność przeprowadzenia oceny ryzyka17 . Wydaje się jednak, że klasyczne podejścia (ekotoksykologiczne) do tych pojawiających się zanieczyszczeń nie dają przystępnych wyników i mogą wymagać pewnych dostosowań18. Charakterystyka tego nowego testu biologicznego pozwala na jego łatwe i użyteczne zastosowanie do oceny toksyczności nanocząstek. W rzeczywistości możliwość przeprowadzenia testu przy różnym zasoleniu dostarczy informacji na temat zachowania nanocząstek przy różnych stężeniach jonowych, co jest zmienną parametru środowiskowego, która może znacząco wpłynąć na toksyczność19. Ponadto w ocenach ekotoksyczności nanocząstek nie zaleca się szczególnie stosowania pożywki wzrostowej i składników odżywczych, ponieważ substancje organiczne mogą ułatwiać ich wchłanianie poprzez zwiększenie skutków toksycznych20 lub mogą powodować agregację, zmniejszając biodostępną frakcję, a tym samym ich toksyczność21.

Podsumowując, test biologiczny na Vibrio anguillarum jest obiecującym narzędziem do oceny ryzyka związanego z klasycznymi i pojawiającymi się zanieczyszczeniami, a także do oceny stanu środowiska morskiego i słonawego.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez projekt badawczy: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti e metodi per il monitoraggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ("Nano-Biotechnologia: środowisko i zdrowie. Projekt 2: Środowisko. Narzędzia i metody ekotoksykologicznego monitorowania nanocząstek") przyznanej LM przez Region Lazio-Consorzio Hypatia. AR został sfinansowany z grantu podoktorskiego Uniwersytetu Tor Vergata/Regione Lazio-Consorzio Hypatia w ramach wcześniej cytowanego projektu. Umowa z Uniwersytetem ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) umożliwiła wzajemne korzystanie z obiektów i wymianę naukowców.

Autorzy są wdzięczni prof. Marii Cristinie Thaller, naszemu aniołowi stróżowi, za wszystkie działania mikrobiologiczne, za wzbudzenie zainteresowania światem mikroorganizmów i za znaczącą pomoc w ulepszaniu naszych badań nad tym zagadnieniem. Autorzy dziękują Andrei Tornambè i Erice Magaletti za cenną współpracę z ISPRA Laboratorium Ekologii Fitoplanktonu i Ekotoksykologii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Vibrio anguillarum (szczep AL 102, serotyp O1)Uzyskany z kolekcji laboratoryjnej NOIFMA (Norwegia)
Tryptyczny agar sojowy Liofilchem610052Odwodnione podłoże hodowlane
Pożywka do produkcji bulionu sojowegoLiofilchem610053Odwodnione podłoże hodowlane
CuSO4· 5H2OSigma-Aldrich209198
NaCl Sigma-AldrichS-3014
Nazwa sprzętu<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
Okap laminarny bezpieczeństwa biologicznego ESCO
 Fratelli GalliMod. 2100
Nazwa oprogramowaniaFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
Benchmark Dose Software US EPA2.4.0 Rok 2012
Inkubator Dawka wzorcowa

Bibliografia

  1. Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
  2. Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
  3. Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
  4. Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
  5. Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
  6. Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
  7. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
  8. Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
  9. Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
  10. Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
  11. Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
  12. Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
  13. Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030(2003).
  14. Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
  15. Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
  16. Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
  17. Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
  18. Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
  19. Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
  20. Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
  21. Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Badanie ostrej toksyczno cijednostki tworz ce koloniewyznaczanie LC50siarczan miedzirozcie czanie seryjneroztw r soli fizjologicznejzdolno bakterii do wzrostu w kulturze
Metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.