Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Podsumowanie

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Streszczenie

Sygnalizacja Notch jest kluczowym elementem wielu procesów fizjologicznych i patologicznych. Natura sygnalizacji Notch sprawia jednak, że badanie in vitro jej różnorodnych, a czasem sprzecznych ról jest wyzwaniem. Jako składnik bezpośredniej komunikacji komórka-komórka zarówno z receptorami, jak i ligandami związanymi z błoną plazmatyczną, sygnalizacja Notch nie może być aktywowana in vitro przez proste dodanie ligandów do pożywek hodowlanych, jak jest to możliwe w przypadku wielu innych szlaków sygnałowych. Zamiast tego ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym.

Różnice w metodach aktywacji sygnalizacji Notch mogą prowadzić do różnych wyników w hodowanych komórkach. W szczególności w przypadku prekursorów osteoklastów różnice w metodach stymulacji Notch oraz hodowli i różnicowaniu prekursorów osteoklastów doprowadziły do sporów co do tego, czy sygnalizacja Notch jest pozytywnym, czy negatywnym regulatorem różnicowania osteoklastów. Podczas gdy bliższe porównania różnicowania osteoklastów w różnych warunkach stymulacji Notch in vitro i modelach genetycznych w dużej mierze rozwiązały kontrowersje dotyczące sygnalizacji Notch i osteoklastów, standaryzowane metody ciągłej i tymczasowej stymulacji sygnalizacji Notch w hodowanych komórkach mogą zapobiec takim rozbieżnościom w przyszłości.

Ten protokół opisuje dwie metody stymulowania sygnalizacji Notch, szczególnie w hodowanych prekursorach osteoklastów myszy, chociaż te metody powinny być stosowane do każdego typu komórek przylegających z niewielkimi poprawkami. Pierwsza metoda powoduje ciągłą stymulację sygnalizacji Notch i polega na unieruchomieniu liganda Notch na powierzchni hodowli tkankowej przed wysiewem komórek. Drugi, który wykorzystuje ligand Notch związany z kulkami agarozy, pozwala na tymczasową stymulację sygnalizacji Notch w komórkach, które są już przyklejone do powierzchni hodowli. Protokół ten obejmuje również metody wykrywania aktywacji Notch w prekursorach osteoklastów, a także reprezentatywne markery transkrypcyjne aktywacji sygnalizacji Notch.

Wprowadzenie

Szlak sygnałowy Notch u ssaków jest homologiczny do tego samego szlaku u Drosophila melanogaster i składa się z czterech transbłonowych receptorów Notch (Notch1-4) i pięciu ligandów związanych z błoną z rodzin Jagged (JAG1 i JAG2) oraz Delta-like (DLL1, 3,& 4)¹. Sygnalizacja Notch jest inicjowana, gdy receptor Notch na komórce odbiorczej jest związany przez ligand na komórce nadawczej². Podczas tej transaktywacji ligand Notch związany z błoną wytwarza siłę rozciągającą na związany z błoną receptor Notch^3,4. Siła rozciągająca wiązania liganda indukuje zmiany konformacyjne w receptorze Notch, które ułatwiają zewnątrzkomórkowe rozszczepienie receptora przez enzym konwertujący TNFalpha (TACE), po którym następuje wewnątrzkomórkowe zdarzenie rozszczepienia, w którym pośredniczy kompleks gamma-sekretazy zawierający presenilinę (γ-sekretaza). γ-sekretaza uwalnia wewnątrzkomórkową domenę Notch (NICD), która przemieszcza się do jądra, gdzie tworzy kompleks aktywacji transkrypcyjnej z CBF-1-Su(H)-Lag-1 (CSL), podobnymi do masterminda (MAML) i czynnikami specyficznymi dla typu komórki, aby napędzać ekspresję docelowych genów⁵.

Mechaniczne elementy aktywacji sygnalizacji Notch powodują konieczność stosowania unikalnych metod aktywacji szlaku Notch in vitro. Rozpuszczalne ligandy Notch mogą wiązać się z receptorami Notch, ale nie wytwarzają sił rozciągających niezbędnych do uwalniania NICD, jednocześnie konkurencyjnie hamując wiązanie ligandów Notch związanych z komórkami. Tak więc dodanie rozpuszczalnych ligandów Notch do pożywki hodowlanej może osłabić normalną sygnalizację Notch^6,7. Na szczęście ligandy Notch mogą indukować uwalnianie NICD, jeśli są przymocowane do odpowiednio sztywnego podłoża^5,8,9,10. Wysiewanie komórek na podłożach hodowlanych pokrytych ligandem lub nakładanie na komórki kulek pokrytych ligandem może aktywować sygnalizację Notch, a wybór między nimi zależy przede wszystkim od pożądanego czasu stymulacji Notch. W celu natychmiastowej, tymczasowej aktywacji sygnalizacji Notch, co byłoby pożądane w punkcie środkowym testu funkcjonalnego lub różnicowania, ligand Notch można związać z kulkami agarozy, nałożyć na hodowane komórki i wypłukać w dowolnym momencie. Aby uzyskać bardziej trwałą sygnalizację Notch od początku okresu hodowli, płytki do hodowli tkankowych można pokryć ligandem przed wysiewem komórek.

Dla celów tego protokołu, metody są przeprowadzane przy użyciu prekursorów osteoklastów myszy, ale metody i wariacje metod opisanych tutaj mają zastosowanie do szerokiej gamy typów komórek6^,11,12,13,14. Osteoklasty są ostatecznie zróżnicowanymi krwiotwórczymi komórkami linowymi, które są odpowiedzialne za resorpcję tkanki kostnej i są zaangażowane w wiele zaburzeń utraty masy kostnej¹⁵. W związku z tym badania in vitro różnicowania osteoklastów od ich prekursorów z linii monocytów/makrofagów oraz mechanizmów molekularnych kontrolujących ich funkcję mają zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia osteoklastów i opracowania nowych terapii regenerujących kości. Chociaż obecnie powszechnie przyjmuje się, że sygnalizacja Notch odgrywa pozytywną rolę w różnicowaniu i funkcjonowaniu osteoklastów, różnice zarówno w stymulacji sygnalizacji Notch, jak i hodowli i różnicowaniu prekursorów osteoklastów doprowadziły do początkowo sprzecznych wyników^16,17,18,19. Dokładniejsze badanie różnic w metodach i wykorzystaniu modeli genetycznych znacznie wyjaśniło rolę sygnalizacji Notch w osteoklastogenezie, ale zastosowanie standaryzowanych metod stymulacji i hodowli Notch może zapobiec takim kontrowersjom w przyszłych badaniach sygnalizacji Notch w innych typach komórek^20,21,22,23.

Istnieje wiele metod hodowli i różnicowania prekursorów osteoklastów myszy, a ponieważ w przypadku różnych metod stymulowania sygnalizacji Notch, najlepsza metoda będzie zależeć od pytania eksperymentalnego. W niniejszym artykule przedstawiona zostanie nasza preferowana metoda hodowli przylegających i nieprzylegających frakcji komórek szpiku wypłukanych z kości długich myszy. Metoda ta ma tę zaletę, że zasadniczo nie wymaga specjalistycznego sprzętu i wytwarza komórki, które można zastosować do różnych metod różnicowania.

Protokół

Wszystkie badania z udziałem kręgowców zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Przygotowanie podłoża hodowlanego

1. Przygotować α-MEM, rozpuszczając minimalną ilość niezbędnego podłoża (MEM) w proszku i 1,9 g wodorowęglanu sodu w 900 ml H₂O i uzupełnić 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 100 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Sterylizuj za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) 0,22 μm.
2. Przygotować pożywkę makrofagową, uzupełniając α-MEM rekombinowanym mysim czynnikiem stymulującym makrofagi i kolonie (M-CSF) o stężeniu 35 ng/ml
3. Przygotować pożywkę dla osteoklastów, uzupełniając pożywkę makrofagową o 100 ng/ml RANKL

2. Izolacja komórek szpiku kostnego

1. Napełnić jedną strzykawkę o pojemności 10 ml igłą o rozmiarze 255/8 na mysz 10 ml α-MEM.
2. Poddaj myszy eutanazji poprzez 10-minutową ekspozycję na CO₂ przy natężeniu przepływu 1,3 l/min. Upewnij się, że zwierzę umrze, po narażeniu na CO₂ ze zwichnięciem szyjki macicy przed przystąpieniem do sekcji.
3. Używając czystej techniki, wypreparuj i oddziel piszczele i kość udową. Zdezynfekuj skórę myszy 70 % etanolem przed wykonaniem nacięcia wzdłuż przedniej powierzchni każdej kończyny tylnej w celu odsłonięcia kości piszczelowej i kości udowej.
   1. Przeciąć staw kolanowy, aby uwolnić dystalny koniec kości udowej i przeciąć kość udową jak najbliżej miednicy. Usuń kość udową i oczyść jak najwięcej tkanki miękkiej. Aby usunąć kość piszczelową, przetnij kostkę i usuń jak najwięcej tkanki miękkiej.
4. Przytrzymaj kość za pomocą kleszczy i przepłucz szpik do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 2,5 ml o temperaturze pokojowej α-MEM, łącząc płukanie szpiku z jednej myszy do jednej probówki.
   UWAGA: Udane płukanie szpiku zmieni zabarwienie kości z czerwonego na beżowe.
5. Poczekaj, aż zanieczyszczenia osiądą na dnie probówki i przenieś supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, uważając, aby nie przenieść żadnych zanieczyszczeń.
   UWAGA: Niektóre komórki mogą również osadzać się wraz z resztkami szpiku. Jeśli wymagana jest większa liczba komórek, płukanie szpiku kostnego można przefiltrować przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm do czystej probówki o pojemności 15 ml.
6. Probówkę (probówki) o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej do granulek komórek.
7. Odessać próżniowo supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 0,5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty w celu lizy czerwonych krwinek.
8. Dodać 10 ml PBS bezpośrednio do roztworu komórek ACK i odwirować przy 300 x g przez 5 min.
   UWAGA: Poprzednio czerwona krwinka powinna być teraz beżowa.
9. Odessać próżniowo supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml α-MEM, a następnie rozmieścić płytkę w naczyniu poddanym działaniu kultur tkankowych o średnicy 100 mm. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych.
   UWAGA: Liczenie komórek nie jest konieczne na tym etapie. W tym czasie przylegające komórki ze szpiku kostnego przyczepią się do powierzchni hodowli; Populacje komórek szpiku kostnego, które nie przylegają do zapytania, pozostaną w zawiesinie. MCSF nie jest obecny w pożywce hodowlanej podczas tej początkowej inkubacji.

3. Wzbogacanie prekursorów osteoklastów

1. Po całonocnej inkubacji płukania szpiku należy przenieść supernatant hodowli zawierający nieprzylegające komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
   UWAGA: Szalki hodowlane z przylegającymi komórkami, które zawierają mezenchymalne komórki progenitorowe szpiku kostnego, można wyrzucić lub karmić świeżymi α-MEM, jeśli jest to pożądane do innych eksperymentów.
   UWAGA: Osteoklasty można odróżnić bezpośrednio od tych nieprzylegających komórek szpiku kostnego, posiewając je w naczyniach poddanych hodowli tkankowej o gęstości 4 x 10⁵ komórek/^cm2 w pożywce osteoklastowej i pożywce odświeżającej co drugi dzień przez 5 dni.
2. Dodać α-MEM do nieprzylegającego roztworu komórek do końcowej objętości 18 ml i dodać M-CSF do końcowego stężenia 35 ng/ml.
3. Dodać po 3 ml zawiesiny komórek do 6 naczyń do hodowli zawiesiny o średnicy 60 mm.
4. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych. W tym czasie M-CSF będzie stymulował różnicowanie makrofagów, które mogą przylegać nawet do powierzchni niepoddanych hodowli tkankowej.
5. Po całonocnej inkubacji należy ponownie nakarmić prekursory osteoklastów 3 ml świeżej pożywki makrofagowej. Spowoduje to usunięcie nieprzylegających komórek, które nie zróżnicowały się w makrofagi.
6. Kontynuować hodowlę prekursorów osteoklastów w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ przez 2 dni lub do momentu, gdy kultury osiągną około 70% konfluencji.

4. Różnicowanie osteoklastów

1. Przemyć prekursory osteoklastów 5 ml PBS i potraktować komórki 1 ml enzymu proteolitycznego/kolagenolitycznego pochodzenia morskiego w temperaturze pokojowej, aż komórki będą mogły zostać usunięte przez delikatne stukanie w płytkę.
   UWAGA: Prekursory osteoklastów można podnieść tylko wtedy, gdy są hodowane w naczyniach zawiesinowych; Prekursory przyczepiają się zbyt mocno do powierzchni poddanych działaniu kultur tkankowych, aby można je było podnieść. Trypsyna może aktywować prekursory osteoklastów i należy jej unikać.
2. Dodać 4 ml α-MEM do każdego naczynia i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz komórki do gęstości 5 x 10⁴ komórek/ml i dodaj M-CSF do końcowego stężenia 35 ng/ml i RANKL do końcowego stężenia 100 ng/ml.
3. Komórki nasienne o gęstości 2,6 x 10⁴ komórki/^cm2 na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 2 dni. Różnicowanie przeprowadza się zwykle na płytkach 24-dołkowych, gdzie do każdej studzienki umieszcza się 5 x 10⁴ komórek.
4. 2 dni po rozpoczęciu różnicowania należy ponownie nakarmić komórki, zastępując je 1 ml świeżej pożywki dla osteoklastów.
   UWAGA: Różnicowanie osteoklastów zwykle kończy się w ciągu 3 dni. Powstałe osteoklasty można wybarwić metodą TRAP w celu łatwej oceny ilościowej i analizy morfologicznej.

5. Ciągła stymulacja sygnalizacji wycięcia za pomocą powierzchni pokrytej Jagged1

1. Zawiesić kozie przeciwciało antyludzkie IgG Fc w PBS w stężeniu 10 μg/ml (rozcieńczenie 1:1 000 10 mg/ml bulionu). Dodać roztwór przeciwciała do powierzchni hodowli o gęstości 1,3 μg/^cm2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. W przypadku płytek 24-dołkowych dodać 250 μl (2,5 μg) na dołek.
2. Odsysać próżniowo studzienki i ponownie napełnić 1 ml PBS. Powtórz ten krok 2 razy.
3. Zawiesić rekombinowane białko fuzyjne Jagged1-Fc w PBS o stężeniu 10 μg/ml. Dodać roztwór Jagged1-FC do powierzchni hodowli pokrytej przeciwciałem o gęstości 1,3 μg/^cm2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Powierzchnie hodowlane pokryte przeciwciałem mogą być używane wyłącznie jako kontrole.
4. Odsysać próżniowo studzienki i ponownie napełnić 1 ml PBS. Powtórz ten krok 2 razy. Przechowuj PBS w studzienkach do momentu tuż przed wysiewem komórek, aby zapobiec ich wysuszeniu.
5. Wysiewaj 2,6 x 10⁴ prekursory osteoklastów/^cm2 na powlekane powierzchnie. Sygnalizacja wcięcia będzie stymulowana w sposób ciągły przez co najmniej 3 dni.

6. Tymczasowa stymulacja sygnalizacji wycięcia za pomocą koralików pokrytych Jagged1

1. Połącz następujące składniki w probówce o odpowiedniej wielkości: 0,5 μg/cm² Jagged1-Fc, 21 μl/cm² kulki białkowe G agarozy i PBS do końcowej objętości 1,5 ml. Aby przygotować odpowiednią liczbę kulek Jagged1 na 1 dołek z 24-dołkowej płytki, połącz 1 μg Jagged1-Fc, 40 μl kulek białkowych G z agarozy i PBS w 1,5 ml.
2. Probówkę inkubacyjną obracać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
3. Probówka wirówkowa o pojemności 300 x g przez 1 minutę do granulek. Zawieś koraliki w 1,5 ml PBS. Powtórz to pranie jeszcze 2 razy.
4. Zawiesić kulki Jagged1 w pożywce hodowlanej 130 μl/^cm2 i nałożyć na hodowane komórki.
5. Inkubować komórki z kulkami w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ przez żądany okres. Usuń koraliki za pomocą kilku przemyć PBS lub pożywki hodowlanej.
6. Sprawdź aktywację sygnalizacji Notch poprzez pomiar transkryptów genu docelowego Notch¹⁰.

Wyniki

Celem tej metody jest hodowla i stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów. Przy prawidłowej hodowli prekursory osteoklastów wykazują głównie wydłużoną, wrzecionowatą morfologię z gładką cytoplazmą (Rysunek 1A). Należy zachować ostrożność, aby uniknąć aktywacji immunologicznej prekursorów osteoklastów. Po aktywacji prekursory rozprzestrzeniają się i stają się spłaszczone z pienistą cytoplazmą (Rysunek 1B). Komórki te, przypominające „smażon...

Dyskusja

Krytyczne kroki w ramach protokołu

Hodowla i różnicowanie prekursorów osteoklastów in vitro stanowi użyteczną platformę do badania molekularnych mechanizmów osteoklastogenezy i identyfikacji celów terapeutycznych dla regeneracji kości i zachowania masy kostnej. Podczas hodowli prekursorów osteoklastów myszy najważniejszym elementem jest utrzymanie prekursorów w stanie naiwnym. Jako komórki podobne do makrofagów, prekursory osteoklastów są przygotowane do reagowania na składniki bakteryjn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rekombinowana mysz M-CSF	Biolegend	576402	Dostępne od wielu dostawców, aktywność testowa przed eksperymentami
Rekombinowana mysz RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Dostępne od wielu dostawców, aktywność testowa przed eksperymentami
Rekombinowany ludzki Jagged1-Fc	R& D Systems	1277-JG-050	Dostępne od wielu dostawców, aktywność testowa przed eksperymentami
Białko G Kulki agarozowe	InvivoGen	gel-agg-2
Koza anty-ludzka IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Niezbędne podłoże w proszku	Sigma-Aldrich	M0894
Odczynnik do dysocjacji komórek Accutase	ThermoFisher	A1110501	Służy do podnoszenia prekursorów osteoklastów
Fosfataza kwasowa, leukocyty (TRAP) Zestaw	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Służy do barwienia zróżnicowanych osteoklastów