Artykuł metodologiczny

Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

40.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55262

⸱

4 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Analytical Research & Development, Sanofi Pasteur Limited

W tym artykule

Podsumowanie

Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy temperaturę(y) przemiany termicznej i całkowitą energię cieplną potrzebną do denaturacji białka. Uzyskane wyniki służą do oceny stabilności termicznej antygenów białkowych w formulacjach szczepionek.

Streszczenie

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to technika analityczna, która mierzy molową pojemność cieplną próbek w funkcji temperatury. W przypadku próbek białek profile DSC dostarczają informacji o stabilności termicznej i do pewnego stopnia służą jako strukturalny "odcisk palca", który można wykorzystać do oceny konformacji strukturalnej. Wykonuje się go za pomocą różnicowego kalorymetru skaningowego, który mierzy temperaturę przemiany termicznej (temperatura topnienia; Tm) oraz energia potrzebna do zakłócenia oddziaływań stabilizujących trzeciorzędową strukturę (entalpię; ∆H) białek. Dokonuje się porównań między preparatami, a także partiami produkcyjnymi, a różnice w uzyskanych wartościach wskazują na różnice w stabilności termicznej i konformacji strukturalnej. Jako dowód skuteczności tego protokołu przedstawiono dane ilustrujące zastosowanie DSC w warunkach przemysłowych do badań stabilności, a także monitorowania kluczowych etapów produkcji. W porównaniu z innymi metodami oceny stabilności termicznej konformacji białek, DSC jest opłacalna, wymaga kilku etapów przygotowania próbki, a także zapewnia pełny profil termodynamiczny procesu rozwijania białka.

Wprowadzenie

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) jest metodą eksperymentalną, która bezpośrednio mierzy różnicę w poborze energii cieplnej zachodzącą w próbce w stosunku do referencji podczas regulowanej zmiany temperatury 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Metoda ta, przeprowadzana w różnicowym kalorymetrze skaningowym, polega na jednoczesnym wprowadzaniu energii cieplnej do komórki z próbką i komórki referencyjnej, przy jednoczesnym identycznym zwiększaniu temperatury obu komórek w czasie 2, 13, 14. Ze względu na różnice w składzie próbki i referencji, do podniesienia temperatury komórek wymagana będzie różna ilość energii 2, 12, 13. W związku z tym mierzona jest nadmiarowa ilość energii potrzebna do zrekompensowania różnicy temperatur między komórkami, co jest bezpośrednio skorelowane ze specyficznymi właściwościami termodynamicznymi próbki 1, 3.

W latach 60. XX wieku M.J. O'Neil i E. Watson z firmy Perkin Elmer opracowali pierwszy różnicowy kalorymetr skaningowy do pomiaru przepływu ciepła w materiałach stałych 2, 3, 4. Równolegle P.L. Privalov i D.R. Monaseldze E.L. z Instytutu Fizyki w Republice Gruzji (dawne ZSRR) stworzyli unikalny różnicowy kalorymetr adiabatyczny, który może być wykorzystywany w badaniach biochemicznych 5, 6. Następnie zespół Andronikashviliego w Instytucie Fizyki w Republice Gruzji określił za pomocą DSC pojemność cieplną biomolekuł, takich jak białka włókniste i globularne, DNA oraz RNA 7, 8, 9. Kilka zespołów pod kierownictwem Sturtevanta 10, 11, 12, Brandtsa 13 i Privalova 14, 15, 16 skupiło się na rozwoju teorii i praktycznych zastosowaniach DSC do badania szczegółów termodynamicznych rozwijania białek. Doniesiono również o wartości DSC w badaniu dużych struktur supramolekularnych, takich jak fagi, chloroplasty, ciekłe kryształy fosfolipidowe oraz białka mięsne 17, 18, 19, 20.

Metoda DSC stała się obecnie powszechna w badaniach i rozwoju farmaceutycznym do oceny stabilności termicznej biomolekuł, zwłaszcza białek 1, 21, 22. Jest to głównie zasługa postępów w zakresie czułości i automatyzacji aparatury wykorzystywanej do przeprowadzania eksperymentu 23, 24. W tym przypadku końcowy wynik eksperymentu DSC, mianowicie molowa ciepło właściwe jako funkcja temperatury, jest wykorzystywany do oszacowania  następujących parametrów termodynamicznych (zmiany ciepła właściwego (∆Cp), entalpii (∆H), entropii (∆S) oraz energii swobodnej Gibbsa (∆G)) przy użyciu poniższego równania:

figure-introduction-1   (1)

figure-introduction-2   (2)

figure-introduction-3   (3)

figure-introduction-4   (4)

figure-introduction-5   (5)

Gdzie Cp to zmierzona pojemność cieplna; q to strumień ciepła przekazywany do badanego materiału; T0 i T to odpowiednio temperatura początkowa i końcowa przejścia 22, 25. Warto również zauważyć, że powyższe równania mają zastosowanie do białek jednodomenowych, które mogą ulegać przejścia dwustanowemu i odwracalnemu rozfałdowaniu termicznemu 22. Analizy bardziej złożonych białek (np. białek nie dwustanowych oraz oligomerów) zostały przedstawione przez Friere et al. 26; Johnson et al. 27; oraz Kasimova et al. 28.

Aby ustalić, czy białko przechodzi przejście dwustanowe czy tworzy produkty pośrednie podczas denaturacji termicznej, eksperymentalnie wyznaczoną entalpię (ΔH; nazywaną również entalpią kalorymetryczną ΔHCal) porównuje się z entalpią wyznaczoną za pomocą poniższego równania van't Hoffa (nazywaną również entalpią van't Hoffa; ΔHVH):

figure-introduction-6   (6)

Gdzie Tm to temperatura połowy przejścia, R to uniwersalna stała gazowa (1.987 cal mol-1 K-1), a Y to ułamek populacji białka w stanie rozfałdowanym 16, 29. Jeśli ΔHVH jest równa ΔHCal; lub ΔHVH/ΔHCal jest równa 1, białko przechodzi przejście typu „wszystko albo nic” (tj. przejście dwustanowe) 16, 25, 29. Jednakże, jeśli ΔHVH jest mniejsza od ΔHCal; lub ΔHVH/ΔHCal jest mniejsza od 1, białko przechodzi przejście nie-dwustanowe 16, 25, 29. Stosunek ΔHVH/ΔHCal odpowiada również proporcji struktury białka, która ulega topnieniu jako termodynamiczna jednostka kooperacyjna lub domena 26.

Wspomniane powyżej parametry termodynamiczne, takie jak ΔG i ΔH, dostarczają cennych informacji o stabilności termicznej białek, w tym leków biologicznych 30. W niniejszej publikacji szczególną uwagę poświęcono jednak Tm oraz ΔH, ponieważ są to wartości raportowane w tym protokole. Tm to temperatura środkowa przejścia, w której białka w stanie zwiniętym i rozwiniętym znajdują się w równowadze (tj. ΔG = 0) 25, 31. Im wyższa wartość Tm białka, tym większa jest jego stabilność termiczna 31. ΔH odpowiada polu pod pikiem (pikami) na wykresie pojemności cieplnej w funkcji temperatury (zwanym również termogramem), generowanym po zakończeniu eksperymentu DSC 16, 25. Jest to energia wymagana do denaturacji białek, która może być wykorzystana do oszacowania frakcji aktywnej (Fa) w formulacji białka (tj. proporcji białek o aktywnej konformacji w próbce) przy użyciu następującego równania:

figure-introduction-7   (7)

Gdzie ΔH to eksperymentalnie wyznaczona entalpia próbki białka, a Q to entalpia określona dla dobrze scharakteryzowanego białka referencyjnego lub standaryzowanego 22. Oszacowanie Fa ma istotne znaczenie dla monitorowania stabilności produktów w czasie rzeczywistym, a także dla prowadzenia badań stabilności w warunkach stresowych, zgodnie z wymogami wytycznych ICH 32. Porównanie ΔH dostarcza również informacji o zwartości konformacji struktury trzeciorzędowej białka 31.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę oceny stabilności termicznej białek w warunkach przemysłowych, która była szeroko stosowana przy opracowywaniu formulacji szczepionek. Została ona opracowana z wykorzystaniem zautomatyzowanego różnicowego kalorymetru skanującego, który pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników dla stężeń białek tak niskich jak 300 µg/mL.

Protokół

1. Uruchomienie instrumentu

  1. Włączyć różnicowy kalorymetr skaningowy i zwiększyć ciśnienie w komórkach, aby stłumić wrzenie próbek, a także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w podwyższonych temperaturach. Zazwyczaj osiąga się to poprzez dostarczanie azotu do systemu.
  2. W zależności od materiału, z którego wykonane jest ogniwo (np. tantal, złoto, platyna itp.), należy dostosować ciśnienie dopływu azotu zgodnie z ciśnieniem zalecanym przez producenta, aby uniknąć uszkodzenia ogniwa. Na przykład ustaw ciśnienie dopływu azotu gazowego na 45 psi dla instrumentu używanego do opracowania tej procedury, a ciśnienie powyżej 80 psi może uszkodzić komórkę.
  3. Upewnij się, że wszystkie zbiorniki środka czyszczącego są napełnione do wymaganej objętości. Wymagane środki czyszczące obejmują detergent i wodę do mycia i czyszczenia celi odpowiednio po każdym przebiegu próbki.
  4. Ustawić temperaturę w komorze na próbkę na odpowiednią wartość, najlepiej 5 °C, aby zachować integralność próbki przed eksperymentem.

2. Przygotowanie próbki

  1. Dializuj próbkę względem buforu, który będzie używany jako odniesienie w eksperymencie. Alternatywnie można zastosować bufor elucyjny zebrany na końcowym etapie oczyszczania białka (tj. elucji kolumnowej).
  2. Określić stężenie próbki białka przy użyciu najbardziej odpowiedniej metody oznaczania stężenia białka, takiej jak metoda Kjedahla 33 lub metoda Lowry'ego 34. W celu obiektywnego porównania wyników należy stosować tę samą metodę konsekwentnie w ramach tego samego badania. Wymagany zakres stężeń może się różnić w zależności od modelu przyrządu. Dla przyrządu używanego w tym protokole preferowany zakres roboczy wynosi 0,5 – 1 mg/ml.
  3. Odgazuj próbkę i bufor referencyjny w próżni, aby pozbyć się mikropęcherzyków, które mogą powodować nieścisłość objętości. Ten krok można pominąć w przypadku nowszych modeli kalorymetrów.
  4. Za pomocą mikropipety i sterylnych końcówek w komorze hermetycznej z przepływem laminarnym załaduj próbki i ich odpowiedni bufor parami do 96-dołkowych płytek kompatybilnych z urządzeniem. Napełnij pierwsze dwie pary studni buforem, a ostatnie dwie pary wodą odpowiednio dla bufora-bufora i skanowania wody. Skanowanie bufora i bufora weryfikuje przydatność przyrządu przed pomiarem próbki (tj. oceną błędu oprzyrządowania), a także ustala poziom bazowy; podczas gdy skany wody są uruchamiane w celu oczyszczenia komórek.
  5. Przykryj 96-dołkową płytkę folią uszczelniającą i upewnij się, że studzienki są odpowiednio uszczelnione przed wyjęciem płytki z szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.
  6. Umieścić płytkę w komorze na próbkę we właściwej orientacji.

3. Eksperymentalna konfiguracja parametrów

Uwaga: W zależności od oprzyrządowania, próbki mogą być ładowane do komórki albo ręcznie za pomocą strzykawki, albo automatycznie za pomocą automatycznego podajnika próbek. W tym przypadku (tj. w warunkach przemysłowych) stosuje się automatyczny podajnik próbek w celu zaoszczędzenia czasu.

  1. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, wprowadzić informacje o próbce w kolejności, w jakiej tabliczka została załadowana, zgodnie z sekcją 2.4. Wprowadzić stężenia, jeśli są dostępne, w przeciwnym razie należy wprowadzić wartości stężeń do oprogramowania analitycznego przed analizą danych (sekcja 4.2).
  2. Wybierz opcję, która zapewnia czyszczenie komórek detergentem przed każdym skanowaniem próbki, po którym należy wykonać wiele etapów płukania wodą, aby upewnić się, że w komórkach nie pozostały żadne pozostałości detergentu.
  3. Ustawić temperaturę początkową eksperymentu na 20 °C, ale może się ona różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce. W przypadku znanych białek można zastosować z góry określoną temperaturę początkową, podczas gdy niższą temperaturę początkową można zastosować do nieznanych próbek.
  4. Ustaw ostateczną temperaturę eksperymentu, np. 100 °C. Temperatura końcowa może się różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce.
  5. Ustaw szybkość skanowania eksperymentu, np. 60 °C/h, która jest typową szybkością skanowania. Jednak szybkość skanowania może się różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce, np. 90 °C/h lub 120 °C/h. Zaleca się skanowanie nieznanych próbek z różnymi szybkościami skanowania, aby ocenić kinetykę rozwijania.
  6. Ponownie zeskanuj próbki, aby zbadać odwracalność rozwijania termicznego. Rozwijanie białka uważa się za odwracalne, jeśli entalpia uzyskana dla drugiego skanowania wynosi co najmniej 80% wartości entalpii dla pierwszego skanowania.
  7. Ustawić termostat po eksperymencie na 10 °C, aby zachować integralność komórek kalorymetru.
  8. Przed jego wykonaniem sprawdź, czy parametry konfiguracji eksperymentu są poprawne. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, rozpocznij eksperyment.

4. Analiza danych

  1. Pobierz surowe dane z eksperymentu i wybierz jedną próbkę na raz do analizy. Odejmij skanowanie referencyjne, tj. bufor, od próbki scan.
    UWAGA: Odejmowanie referencji jest wykonywane automatycznie przez nowsze modele instrumentów DSC.
  2. Wpisać wartość stężenia próbki, jeżeli została pominięta zgodnie z ppkt 3.1.
  3. Dopasuj i odejmij linię bazową od uzyskanego termogramu, aby uwzględnić różnice w pojemnościach cieplnych stanów pofałdowania i rozłożenia białka, które są spowodowane wystawieniem grup hydrofobowych na działanie wody podczas rozkładania. Dopasowanie krzywej liniowej lub sześciennej może być stosowane w zależności od kształtu profilu DSC dla próbki. W celu zapewnienia spójności, ten sam typ okucia musi być używany podczas badania, np. badania stabilności w czasie rzeczywistym. Ten krok jest wymagany do przetworzenia krzywej całkowania piku w celu uzyskania entalpii przejścia.
  4. Wykonaj całkowanie szczytowe przy użyciu nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Opierając się na wiedzy o produkcie, zastosuj model dwustanowy lub niedwustanowy. Model dwustanowy może być stosowany do pojedynczych kooperacyjnych przemian termicznych, a w przypadku nieznanych białek należy stosować model niedwustanowy, dopóki nie będzie dostępna dalsza wiedza o produkcie. W razie potrzeby dostosuj dopasowanie krzywej za pomocą iteracyjnej funkcji dopasowywania krzywej w oprogramowaniu urządzenia, aż wartość chi-kwadrat pozostanie stała.
  5. Uzyskane wyniki pokażą wartości punktu środkowego temperatur przejścia (Tm), entalpii kalorymetrycznej (ΔH) i entalpii van t Hoffa (ΔHVH) próbki.

Wyniki

Surowe dane z większości eksperymentów DSC są przedstawiane w formie wykresu strumienia ciepła w funkcji temperatury, ponieważ kalorymetr mierzy w rzeczywistości różnicę w szybkości przepływu ciepła do roztworu próbki i buforu 35. W związku z tym, jeśli obie cazole (t.j. cela z próbką i cela referencyjna) zawierają identyczne roztwory podczas eksperymentu, surowe dane z pomiaru powinny tworzyć linię płaską, bez żadnych obserwowalnych pików. Każdy zaobserwowany pik można przypisać błędowi aparatury (np. uszkodzeniu lub zanieczyszczeniu cel), dlatego wykonanie pomiarów buforu przed analizą próbek stanowi odpowiedni test przydatności systemu. Rycina 1 ilustruje wynik typowego pomiaru buforu, wskazujący, że kalorymetr był w dobrym stanie technicznym przed analizą próbek.

Rysunek 2 przedstawia surowe dane z eksperymentu DSC przeprowadzonego na różnych partiach dwóch próbek białek. Jak wspomniano wcześniej, obserwowane piki są różnicami w strumieniu ciepła próbek i ich odpowiednich buforów. Różnice w stężeniu próbek mogą powodować zmienność pojemności cieplnej rejestrowanej przez kalorymetr; jednak zmienności te są normalizowane podczas analizy próbek zgodnie z sekcją 4.2 procedury. Wyższe stężenia mogą również ujawnić dodatkowe domeny termodynamiczne, które nie przyczyniają się do przejścia przy niższych stężeniach. Ponadto każde przejście reprezentuje domenę termodynamiczną, która może obejmować jedną lub więcej domen strukturalnych białka 36. W tym przypadku Protein 1 posiada trzy domeny strukturalne, które ulegają kooperatywnemu topnieniu.

Rysunek 3 przedstawia wyniki uzyskane z analizy surowych danych dla białek 1 i 2 zaprezentowanych na Rysunku 2, t.j. po odjęciu linii bazowej i iteracyjnym dopasowaniu krzywych. Uzyskane termogramy zostały znormalizowane pod kątem szybkości skanowania (wykonane automatycznie przez zaprogramowany algorytm w oprogramowaniu analitycznym) oraz stężenia; dzięki temu wyniki eksperymentu zostały przedstawione na porównywalnych wykresach zależności pojemności cieplnej od temperatury. Oprogramowanie analityczne wykorzystuje dane z wykresów zależności pojemności cieplnej od temperatury, takie jak Tm i ΔCp, do wyznaczenia innych parametrów termodynamicznych przy użyciu wariantów powyższych równań, w zależności od kooperatywności rozwijania białek.

Podczas badania nieznanych próbek kluczowe jest ustawienie odpowiedniego zakresu temperatur. W przeciwnym razie mogą powstać niepełne termogramy, co zilustrowano na Rysunku 4. Chociaż z takich profili można wyznaczyć Tm, nie jest możliwe dokładne określenie ΔH. Dlatego próbkę należy przebadać ponownie w szerszym zakresie temperatur, aby w pełni uchwycić przejście termiczne. Niektóre białka po całkowitej denaturacji łatwo tworzą agregaty, co skutkuje wzrostem pojemności cieplnej po przejściu; często objawia się to jako niepełny termogram, jak pokazano na Rysunku 2B. Ponowne badanie z wyższą temperaturą końcową może jednak pomóc potwierdzić, czy w tym obszarze termogramu występuje przejście konformacyjne, czy jest to jedynie efekt pochłaniania ciepła przez agregaty białkowe.

Stabilność termiczna jest jedną z najważniejszych właściwości fizycznych białek i produktów na ich podstawie stosowanych w przemyśle 37. W farmaceutyce wykorzystuje się ją do określania stabilności leków biologicznych w różnych warunkach, w tym w różnych buforach formulacyjnych oraz pod wpływem czynników środowiskowych, takich jak wilgotność i temperatura. Służy ona również do monitorowania kluczowych etapów produkcji (np. oczyszczania i detoksykacji), aby zapewnić spójność konformacyjną pomiędzy partiami produkcyjnymi. Rysunki 5 i 6 ilustrują zastosowanie DSC do badania wpływu odpowiednio detoksykacji chemicznej oraz warunków przechowywania na stabilność i konformację strukturalną dwóch różnych białek. Znaczące różnice w Tm i ∆H wskazują odpowiednio na zmiany konformacyjne oraz degradację białka. Ponadto zanik trzeciego przejścia na Rysunku 6 dodatkowo obrazuje degradację domeny, co zostało potwierdzone spadkiem masy cząsteczkowej podczas analizy próbek za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarów z wielokątnym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) (dane nie zostały przedstawione).

figure-results-1
Rycina 1: Skanowanie buforów. Podobieństwo gradientu każdego skanu przy braku obserwowalnych pików wskazuje, że urządzenie jest w dobrym stanie technicznym i generuje powtarzalne wyniki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Surowe dane zebrane podczas eksperymentów DSC. Wykresy te stanowią reprezentację nieanalizowanych (surowych) danych uzyskanych po seriach pomiarowych (tzn. przed odjęciem linii bazowej i dopasowaniem krzywej). Każda linia reprezentuje partię produkcyjną. Białko 2 ma tendencję do łatwiejszej agregacji podczas ogrzewania, co skutkuje wzrostem pojemności cieplnej powyżej 100 °C w obszarze potransycyjnym termogramu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przeanalizowane dane DSC. Wykresy te stanowią dobre odwzorowanie przeanalizowanych danych DSC (t.j. (po odjęciu tła i dopasowaniu krzywej). Niebieska linia przedstawia termogram po odjęciu tła, natomiast czerwona linia przedstawia krzywą najlepiej dopasowaną do termogramu. (A) Tm i ΔWartości H dla próbki nr 12 białka 1 wynoszą 80.16 °C oraz 1,69 x 106 odpowiednio cal/mol. (B) Tm i ΔWartości H dla próbki nr 13 białka 1 wynoszą 80.15 °C oraz 1,71 x 106 odpowiednio cal/mol. (C) Tm i ΔWartości H dla próbki nr 21 białka 2 wynoszą 75.01 °C oraz 4,08 x 106 odpowiednio cal/mol. (D) Tm i ΔWartości H dla białka 2, próbka nr 22, wynoszą 75.67 °C i 4,22 x 106 odpowiednio cal/mol. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-4
Rycina 4: Niepełny termogram. Surowe dane zebrane dla Białka 1 analizowanego w niewłaściwym zakresie temperatur. Końcowa temperatura eksperymentu została ustawiona na 90 °C, co nie pozwoliło na uchwycenie pełnego profilu przejścia białka w porównaniu do eksperymentu przedstawionego na Rycynie 2A, w którym temperatura została ustawiona na 120 °C. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza danych wykazująca wpływ detoksykacji chemicznej na strukturę trzeciorzędową Białka 1. (A) Białko 1 w swojej natywnej konformacji jest toksyną i charakteryzuje się wartością Tm wynoszącą 56,84 °C oraz ΔH wynoszącą 2,57 x 105 cal/mol. (B) Detoksykowana forma Białka 1 (tj. toksoid) posiada odpowiednio wartości Tm 81,01 °C oraz ΔH 1,89 x 106 cal/mol. Zatem można wywnioskować, że etap detoksykacji wprowadził pewną zmianę w konformacji strukturalnej Białka 1, która nadaje większą stabilność (wyższą Tm) jego formie detoksykowanej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Analiza danych wykazująca wpływ warunków przechowywania na konformację białka 3. Wykresy te ilustrują wpływ temperatury przechowywania (2 - 8 °C) na stabilność i strukturę trzeciorzędową Białka 3 w ciągu 30 tygodni. Tm i ΔWartości H dla białka 3 przy 8th (A) oraz 38th tydzień (B) warunki przechowywania podano w Tabela 1 Proszę podać tekst do tłumaczenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

PróbkaTm 1 (°C)∆H 1 (cal/mol)Tm 2 (°C)∆H 2 (cal/mol)Tm 3 (°C)∆H 3 (cal/mol)
Białko 3 przechowywane w temp. 2-8 °C przez 8 tygodni61.911.71 x 10575.542.17 x 10590.294.17 x 105
Białko 3 przechowywane w temp. 2-8 °C przez 38 tygodni61.871.66 x 10575.181.46 x 10590.225.76 x 105

Tabela 1: Tm i ΔWartości H dla białka 3 w 8th oraz 38th Tydzień przechowywania w temperaturze 2 - 8 °C. Chociaż Tm wartości w obu punktach czasowych są zbliżone, różnica w ΔWartości H wskazują, że struktura trzeciorzędowa białka 3 uległa degradacji w ciągu 30 tygodni w określonych warunkach przechowywania.

Dyskusja

Procedura ta została z powodzeniem włączona do różnych pakietów badań charakterystyki, w tym do badań stabilności i porównywalności produktów 21. W badaniach stabilności w czasie rzeczywistym DSC jest używany domonitorowania TM, a także do szacowania Fa leków biologicznych w czasie w celu określenia ich okresu trwałości. Jeśli chodzi o porównywalność produktów, służy ona do oceny wpływu zmian w procesie i zakładzie, a także wpływu kluczowych etapów produkcji na konformację strukturalną produkowanych partii. Zazwyczaj wiąże się to z bezpośrednim porównaniem ΔH wyprodukowanej partii ze środkiem referencyjnym, który został wyznaczony jako produkt idealny. Ponadto DSC okazał się użytecznym narzędziem analitycznym do badań nad formułowaniem produktów 37. Tm białka w różnych i w różnych stężeniach można wykorzystać do określenia preparatu, który zapewnia największą stabilność białka.

Aby zapewnić wiarygodność tej metody i obiektywność jej wyników, ważne jest, aby parametry testowania były spójne z cyklu na etap w ramach tego samego badania (np. badania nad formułą szczepionki). Jednak procedura może być modyfikowana w celu uwzględnienia różnic we właściwościach fizycznych różnych białek. Przykładem modyfikacji, którą można wprowadzić, jest zmiana szybkości skanowania eksperymentu 38, 39. Białka, które miały skłonność do tworzenia agregatów po podgrzaniu, badano z większą szybkością skanowania (np . 120 °C/h), aby uniknąć udziału agregatów w profilu przemiany termicznej, a także zatkania kapilar kalorymetru. Warto zauważyć, że szybkość skanowania może mieć wpływ na wynik eksperymentu DSC 38. Zaobserwowano poszerzenie piku przejścia termicznego wraz ze wzrostem szybkości skanowania w niektórych białkach; jednak Tm pozostało dość stałe 38. Co więcej, etapy dializy i odgazowywania w celu przygotowania próbki są również bardzo ważne dla uzyskania dokładnych wyników 31. Dializa zapewnia, że jedyną różnicą w składzie próbki i buforu jest białko; W ten sposób cały nadmiar ciepła pochłoniętego przez próbkę można przypisać pojemności cieplnej białka. Odgazowanie zapewnia precyzyjną analizę objętościową, ponieważ ekstrapolacja parametru termodynamicznego zakłada, że zdarzenie rozwijające się zachodzi przy stałej objętości i ciśnieniu 31. Część założenia dotyczącą stałego ciśnienia jest uwzględniana przez zwiększenie ciśnienia azotu w układzie, zgodnie z sekcją 1.1 procedury.

W porównaniu z innymi metodami określania stabilności konformacji białek, takimi jak dichroizm kołowy (CD) i spektroskopia fluorescencyjna, DSC oferuje szereg korzyści w warunkach komercyjnych, w tym oszczędność kosztów i czasu. Po pierwsze, adiabatyczna konstrukcja różnicowego kalorymetru skaningowego pozwala na pomiar stabilności termicznej z lepszą precyzją temperatury w porównaniu z pomiarami za pomocą oprzyrządowania do spektroskopii CD i fluorescencji 6. Po drugie, w przeciwieństwie do CD, dokładność danych DSC nie zależy od heliczności białka 39, 40; jednak płyta CD dostarcza dodatkowych informacji na temat rozwoju struktury drugorzędowej, która byłaby uzupełnieniem DSC 41. Dodatkowo, zwiększenie ciśnienia w systemie DSC pozwala na testowanie w szerokim zakresie temperatur bez gotowania próbki; w ten sposób DSC może testować szeroką gamę białek.

Chociaż DSC jest stosunkowo szybkim i prostym podejściem do określania stabilności termicznej leków biologicznych, nie jest pozbawione ograniczeń. Po pierwsze, etap odejmowania linii bazowej wprowadza pewną formę ludzkiej niespójności do analizy surowych danych; W związku z tym można zaobserwować różnice w wynikach wśród różnych użytkowników. Po drugie, różnicowe kalorymetry skaningowe mają minimalne limity stężenia, które mogą być trudne do osiągnięcia na masową skalę produkcyjną. Po trzecie, ΔH nieodwracalnej denaturacji termicznej nie jest bezwzględna; co oznacza, że pochodny ΔG (wskaźnik stabilności białka) w podobnych scenariuszach może być mylący. Ponadto metoda ta najlepiej sprawdza się w przypadku próbek oczyszczonych. Obecność zanieczyszczeń może powodować przesunięcie Tm w przypadku interakcji z badanym białkiem lub pojawienie się nowych przemian termicznych w przypadku braku interakcji. W każdym razie te dodatkowe cechy termogramów mogą być błędnie przypisane próbkom, wpływając w ten sposób na interpretację wyników. Pomimo tych ograniczeń, DSC pozostaje niezawodną metodą, która może dostarczyć szczegółowych informacji termodynamicznych na temat procesu rozwijania białek, jeśli zostanie prawidłowo zaimplementowana 42.

Podsumowując, DSC oferuje znaczną przewagę jako narzędzie konformacyjnego odczytu produktów szczepionkowych i ich półproduktów. Dwa parametry, TM i ΔH, zebrane dla szeregu partii tego samego produktu mogą stać się empirycznym punktem odniesienia, który można wykorzystać do zbadania wpływu zmian w procesie, formułowania i warunków przechowywania na trzeciorzędową strukturę i stabilność antygenów białkowych i wirusowych 21, 43.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami Sanofi Pasteur. Praca została sfinansowana przez Sanofi Pasteur, a opłaty za publikację tego artykułu wideo zostały opłacone przez Sanofi Pasteur. Autorzy nie mają żadnych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem, który ma konflikt finansowy z tematem lub materiałami omawianymi w manuskrypcie. Należą do nich zatrudnienie, doradztwo, posiadanie akcji lub opcji lub tantiemy.

Przy tworzeniu tego rękopisu nie korzystano z pomocy pisarskiej.

Podziękowania

Autorzy są bardzo wdzięczni Josephowi Manciniemu (dawniej w GE Healthcare), Pawłowi Czudecowi, Thomasowi Cage'owi (Malvern Instruments limited) za ich rolę w instalacji i szkoleniu na różnicowym kalorymetrze skaningowym, Sasmitowi Deshmukhowi i Websterowi Magcalasowi za ich dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Różnicowy kalorymetr skaningowyMalvern Instruments Ltd28428948 (za pośrednictwem GE Healthcare)Posiada automatyczny podajnik próbek do automatycznego dozowania próbek do celi w celu zmniejszenia wysiłku ludzkiego i błędów.
Contrad 100Decon Laboratories Inc1504Rozcieńczyć wodą do 20% przed użyciem
500 &mikro; L Polipropylenowa płytka 96-dołkowa z okrągłym dnemKanadyjskieML072100również stosować równoważne płytki od innych dostawców (np. , VW)
MicroCal ThermoVac Malvern Instruments LtdN/Apwyposażony w szafę bezpieczeństwa biologicznego Cap VP DSC
 LabconcoLogic+ - Szafaz przepływem laminarnym A2 do przygotowania próbki
Kaseta dializacyjna Slide-A-LyzerThermo Scientific66810 lub 66380do równoważenia próbki i buforu
Nauki przyrodnicze Można

Bibliografia

  1. Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).
  2. Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. , US3263484A 02 August (1966).
  3. O'Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).
  4. O'Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).
  5. Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).
  6. Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).
  7. Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).
  8. Andronikashvili, E. L., et al. Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).
  9. Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).
  10. Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).
  11. Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).
  12. Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
  13. Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).
  14. Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).
  15. Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).
  16. Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
  17. Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).
  18. Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).
  19. Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
  20. Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).
  21. Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).
  22. Jiskoot, W., Daan, C. Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, Springer Science & Business Media. (2005).
  23. Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).
  24. Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
  25. Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
  26. Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
  27. Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).
  28. Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).
  29. Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).
  30. Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
  31. Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).
  32. Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), current step. 4 (2003).
  33. Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).
  34. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  35. HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. Differential Scanning Calorimetry. , Springer Science & Business Media. (2003).
  36. Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).
  37. Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
  38. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
  39. Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).
  40. Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).
  41. Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).
  42. Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).
  43. Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stabilno termiczna bia ekanaliza konformacji bia ektemperatura przej cia termicznegoentalpia rozfa dowaniaproces rozfa dowania bia eksp jno mi dzy partiamiprodukcja lek w biologicznychdichroizm ko owyprodukcja szczepionek
Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.