Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

Podsumowanie

Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy temperaturę(y) przemiany termicznej i całkowitą energię cieplną potrzebną do denaturacji białka. Uzyskane wyniki służą do oceny stabilności termicznej antygenów białkowych w formulacjach szczepionek.

Streszczenie

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to technika analityczna, która mierzy molową pojemność cieplną próbek w funkcji temperatury. W przypadku próbek białek profile DSC dostarczają informacji o stabilności termicznej i do pewnego stopnia służą jako strukturalny "odcisk palca", który można wykorzystać do oceny konformacji strukturalnej. Wykonuje się go za pomocą różnicowego kalorymetru skaningowego, który mierzy temperaturę przemiany termicznej (temperatura topnienia; T_m) oraz energia potrzebna do zakłócenia oddziaływań stabilizujących trzeciorzędową strukturę (entalpię; ∆H) białek. Dokonuje się porównań między preparatami, a także partiami produkcyjnymi, a różnice w uzyskanych wartościach wskazują na różnice w stabilności termicznej i konformacji strukturalnej. Jako dowód skuteczności tego protokołu przedstawiono dane ilustrujące zastosowanie DSC w warunkach przemysłowych do badań stabilności, a także monitorowania kluczowych etapów produkcji. W porównaniu z innymi metodami oceny stabilności termicznej konformacji białek, DSC jest opłacalna, wymaga kilku etapów przygotowania próbki, a także zapewnia pełny profil termodynamiczny procesu rozwijania białka.

Wprowadzenie

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to eksperymentalna metoda, która bezpośrednio mierzy różnicę w poborze energii cieplnej w próbce w stosunku do odniesienia podczas regulowanej zmiany temperatury ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12}. Metoda ta, przeprowadzana w różnicowym kalorymetrze skaningowym, polega na jednoczesnym wprowadzeniu energii cieplnej do celi próbki i komórki referencyjnej, przy jednoczesnym identycznym zwiększaniu temperatury obu komórek w czasie ^{2, 13, 14}. Ze względu na różnice w składzie próbki i odniesienia, do podniesienia temperatury komórek wymagana będzie różna ilość energii ^{2, 12, 13}. W ten sposób mierzona jest nadwyżka energii potrzebnej do skompensowania różnicy temperatur między ogniwami i bezpośrednio korelowana z określonymi właściwościami termodynamicznymi próbki ^{1, 3}.

W latach sześćdziesiątych M.J. O'Neil i E. Watson z Perkin Elmer opracowali pierwszy różnicowy kalorymetr skaningowy do pomiaru przepływu ciepła w materiałach stałych ^{2, 3, 4}. Równolegle P.L. Priwałow i D.R. Monaseldze E.L. z Instytutu Fizyki Republiki Gruzji (byłego ZSRR) stworzyli unikalny różnicowy kalorymetr adiabatyczny, który może być używany do badań biochemicznych ^{5, 6}. Następnie zespół Andronikashvili z Instytutu Fizyki w Republice Gruzji przedstawił pojemność cieplną biomolekuł, takich jak białka włókniste i globularne, DNA i RNA, używając DSC ^{7, 8, 9}. Kilka zespołów prowadzonych przez Sturtevanta ^{10, 11, 12}, Brandts ¹³ i Privalov ^{14, 15, 16}skupiło się na rozwoju teorii i praktycznych zastosowań DSC do badania termodynamicznych szczegółów rozwijania białek. Wartość DSC w badaniu dużych struktur supramolekularnych, takich jak fagi, chloroplasty, ciekłe kryształy fosfolipidów i białka mięsne została również zgłoszona ^{17, 18, 19, 20}.

DSC stało się teraz powszechne w badaniach i rozwoju farmaceutyków do oceny stabilności termicznej biomolekuł, zwłaszcza białek ^{1, 21, 22}. Wynika to głównie z postępów w zakresie czułości i automatyzacji oprzyrządowania użytego do przeprowadzenia eksperymentu ^{23, 24}. W tym przypadku końcowy wynik eksperymentu DSC, a mianowicie molowa pojemność cieplna w funkcji temperatury, jest używany do oszacowania następujących parametrów termodynamicznych (zmiana pojemności cieplnej (∆Cp), entalpia (∆H), entropia (∆S) i energia swobodna Gibbsa (∆G)) za pomocą poniższego równania:

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Gdzie mierzy się pojemność cieplną Cp; q to przepływ ciepła do badanego materiału; T₀ i T to odpowiednio początkowa i końcowa temperatura przejścia ^{22, 25}. Warto również zauważyć, że powyższe równania odnoszą się do białek jednodomenowych, które mogą ulegać dwustanowemu przejściu i odwracalnemu rozwijaniu termicznemu ²². Analiza bardziej złożonych białek (np. białek niedwustanowych i oligomerów) została opisana przez Friere et al. ²⁶; Johnson et al. ²⁷; oraz Kasimova i wsp. ²⁸.

Aby określić, czy białko przechodzi dwustanowe przejście, czy tworzy produkty pośrednie podczas denaturacji termicznej, eksperymentalnie uzyskana entalpia (ΔH; określana również jako entalpia kalorymetryczna ΔH_Cal) jest porównywana z entalpią wyznaczoną za pomocą równania van't Hoffa podanego poniżej (określanego również jako entalpia van't Hoff; ΔH_VH):

(6)

Gdzie T_m jest temperaturą punktu środkowego przejścia, R jest idealną stałą gazową (1,987 cal ^{mol-1 K-1}), a Y jest ułamkiem populacji białka w stanie rozwiniętym ^{16, 29}. Jeżeli ΔH_VH jest równe ΔH_Cal; lub ΔH_VH/ΔH_Cal jest równe 1, wówczas białko przechodzi przejście "wszystko albo nic" (tj. przejście dwustanowe) ^{16, 25, 29}. Jeśli jednak ΔH_VH jest mniejsze niż ΔH_Cal; lub ΔH_VH/ΔH_Cal jest mniejsze niż 1, białko przechodzi przejście niedwustanowe ^{16, 25, 29}. Stosunek ΔH_VH/ΔH_Cal odpowiada również proporcji struktury białka, która topi się jako termodynamiczna jednostka kooperacyjna lub domena ²⁶.

Parametry termodynamiczne wymienione powyżej, takie jak ΔG i ΔH, dostarczają użytecznych informacji na temat stabilności termicznej białek, w tym biologicznych ³⁰. W niniejszej publikacji zostanie jednak położony nacisk na T_m i ΔH, ponieważ są to wartości podane dla tego protokołu. T_m jest temperaturą punktu środkowego przejścia, w której stany sfałdowania i rozłożenia białka są w równowadze (tj. ΔG = 0) ^{25, 31}. Im wyższa T_m białka, tym wyższa jego stabilność termiczna ³¹. ΔH odpowiada obszarowi pod szczytem (pikami) wykresu pojemności cieplnej w funkcji temperatury (znanego również jako termogram) wygenerowanego na końcu eksperymentu DSC ^{16, 25}. Jest to energia potrzebna do denaturacji białek i może być wykorzystana do oszacowania frakcji aktywnej (Fa₎ w preparacie białkowym (tj. proporcji białek o aktywnej konformacji w próbce) za pomocą następującego równania:

(7)

Gdzie ΔH jest eksperymentalnie uzyskaną entalpią próbki białka, a Q jest entalpią wyznaczoną dla dobrze scharakteryzowanego referencyjnego lub standaryzowanego białka ²². Oszacowanie F_a jest istotne dla monitorowania stabilności produktów w czasie rzeczywistym, a także dla przeprowadzania badań stabilności w warunkach naprężeń, zgodnie z wytycznymi ICH ³². Porównanie ΔH dostarcza również informacji na temat zwartości trzeciorzędowej konformacji struktury białka ³¹.

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę oceny stabilności termicznej białek w warunkach przemysłowych i był szeroko stosowany do formułowania szczepionek. Został on opracowany przy użyciu zautomatyzowanego różnicowego kalorymetru skaningowego, który generuje powtarzalne wyniki dla stężeń białek już od 300 μg/ml.

Protokół

1. Uruchomienie instrumentu

1. Włączyć różnicowy kalorymetr skaningowy i zwiększyć ciśnienie w komórkach, aby stłumić wrzenie próbek, a także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w podwyższonych temperaturach. Zazwyczaj osiąga się to poprzez dostarczanie azotu do systemu.
2. W zależności od materiału, z którego wykonane jest ogniwo (np. tantal, złoto, platyna itp.), należy dostosować ciśnienie dopływu azotu zgodnie z ciśnieniem zalecanym przez producenta, aby uniknąć uszkodzenia ogniwa. Na przykład ustaw ciśnienie dopływu azotu gazowego na 45 psi dla instrumentu używanego do opracowania tej procedury, a ciśnienie powyżej 80 psi może uszkodzić komórkę.
3. Upewnij się, że wszystkie zbiorniki środka czyszczącego są napełnione do wymaganej objętości. Wymagane środki czyszczące obejmują detergent i wodę do mycia i czyszczenia celi odpowiednio po każdym przebiegu próbki.
4. Ustawić temperaturę w komorze na próbkę na odpowiednią wartość, najlepiej 5 °C, aby zachować integralność próbki przed eksperymentem.

2. Przygotowanie próbki

1. Dializuj próbkę względem buforu, który będzie używany jako odniesienie w eksperymencie. Alternatywnie można zastosować bufor elucyjny zebrany na końcowym etapie oczyszczania białka (tj. elucji kolumnowej).
2. Określić stężenie próbki białka przy użyciu najbardziej odpowiedniej metody oznaczania stężenia białka, takiej jak metoda Kjedahla ³³ lub metoda Lowry'ego ³⁴. W celu obiektywnego porównania wyników należy stosować tę samą metodę konsekwentnie w ramach tego samego badania. Wymagany zakres stężeń może się różnić w zależności od modelu przyrządu. Dla przyrządu używanego w tym protokole preferowany zakres roboczy wynosi 0,5 – 1 mg/ml.
3. Odgazuj próbkę i bufor referencyjny w próżni, aby pozbyć się mikropęcherzyków, które mogą powodować nieścisłość objętości. Ten krok można pominąć w przypadku nowszych modeli kalorymetrów.
4. Za pomocą mikropipety i sterylnych końcówek w komorze hermetycznej z przepływem laminarnym załaduj próbki i ich odpowiedni bufor parami do 96-dołkowych płytek kompatybilnych z urządzeniem. Napełnij pierwsze dwie pary studni buforem, a ostatnie dwie pary wodą odpowiednio dla bufora-bufora i skanowania wody. Skanowanie bufora i bufora weryfikuje przydatność przyrządu przed pomiarem próbki (tj. oceną błędu oprzyrządowania), a także ustala poziom bazowy; podczas gdy skany wody są uruchamiane w celu oczyszczenia komórek.
5. Przykryj 96-dołkową płytkę folią uszczelniającą i upewnij się, że studzienki są odpowiednio uszczelnione przed wyjęciem płytki z szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.
6. Umieścić płytkę w komorze na próbkę we właściwej orientacji.

3. Eksperymentalna konfiguracja parametrów

Uwaga: W zależności od oprzyrządowania, próbki mogą być ładowane do komórki albo ręcznie za pomocą strzykawki, albo automatycznie za pomocą automatycznego podajnika próbek. W tym przypadku (tj. w warunkach przemysłowych) stosuje się automatyczny podajnik próbek w celu zaoszczędzenia czasu.

1. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, wprowadzić informacje o próbce w kolejności, w jakiej tabliczka została załadowana, zgodnie z sekcją 2.4. Wprowadzić stężenia, jeśli są dostępne, w przeciwnym razie należy wprowadzić wartości stężeń do oprogramowania analitycznego przed analizą danych (sekcja 4.2).
2. Wybierz opcję, która zapewnia czyszczenie komórek detergentem przed każdym skanowaniem próbki, po którym należy wykonać wiele etapów płukania wodą, aby upewnić się, że w komórkach nie pozostały żadne pozostałości detergentu.
3. Ustawić temperaturę początkową eksperymentu na 20 °C, ale może się ona różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce. W przypadku znanych białek można zastosować z góry określoną temperaturę początkową, podczas gdy niższą temperaturę początkową można zastosować do nieznanych próbek.
4. Ustaw ostateczną temperaturę eksperymentu, np. 100 °C. Temperatura końcowa może się różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce.
5. Ustaw szybkość skanowania eksperymentu, np. 60 °C/h, która jest typową szybkością skanowania. Jednak szybkość skanowania może się różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce, np. 90 °C/h lub 120 °C/h. Zaleca się skanowanie nieznanych próbek z różnymi szybkościami skanowania, aby ocenić kinetykę rozwijania.
6. Ponownie zeskanuj próbki, aby zbadać odwracalność rozwijania termicznego. Rozwijanie białka uważa się za odwracalne, jeśli entalpia uzyskana dla drugiego skanowania wynosi co najmniej 80% wartości entalpii dla pierwszego skanowania.
7. Ustawić termostat po eksperymencie na 10 °C, aby zachować integralność komórek kalorymetru.
8. Przed jego wykonaniem sprawdź, czy parametry konfiguracji eksperymentu są poprawne. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, rozpocznij eksperyment.

4. Analiza danych

1. Pobierz surowe dane z eksperymentu i wybierz jedną próbkę na raz do analizy. Odejmij skanowanie referencyjne, tj. bufor, od próbki scan.
   UWAGA: Odejmowanie referencji jest wykonywane automatycznie przez nowsze modele instrumentów DSC.
2. Wpisać wartość stężenia próbki, jeżeli została pominięta zgodnie z ppkt 3.1.
3. Dopasuj i odejmij linię bazową od uzyskanego termogramu, aby uwzględnić różnice w pojemnościach cieplnych stanów pofałdowania i rozłożenia białka, które są spowodowane wystawieniem grup hydrofobowych na działanie wody podczas rozkładania. Dopasowanie krzywej liniowej lub sześciennej może być stosowane w zależności od kształtu profilu DSC dla próbki. W celu zapewnienia spójności, ten sam typ okucia musi być używany podczas badania, np. badania stabilności w czasie rzeczywistym. Ten krok jest wymagany do przetworzenia krzywej całkowania piku w celu uzyskania entalpii przejścia.
4. Wykonaj całkowanie szczytowe przy użyciu nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Opierając się na wiedzy o produkcie, zastosuj model dwustanowy lub niedwustanowy. Model dwustanowy może być stosowany do pojedynczych kooperacyjnych przemian termicznych, a w przypadku nieznanych białek należy stosować model niedwustanowy, dopóki nie będzie dostępna dalsza wiedza o produkcie. W razie potrzeby dostosuj dopasowanie krzywej za pomocą iteracyjnej funkcji dopasowywania krzywej w oprogramowaniu urządzenia, aż wartość chi-kwadrat pozostanie stała.
5. Uzyskane wyniki pokażą wartości punktu środkowego temperatur przejścia (Tm), entalpii kalorymetrycznej (ΔH) i entalpii van t Hoffa (ΔH_VH) próbki.

Wyniki

Surowe dane z większości eksperymentów DSC są prezentowane jako wykres strumienia ciepła w funkcji temperatury, ponieważ kalorymetr faktycznie mierzy różnicę w szybkości przepływu ciepła do roztworu próbki i bufora ³⁵. W związku z tym, jeśli obie komórki (tj. próbka i komórka odniesienia) zawierają identyczne roztwory podczas eksperymentu, surowe dane ze skanu powinny być płaską linią bez obserwowalnych pików. Każdy zaobserwowany pik można przypisać błędowi oprzyrządowania (np. uszkodzonym lub zanieczyszczonym ogniwom), dlatego przeprowadzenie skanowania przed analizą próbki jest odpowiednim testem przydatności systemu. Rysunek 1 ilustruje wynik typowego skanowania bufora, który wskazuje, że kalorymetr był w dobrym stanie roboczym przed analizą próbki.

Rysunek 2 pokazuje surowe dane z eksperymentu DSC przeprowadzonego na różnych partiach dwóch próbek białka. Jak zasugerowano wcześniej, obserwowane piki są różnicami w strumieniu ciepła próbek i ich odpowiednich. Różnice w stężeniu próbki mogą powodować zmiany pojemności cieplnej rejestrowanej przez kalorymetr; Różnice te są jednak normalizowane podczas analizy próbki zgodnie z sekcją 4.2 procedury. Wyższe stężenia mogą również ujawniać dodatkowe domeny termodynamiczne, które nie przyczyniają się do przejścia przy niższych stężeniach. Ponadto każde przejście reprezentuje domenę termodynamiczną, która może zawierać jedną lub więcej domen strukturalnych białka ³⁶. W tym przypadku białko 1 ma trzy domeny strukturalne, które topią się wspólnie.

Rysunek 3 pokazuje wyniki uzyskane z analizy surowych danych dla białka 1 i 2 przedstawionych na rysunku 2, tj. po odjęciu linii bazowej i iteracyjnym dopasowaniu krzywej. Uzyskane termogramy zostały znormalizowane pod kątem szybkości skanowania (automatycznie przeprowadzanego przez wstępnie ustawiony algorytm w oprogramowaniu analitycznym) i stężenia; Prezentując w ten sposób wyniki eksperymentu na porównywalnych wykresach pojemności cieplnej w funkcji temperatury. Oprogramowanie analityczne wykorzystuje dane z wykresów pojemności cieplnej w funkcji temperatury, takich jak T_m i ΔCp, do wyprowadzenia innych parametrów termodynamicznych przy użyciu odmian równań podanych powyżej w zależności od kooperatywności rozwijania się białka.

Podczas testowania nieznanych próbek, ustawienie odpowiedniego zakresu temperatur jest kluczowe. W przeciwnym razie mogą wystąpić niekompletne termogramy, jak pokazano na rysunku 4. Chociaż z takich profili można wyprowadzić T_m, nie można dokładnie określić ΔH. Dlatego próbka musi zostać ponownie przetestowana w większym zakresie temperatur, aby całkowicie uchwycić przemianę termiczną. Niektóre białka łatwo tworzą również agregaty po całkowitej denaturacji, co skutkuje zwiększeniem pojemności cieplnej po przejściu: często pojawia się to jako niekompletny termogram, jak pokazano na rysunku 2B. Jednak ponowne badanie z wyższą temperaturą końcową może pomóc w potwierdzeniu, czy w tym obszarze termogramu występuje przemiana konformacyjna, czy też jest to jedynie efekt pochłaniania ciepła przez agregaty białkowe.

Stabilność termiczna jest jedną z najważniejszych właściwości fizycznych białek i produktów na bazie białka w branży ³⁷. W przemyśle farmaceutycznym służy do określania stabilności leków biologicznych w różnych warunkach, w tym preparatu i czynników środowiskowych, takich jak wilgotność i temperatura. Służy również do monitorowania kluczowych etapów produkcji (np. oczyszczania i detoksykacji) w celu zapewnienia spójności konformacyjnej między partiami produkcyjnymi. Rysunki 5 i 6 ilustrują zastosowanie DSC do zbadania wpływu detoksykacji chemicznej i warunków przechowywania odpowiednio na stabilność i konformację strukturalną dwóch różnych białek. Istotne różnice w Tm i ∆H wskazują odpowiednio na zmiany konformacyjne i degradację białek. Ponadto, utrata trzeciego przejścia na rysunku 6 dodatkowo ilustruje degradację domeny, która została potwierdzona spadkiem masy cząsteczkowej, gdy próbki były analizowane przy użyciu chromatografii wykluczającej wielkość z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) (dane nie pokazane).

Rysunek 1: Skanowanie bufora. Podobieństwo gradientu każdego skanu bez obserwowalnych pików wskazuje, że instrument jest w dobrym stanie technicznym i generuje powtarzalne wyniki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Nieprzetworzone dane zebrane z eksperymentów DSC. Wykresy te są dobrymi reprezentacjami nieanalizowanych (surowych) danych uzyskanych po przebiegach eksperymentalnych (tj. przed odejmowaniem linii bazowej i dopasowaniem krzywej). Każda linia reprezentuje partię produkcyjną. Białko 2 ma tendencję do łatwiejszej agregacji po podgrzaniu, co powoduje wzrost pojemności cieplnej powyżej 100 °C w obszarze po przejściu termogramu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przeanalizowane dane DSC. Wykresy te są dobrymi reprezentacjami analizowanych danych DSC (tj. po odjęciu linii bazowej i dopasowaniu krzywej). Niebieska linia reprezentuje termogram po odjęciu linii bazowej, podczas gdy czerwona linia reprezentuje krzywą z najlepszym dopasowaniem do termogramu. (A) T_m i ΔH dla próbki białka 1 # 12 wynoszą odpowiednio 80,16 °C i 1,69 x 10⁶ cal/mol. (B) T_m i ΔH dla próbki białka 1 # 13 wynoszą odpowiednio 80,15 °C i 1,71 x 10⁶ cal/mol. (C) T_m i ΔH dla próbki białka 2 # 21 wynoszą odpowiednio 75,01 °C i 4,08 x 10⁶ cal/mol. (D) T_m i ΔH dla próbki białka 2 # 22 wynoszą odpowiednio 75,67 °C i 4,22 x 10⁶ cal/mol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Niekompletny termogram. Surowe dane zebrane dla białka 1 analizowane w nieodpowiednim zakresie temperatur. Ostateczna temperatura eksperymentu została ustawiona na 90 °C, co nie uwzględniało całego profilu przejścia białka w porównaniu z eksperymentem dla rysunku 2A, który został ustawiony na 120 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Przeanalizowano dane pokazujące wpływ detoksykacji chemicznej na trzeciorzędową strukturę białka 1. (A) Białko 1 jest toksyną w swojej naturalnej budowie i ma swoje T_m w temperaturze 56,84 °C i ΔH w temperaturze 2,57 x 10⁵ cal/mol. (B) Odtruta forma białka 1 (tj. toksoid) ma wartości T_m i ΔH wynoszące odpowiednio 81,01 °C i 1,89 x 10⁶ cal/mol. Tak więc można wywnioskować, że etap detoksykacji wprowadził pewną formę zmienności do strukturalnej konformacji białka 1, która nadaje większą stabilność (wyższy T_m) jego detoksykowanej formie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Przeanalizowano dane pokazujące wpływ warunków przechowywania na konformację białka 3. Wykresy te ilustrują wpływ temperatury przechowywania (2 - 8 °C) na stabilność i trzeciorzędową strukturę białka 3 przez 30 tygodni. Wartości T_m i ΔH dla białka 3 w 8. (A) i 38^{. (}B) tygodniu przechowywania podano w tabeli 1 poniżej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

próbka Tm 1 (°C) ∆H 1 (cal/mol) Tm 2 (°C) ∆H 2 (cal/mol) Tm 3 (°C) ∆H 3 (cal/mol) Białko 3 przechowywane w temperaturze 2-8 °C przez 8 tygodni 61,91 pkt. 1,71 x 10⁵ 75,54 pkt. 2,17 x 10⁵ 90,29 pkt. 4,17 x 10⁵ Białko 3 przechowywane w temperaturze 2-8 °C przez 38 tygodni 61,87 pkt. 1,66 x 10⁵ 75,18 pkt. 1,46 x 10⁵ Nr 90,22 pkt. 5,76 x 10⁵

Tabela 1: Wartości Tm i ΔH dla białka 3 w 8ⁱ 38 tygodniu przechowywania w temperaturze 2 - 8 °C. Chociaż wartości T_m w obu punktach czasowych są podobne, różnica w wartościach ΔH wskazuje, że trzeciorzędowa struktura białka 3 uległa degradacji w ciągu 30 tygodni w określonych warunkach przechowywania.

Dyskusja

Procedura ta została z powodzeniem włączona do różnych pakietów badań charakterystyki, w tym do badań stabilności i porównywalności produktów ²¹. W badaniach stabilności w czasie rzeczywistym DSC jest używany do_{monitorowania TM,} a także do szacowania F_a leków biologicznych w czasie w celu określenia ich okresu trwałości. Jeśli chodzi o porównywalność produktów, służy ona do oceny wpływu zmian w procesie i zakładzie, a także wpływu kluczowych etapów produkcji na konformację strukturalną produkowanych partii. Zazwyczaj wiąże się to z bezpośrednim porównaniem ΔH wyprodukowanej partii ze środkiem referencyjnym, który został wyznaczony jako produkt idealny. Ponadto DSC okazał się użytecznym narzędziem analitycznym do badań nad formułowaniem produktów ³⁷. T_m białka w różnych i w różnych stężeniach można wykorzystać do określenia preparatu, który zapewnia największą stabilność białka.

Aby zapewnić wiarygodność tej metody i obiektywność jej wyników, ważne jest, aby parametry testowania były spójne z cyklu na etap w ramach tego samego badania (np. badania nad formułą szczepionki). Jednak procedura może być modyfikowana w celu uwzględnienia różnic we właściwościach fizycznych różnych białek. Przykładem modyfikacji, którą można wprowadzić, jest zmiana szybkości skanowania eksperymentu ^{38, 39}. Białka, które miały skłonność do tworzenia agregatów po podgrzaniu, badano z większą szybkością skanowania (np . 120 °C/h), aby uniknąć udziału agregatów w profilu przemiany termicznej, a także zatkania kapilar kalorymetru. Warto zauważyć, że szybkość skanowania może mieć wpływ na wynik eksperymentu ^{DSC 38}. Zaobserwowano poszerzenie piku przejścia termicznego wraz ze wzrostem szybkości skanowania w niektórych białkach; jednak T_m pozostało dość stałe ³⁸. Co więcej, etapy dializy i odgazowywania w celu przygotowania próbki są również bardzo ważne dla uzyskania dokładnych wyników ³¹. Dializa zapewnia, że jedyną różnicą w składzie próbki i buforu jest białko; W ten sposób cały nadmiar ciepła pochłoniętego przez próbkę można przypisać pojemności cieplnej białka. Odgazowanie zapewnia precyzyjną analizę objętościową, ponieważ ekstrapolacja parametru termodynamicznego zakłada, że zdarzenie rozwijające się zachodzi przy stałej objętości i ciśnieniu ³¹. Część założenia dotyczącą stałego ciśnienia jest uwzględniana przez zwiększenie ciśnienia azotu w układzie, zgodnie z sekcją 1.1 procedury.

W porównaniu z innymi metodami określania stabilności konformacji białek, takimi jak dichroizm kołowy (CD) i spektroskopia fluorescencyjna, DSC oferuje szereg korzyści w warunkach komercyjnych, w tym oszczędność kosztów i czasu. Po pierwsze, adiabatyczna konstrukcja różnicowego kalorymetru skaningowego pozwala na pomiar stabilności termicznej z lepszą precyzją temperatury w porównaniu z pomiarami za pomocą oprzyrządowania do spektroskopii CD i fluorescencji ⁶. Po drugie, w przeciwieństwie do CD, dokładność danych DSC nie zależy od heliczności białka ^{39, 40}; jednak płyta CD dostarcza dodatkowych informacji na temat rozwoju struktury drugorzędowej, która byłaby uzupełnieniem DSC ⁴¹. Dodatkowo, zwiększenie ciśnienia w systemie DSC pozwala na testowanie w szerokim zakresie temperatur bez gotowania próbki; w ten sposób DSC może testować szeroką gamę białek.

Chociaż DSC jest stosunkowo szybkim i prostym podejściem do określania stabilności termicznej leków biologicznych, nie jest pozbawione ograniczeń. Po pierwsze, etap odejmowania linii bazowej wprowadza pewną formę ludzkiej niespójności do analizy surowych danych; W związku z tym można zaobserwować różnice w wynikach wśród różnych użytkowników. Po drugie, różnicowe kalorymetry skaningowe mają minimalne limity stężenia, które mogą być trudne do osiągnięcia na masową skalę produkcyjną. Po trzecie, ΔH nieodwracalnej denaturacji termicznej nie jest bezwzględna; co oznacza, że pochodny ΔG (wskaźnik stabilności białka) w podobnych scenariuszach może być mylący. Ponadto metoda ta najlepiej sprawdza się w przypadku próbek oczyszczonych. Obecność zanieczyszczeń może powodować przesunięcie T_m w przypadku interakcji z badanym białkiem lub pojawienie się nowych przemian termicznych w przypadku braku interakcji. W każdym razie te dodatkowe cechy termogramów mogą być błędnie przypisane próbkom, wpływając w ten sposób na interpretację wyników. Pomimo tych ograniczeń, DSC pozostaje niezawodną metodą, która może dostarczyć szczegółowych informacji termodynamicznych na temat procesu rozwijania białek, jeśli zostanie prawidłowo zaimplementowana ⁴².

Podsumowując, DSC oferuje znaczną przewagę jako narzędzie konformacyjnego odczytu produktów szczepionkowych i ich półproduktów. Dwa parametry_{, TM i} ΔH, zebrane dla szeregu partii tego samego produktu mogą stać się empirycznym punktem odniesienia, który można wykorzystać do zbadania wpływu zmian w procesie, formułowania i warunków przechowywania na trzeciorzędową strukturę i stabilność antygenów białkowych i wirusowych ^{21, 43}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Różnicowy kalorymetr skaningowy	Malvern Instruments Ltd	28428948 (za pośrednictwem GE Healthcare)	Posiada automatyczny podajnik próbek do automatycznego dozowania próbek do celi w celu zmniejszenia wysiłku ludzkiego i błędów.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Rozcieńczyć wodą do 20% przed użyciem
500 &mikro; L Polipropylenowa płytka 96-dołkowa z okrągłym dnem	Kanadyjskie	ML072100	również stosować równoważne płytki od innych dostawców (np. , VW)
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	wyposażony w szafę bezpieczeństwa biologicznego Cap VP DSC
	Labconco	Logic+ - Szafa	z przepływem laminarnym A2 do przygotowania próbki
Kaseta dializacyjna Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66810 lub 66380	do równoważenia próbki i buforu