Artykuł metodologiczny

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55349

⸱

26 marca 2017

1Department of Structural Biology, Leibniz Institute of Molecular Pharmacology (FMP-Berlin)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy zawierają dwie kopie histonu (histony siostrzane) ozdobione odrębnymi zestawami modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Są to nowo zidentyfikowane gatunki o nieznanych sposobach osiedlania się i implikacjach funkcjonalnych. Obecne metody analityczne są niewystarczające do wykrycia specyficznego dla kopii występowania PTM na siostrzanych histonach nukleosomalnych. Protokół ten przedstawia biochemiczną metodę odtwarzania in vitro nukleosomów zawierających histony siostrzane znakowane izotopowo. Powstały kompleks może być również modyfikowany asymetrycznie, po włączeniu wstępnie zmodyfikowanej puli histonów podczas ponownego fałdowania podkompleksów histonowych. Te asymetryczne preparaty nukleosomów mogą być łatwo reagowane z enzymami modyfikującymi histony w celu zbadania mechanizmów przesłuchów modyfikacji narzuconych przez asymetrycznie wstępnie włączony PTM za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). W szczególności reakcje modyfikacji w czasie rzeczywistym mogą być odwzorowywane niezależnie na dwóch siostrzanych histonach, wykonując różne typy eksperymentów korelacji NMR, dostosowanych do odpowiedniego typu izotopu. Metodologia ta zapewnia środki do badania mechanizmów przesłuchów, które przyczyniają się do powstawania i propagacji asymetrycznych wzorców PTM w kompleksach nukleosomalnych.

Wprowadzenie

DNA eukariotyczne jest ciasno upakowane w jądrach komórkowych w chromatynie. Podstawowym budulcem chromatyny jest cząstka rdzenia nukleosomu, która zawiera ~ 147 pz DNA owiniętego wokół kompleksu oktamerycznego składającego się z dwóch kopii każdego z czterech histonów rdzenia (H3, H4, H2A, H2B). Białka histonowe zawierają mnóstwo modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Te substytucje kowalencyjne wywołują zmiany w strukturze chromatyny, zarówno bezpośrednio, wpływając na chemię fizyczną układu, jak i pośrednio poprzez rekrutację działań związanych z przebudową chromatyny1,2,3. W ten sposób histonowe PTM kontrolują dostępność chromatyny, a tym samym regulują wszystkie funkcje komórkowe oparte na DNA4.

PTM są instalowane przez systemy enzymatyczne modyfikujące histony, głównie na niestrukturalnych N-końcowych segmentach (ogonach) rdzeniowych histonów włączonych do nukleosomów. Ze względu na wiele miejsc modyfikacji w stosunkowo krótkiej sekwencji ogonów histonowych, PTM wpływają na siebie nawzajem, indukując lub blokując kolejne reakcje modyfikacji, efekt znany jako przesłuch modyfikacji5. Ze względu na ogólną symetryczną architekturę nukleosomu, uważano, że reakcje modyfikacji i mechanizmy przesłuchów zachodzą podobnie na dwóch kopiach każdego histonu nukleosomalnego (histonach siostrzanych). Koncepcja ta została niedawno zakwestionowana, a następnie obalona. W szczególności testy enzymatyczne in vitro na wolnych peptydach ogonowych histonu H3 i nukleosomach wykazały, że zestaw kinaz H3 wprowadził fosforylację w sposób asymetryczny6. Dodatkowo, analiza LC-MS/MS oparta na oczyszczaniu powinowactwa ujawniła istnienie asymetrycznie metylowanych nukleosomów H3 w kilku typach komórek eukariotycznych7. W związku z tym asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy stanowią nowy gatunek i potrzebne są narzędzia do odkrycia mechanizmów kontrolujących ich powstawanie i przeanalizowania efektów przesłuchów, jakie może wywierać ta asymetria.

Powszechnie, analiza Western Blotting (WB) i spektrometria mas (MS) były używane do wykrywania histonów PTM. Pomimo łatwej aplikacji, WB cierpi na problemy ze specyficznością/reaktywnością krzyżową. Co więcej, nie jest w stanie przeprowadzić jednoczesnej analizy multi-PTM i bezpośredniej kwantyfikacji reakcji modyfikacji8. Z drugiej strony, analiza MS wykorzystuje wyrafinowane oprzyrządowanie, które wymaga szkolenia na wysokim poziomie, ale zapewnia wysoką specyficzność, a także jednoczesne mapowanie i kwantyfikację wielu PTM9.  Jednak obie metody są destrukcyjne, a kompleksy nukleosomalne są dysocjowane przed analizą, co prowadzi do powstania mieszaniny histonów i/lub peptydów pochodzących z histonów. Ta manipulacja usuwa możliwość rozróżnienia niezależnych reakcji modyfikacji, które zachodzą na każdym z dwóch siostrzanych histonów i raportowania specyficznego dla kopii stanu modyfikacji histonów nukleosomalnych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) rozwinęła się jako alternatywna metoda mapowania reakcji PTM. NMR nie zakłóca pracy, a tym samym umożliwia monitorowanie zdarzeń PTM w czasie rzeczywistym w odtworzonych mieszaninach, a nawet w nienaruszonych komórkach10,11. Opracowanie procedur do szybkiego pozyskiwania danych, a także do mapowania w wysokiej rozdzielczości w oparciu o metody korelacji heterojądrowej 2D próbek znakowanych izotopowo (15N i/lub 13C) 12 pozwoliło na jednoczesne mapowanie różnych typów PTM, takich jak fosforylacja seryny/treoniny/tyrozyny, acetylacja/metylacja lizyny i metylacja argininy13. W zależności od badanego PTM, można zastosować 15protokołów znakowania N lub 13C do oznaczania białkowej grupy funkcyjnej, która służy jako reporter modyfikacji. W związku z tym mapowanie PTM można przeprowadzić, śledząc charakterystyczne przemieszczenie chemiczne odpowiedniej grupy funkcyjnej "wyczuwającej" zmianę w środowisku chemicznym. W większości przypadków zarówno grupy chemiczne NH, jak i C-H mogą być używane do raportowania ewolucji PTM będącego przedmiotem zainteresowania.

Obecny protokół opisuje generowanie nukleosomów zawierających histony siostrzane znakowane izotopami. Łączy w sobie elastyczność spektroskopii NMR do mapowania PTM przy użyciu widm korelacji 1 H-15N i 1 H-13C z wykorzystaniem różnych znaczników powinowactwa do białek do oczyszczania wybranych odtworzonych kompleksów histonowych. Warto zauważyć, że protokół wykorzystuje dwie różne pule określonego histonu do rekonstytucji nukleosomów. Pule te są znakowane izotopowo w różny sposób (jedna z 15N, druga z 13C) i są połączone odpowiednio ze znacznikiem powinowactwa do polihistydyny i streptawidyny. Tandemowy schemat oczyszczania powinowactwa z chromatografią na bazie Ni-NTA i streptawidyny, początkowo stosowany przez Voigt i wsp. 7 służy do oczyszczania gatunków asymetrycznych z symetrycznych odpowiedników (Rysunek 1A). Asymetryczne oktamery histonowe są następnie używane do odtwarzania równoważnych kompleksów nukleosomalnych (ryc. 1B), przy użyciu standardowej metody dializy solnej14. Dodatkowo, dzięki tej samej procedurze i wstępnej modyfikacji jednej z pul histonów, PTM może zostać asymetrycznie wbudowany w powstałe nukleosomy. Reakcja tych substratów z enzymami modyfikującymi histony i późniejsze mapowanie zdarzeń modyfikacji NMR umożliwiają scharakteryzowanie mechanizmów przesłuchów zarówno in-cis (wstępnie zmodyfikowana kopia histonu), jak i in-trans (niezmodyfikowana kopia histonu) (Figura 1C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Rekonstytucja nukleosomów za pomocą histonów siostrzanych znakowanych izotopowo (i asymetrycznie modyfikowanych)

UWAGA: Obecny protokół opisuje odtwarzanie nukleosomów za pomocą histonu H3 znakowanego izotopami. W tym celu wykorzystano dwie pule histonu H3; jeden był znakowany 15N i zawierał znacznik 6xHhis na N-końcu, a drugi był znakowany 13C i zawierał peptyd Strep (WSHPQFEK) połączony na N-końcu. Oba znaczniki zostały oddzielone od natywnej sekwencji H3 za pomocą miejsca rozpoznawania proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Aby przygotować dodatkowe asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy, jedna z dwóch pul H3 jest zawarta w formie wstępnie zmodyfikowanej. Premodyfikacja puli histonów może być przeprowadzona poprzez reakcję znakowanego izotopowo histonu będącego przedmiotem zainteresowania z odpowiednim enzymem modyfikującym histony w obecności niezbędnych dla każdego typu kofaktorów reakcji/donorów PTM16. Efektywne rozmieszczenie odpowiedniego PTM można ocenić za pomocą spektroskopii NMR lub spektrometrii mas. Użyte tutaj ilości histonów/DNA są przybliżonymi zaleceniami dla otrzymania preparatu nukleosomów o przybliżonym stężeniu 10 μM (mierzonym jako stężenie DNA przy 260 nm). Ta końcowa wydajność jest wystarczająca do zarejestrowania dobrej jakości widm NMR przy stosunkowo krótkim czasie akwizycji.

  1. Rekonstytucja oktamera histonu z histonem H3
    znakowanym izotopowo (i asymetrycznie zmodyfikowanym)     UWAGA: Rekombinowane białka histonowe mogą być wytwarzane w ilościach mg w komórkach BL21(DE3)plysS14. W celu otrzymania histonów znakowanych izotopowo stosuje się ten sam protokół ekspresji/oczyszczania, z wyjątkiem użycia do wzrostu bakterii minimalnej pożywki zawierającej 15NH4Cl i / lub 13C-glukozy jako źródła azotu i węgla, odpowiednio do znakowania 15N lub 13C. Oczyszczone histony są intensywnie dializowane za pomocą 5 mM β-merkaptoetanolu i przechowywane w liofilii przed użyciem.
    1. Rozpuścić liofilizowane podwielokrotności histonów, zawierające ~ 5 mg każdego histonu w 1 ml rozwijającego się buforu (7 M guanidynium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Uwzględnij oba typy histonu H3. Mieszać pipetując i nie mieszać. Trzymaj rurki na lodzie przez 30 minut, aby umożliwić całkowite rozłożenie.
    2. Określ dokładne stężenie każdego histonu, mierząc absorbancję przy 280 nm w stosunku do rozwijającego się buforu i używając współczynników ekstynkcji obliczonych za pomocą narzędzia ProtParam na portalu ExPASy. 15
    3. Wymieszaj histony rdzeniowe w proporcjach równomolowych, pamiętając o tym, aby uwzględnić po 50% każdej z dwóch pul histonów H3. Zacznij od wykorzystania całej zawartości mniej skoncentrowanego histonu i odpowiednio dodaj wszystkie pozostałe.
    4. Dostosować końcowe stężenie białka do około 1 mg/ml za pomocą buforu rozwijającego.
    5. Przenieść mieszaninę do membrany dializacyjnej o natężeniu 6 kDa i dializować na 1-2 litrach schłodzonego buforu do ponownego fałdowania (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) w temperaturze 4 °C. Zmienić bufor co najmniej raz po przeprowadzeniu dializy przez co najmniej 3 godziny. Przeprowadzić końcową dializę O/N w temperaturze 4 °C.
    6. Zebrać materiał dializowany i usunąć wszelkie osady przez odwirowanie w mikrodymie przez 5 minut w temperaturze 4 °C na maksymalnej prędkości (zwykle nie należy obserwować opadów). Oznaczyć stężenie oktamerów, mierząc absorbancję przy 280 nm. W obliczeniach użyj dodanych współczynników ekstynkcji histonów, pamiętając o podwojeniu każdej wartości.
    7. Zagęścić do końcowej objętości ~2 ml za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o sile 10 kDa. Przelicz stężenie oktamera i oszacuj straty. W tym momencie należy uzyskać stężenie oktamera w przedziale 50 - 100 μM.
    8. Podłączyć żelową kolumnę filtracyjną (podaną w tabeli materiałów) do systemu FPLC i zrównoważyć z 2 objętościami kolumny (CV) przefiltrowanego i odgazowanego buforu do ponownego składania 0,22 μm przy natężeniu przepływu 1 ml/min i ciśnieniu granicznym 0,5 MPa,
      UWAGA: Przebieg filtracji żelu powinien być wykonywany w chłodni lub w chłodni.
    9. Wstrzyknąć skoncentrowany materiał z natężeniem przepływu 1 ml/min i zebrać frakcje 1,0 - 1,5 ml.
    10. Postępuj zgodnie z profilem chromatograficznym i obserwuj elucję oktamera histonów w temperaturze ~65 - 68 ml.
      UWAGA: Małe ramię piku elucji i pik przy ~ 80 ml wskazują na istnienie odpowiednio wolnych tetramerów H3-H4 i dimerów H2A-H2B.
    11. Wprowadzić 20 μl każdej zebranej frakcji w 18% żelu SDS-PAGE.
      UWAGA: Rozcieńczyć próbki co najmniej 2-krotnie wodą przed załadowaniem ich do żelu, aby zmniejszyć wysokie stężenie soli, a tym samym uniknąć zniekształceń. To samo dotyczy kolejnych analiz SDS-PAGE próbek w buforze do ponownego składania.
    12. Zebrać odpowiednie frakcje zawierające czyste oktamery, oceniane na podstawie równego rozkładu 4 histonów na wybarwionym żelu i określić stężenie jak poprzednio (etap 1.1.7).
    13. Podłączyć kolumnę Ni-NTA o pojemności 1 ml (tabela materiałów) do systemu FPLC i zrównoważyć z 10 CV przefiltrowanego i odgazowanego buforu do ponownego fałdowania o średnicy 0,22 μm przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
      UWAGA: Chromatografię Ni-NTA należy wykonywać w chłodni lub w chłodni.
    14. Przepuścić oczyszczony oktamer przez Ni-NTA przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
    15. Pobrać próbki przepływowe i zachować je do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 μl i 4 μl). Następnie przemyć kolumnę buforem do ponownego składania o mocy 10 CV lub do momentu osiągnięcia sygnału linii podstawowej.
    16. Eluować za pomocą 10 CV buforu do ponownego fałdowania zawierającego 250 mM imidazolu przy natężeniu przepływu 1 ml/min. Próbki należy przechowywać do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 μl i 4 μl).
    17. Zrównoważyć 1 ml kolumny powinowactwa komercyjnej streptawidyny (tabela materiałów) z buforem do ponownego fałdowania 10 CV zawierającym 250 mM imidazolu, stosując konfigurację partia/przepływ grawitacyjny.
      UWAGA: Ten etap chromatograficzny powinien być wykonywany w chłodni.
    18. Przepuścić elucję Ni-NTA przez komercyjną kolumnę powinowactwa do streptawidyny.
    19. Pobrać próbki przepływowe i zachować je do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 μl i 4 μl). Następnie przemyć 10 CV bufora do ponownego składania.
    20. Eluować za pomocą 10 CV buforu do ponownego fałdowania zawierającego 2,5 mM destiobiotyny. Próbki należy przechowywać do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 i 4 μl).
    21. Zmierz stężenie oktamera, dodaj 10 razy mniej proteazy TEV i pozwól reakcji postępować przez noc w temperaturze 4 °C w standardowej probówce wirówkowej z tworzywa sztucznego.
      UWAGA: Ilość TEV niezbędna do uzyskania całkowitego roztrawienia (usunięcia znaczników powinowactwa) zależy od pochodzenia (konstruktu) i aktywności (świeżo przygotowany, rekombinowany TEV jest bardziej aktywny w porównaniu z tym przechowywanym przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C). Spróbuj początkowo dodać 10 razy mniej TEV w porównaniu z oktamerem (szacowanym jako stężenie białka) i odpowiednio dostosuj.
    22. Sprawdź skuteczne trawienie, uruchamiając 20 μl mieszaniny przed i po dodaniu TEV na 18% żelu SDS-PAGE. Jeśli trawienie nie jest całkowite, dodaj więcej proteazy TEV i kontynuuj inkubację przez kolejne 3-4 godziny.
    23. Dializować próbkę przed ponownym fałdowaniem buforu za pomocą membrany dializacyjnej o natężeniu 50 kDa, aby usunąć proteazę TEV i dostosować skład buforu.
    24. Zagęścić oczyszczony asymetryczny oktamer za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego o natężeniu 10 kDa (można również użyć tego samego filtra z kroku 1.1.7) do objętości 1,0-2,0 ml. Zmierz końcowe stężenie. Albo użyć wkrótce potem do rozpuszczenia nukleosomów, albo dostosować do 50% (v/v) glicerolu, aby przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas. W tym momencie i spodziewając się co najmniej 70% straty w poprzednich krokach, stężenie oktamera powinno mieścić się w zakresie 20 - 50 μM.
  2. Rekonstytucja nukleosomów
    1. Jeśli oktamer był przechowywany w 50% glicerolu, przed przystąpieniem do rekonstytucji nukleosomów należy dializować przez noc w temperaturze 4 °C przed ponownym fałdowaniem buforu.
    2. Dostosuj stężenie soli DNA (zawierającego sekwencję pozycjonowania nukleosomów) do 2 M NaCl za pomocą roztworu podstawowego 5 M NaCl.
      UWAGA: Oczyszczone DNA wyizolowane po oczyszczeniu plazmidu zawierającego wiele kopii pożądanej sekwencji lub zsyntetyzowane przez amplifikację PCR powinno być przechowywane skoncentrowane do ~50 μM w wodzie lub standardowym buforze Tris-EDTA.
    3. Wymieszaj oktamer i DNA, stosując optymalny stosunek określony na podstawie testu na małą skalę. Użyj bufora do ponownego składania, aby dostosować końcową objętość do ~ 3.0 ml. Oktamer należy zawsze dodawać na końcu, aby zapobiec możliwości zmieszania się oktamera i DNA przy stężeniu soli <2 M.
      1. Wykonaj wstępne rekonstytucje na małą skalę, aby określić stosunek oktameru do DNA, który prowadzi do optymalnej wydajności nukleosomów. W tym celu zbierz trzy reakcje o proporcjach 0,9:1,0, 1,0:1,0 i 1,1:1,0 DNA:oktamer w objętości między 50-100 μL. Zazwyczaj stosuje się stężenie 5 μM DNA.
      2. Kontynuuj rozpuszczenie zgodnie z opisem poniżej (kroki 1.2.4-1.2.8), a na końcu oszacuj ilość rozpuszczalnego i dobrej jakości odtworzonego nukleosomu, mierząc stężenie DNA przy 260 nm i uruchamiając 6% natywny żel DNA PAGE, barwiony odpowiednio bromkiem etydyny (ryc. 5A).
    4. Przenieść mieszaninę do membrany dializacyjnej o natężeniu 6 kDa i dializować na 1 l buforu do ponownego składania przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Stężenie soli w buforze dializacyjnym należy stopniowo zmniejszać odpowiednio z 2 do 0,85, 0,64 i 0,2 M NaCl. Próbkę należy przechowywać w każdym buforze przez co najmniej 3 godziny. Czasami osad powstaje po ostatnim przejściu. W takim przypadku należy kontynuować dializę zgodnie z planem i usunąć osad za pomocą odwirowania mikrodymki na końcu następnego etapu.
    6. Przenieść membranę dializacyjną do zlewki z 1 litrem buforu do oznaczania (25 mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) i kontynuować dializę O/N w temperaturze 4 °C.
    7. Pobrać próbkę, usunąć osad powstały w kroku 1.2.5 przez odwirowanie w mikrodymie przez 5 minut w temperaturze 4 °C na maksymalnej prędkości i zagęścić za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o sile 30 kDa do końcowej objętości ~300 μl.
    8. Zmierzyć stężenie DNA przy 260 nm, uruchomić 18% żel białkowy SDS-PAGE (4 μl próbki) i 6% żel natywnego DNA PAGE (0,2 μl próbki) i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Końcowe stężenie powinno mieścić się w przedziale 10-20 μM.

2. Analiza NMR reakcji modyfikacji dwóch siostrzanych histonów

UWAGA: Przypisanie widm korelacji 2D 1 H-15N nukleosomalnych ogonów histonów można znaleźć na stronie references16,17,18. Dodatkowo, przypisania grup CHx lizyn, seryny i treoniny na widmach korelacji 2D 1 H-13C można znaleźć pod adresem reference16.

  1. Konfiguracja NMR i rejestracja widm referencyjnych
    UWAGA: Testy enzymatyczne przeprowadzono przy użyciu 140 μl próbki nukleosomu w buforze testowym do 3-milimetrowej probówki NMR w temperaturze 300 K. Można również użyć różnych probówek NMR o innych objętościach próbki. Powyższa temperatura jest odpowiednia do uzyskania dobrej jakości widm korelacji 1 H-15N nukleosomalnych ogonów histonów oraz dobrej aktywności enzymatycznej. Widma 2D-SOFAST-HMQC 1 H-15N i 2D-HSQC 1 H-13C zarejestrowano odpowiednio w konfiguracji, która zapewnia podobne czasy akwizycji. Typowymi parametrami akwizycji są 128 stanów nieustalonych o punktach zespolonych 1,024 (1H) x 128 (15N) oraz 32 stany nieustalone o punktach zespolonych 1,024 (1H) x 64 (13C) dla dwóch różnych typów widm korelacji. Dla obu widm 2D czas akwizycji wynosił ~30 min.
    1. Ustawić 300 K jako temperaturę próbki w spektrometrze. Dodać 10% D2O (v/v) do próbki, która ma być użyta do blokady częstotliwości spektrometru.
    2. Umieść próbkę w spektrometrze i wykonaj podstawowe operacje (blokowanie, strojenie, podkładkowanie). Dodatkowo określ optymalne długości impulsów i ogólne parametry akwizycji.
    3. Rejestrować widma odniesienia 1D i 2D, 1 H-15N i 1 H-13C.
    4. Przetwarzaj widma referencyjne i upewnij się, że sygnały, które mają być użyte do mapowania reakcji modyfikacji, są dobrze rozdzielone i mają dobrą intensywność.
    5. Odzyskaj próbkę i przenieś ją do probówki do mikrofuge.
  2. Przygotowanie reakcji enzymatycznej, monitorowanie NMR i analiza ilościowa
    1. Skopiuj i ułóż serię przeplatanych widm 2D 1 H-15N i 1 H-13C. Dąż do całkowitego czasu akwizycji wynoszącego kilka godzin i odpowiednio dostosuj w nowym przebiegu w oparciu o szybkości enzymatyczne uzyskane z pierwszej reakcji.
    2. Dodać do próbki kofaktory niezbędne dla odpowiedniego typu reakcji modyfikacji (1 mM ATP/2 mM MgCl2 do fosforylacji, 1 mM acetylo-CoA do acetylacji, 1 mM SAM do metylacji itp.).
    3. Dodać interesujący enzym, wymieszać pipetując, przenieść próbkę z powrotem do probówki NMR, a następnie do spektrometru (wykonać te operacje szybko).
      UWAGA: Jeśli nie ma danych na temat oczekiwanej aktywności enzymatycznej, dostosuj stosunek molowy substratu do enzymu do 10:1. Wykonaj pierwszy przejazd próbny i odpowiednio dostosuj go do rzeczywistego przebiegu.
    4. Wykonaj szybkie automatyczne podkładkowanie i wykorzystaj resztę parametrów z widm referencyjnych.
    5. Zainicjuj serię przeplatanych widm 2D 1 H-15N i 1 H-13C.
    6. Śledź postęp reakcji w czasie rzeczywistym i zatrzymaj akwizycję, gdy reakcja osiągnie zakończenie lub pożądany poziom.
    7. Przetwarzaj widma jak poprzednio z dokładnie tymi samymi parametrami.
    8. Powtórz cały przebieg, stosując inną kolejność akwizycji dla dwóch typów widm korelacji. Jeśli w pierwszym eksperymencie korelacja 1 H-15N była pierwsza w serii, zacznij teraz od korelacji 1 H-13C. Dzięki temu i przy tym samym czasie akwizycji dla obu widm, możliwe jest wykreślenie i porównanie reakcji PTM na obu histonach znakowanych izotopami w tej samej skali czasowej. Dodatkowo możliwe jest obliczanie średnich i wykreślanie słupków błędów.
      UWAGA: Dokładny opis metodologii analizy sygnału NMR i późniejszej kwantyfikacji reakcji enzymatycznych można znaleźć tutaj19.
    9. Wybierz sygnały NMR z każdego widma NMR w czasie przebiegu, które informują o postępie reakcji i oblicz ich względne intensywności sygnału za pomocą oprogramowania do wizualizacji i analizy widm NMR. Zrób to dla sygnałów, które zgłaszają zarówno stan niezmodyfikowany, jak i zmodyfikowany. Wyodrębnij poziomy modyfikacji
      10. .
    10. Wykreślić obliczone wartości poziomów modyfikacji w funkcji czasu reakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Właściwie refoldowane formy oktameryczne są izolowane po przepuszczeniu mieszaniny rekonstytuującej przez kolumnę do filtracji żelowej (Rysunek 2). Rekonstytuowana pula oktamerów zawierająca trzy różne typy oktamerów jest poddawana schematowi tandemowego oczyszczania powinowactwa. Próbki są pobierane na każdym etapie i analizowane metodą SDS-PAGE, a następnie WB. Weryfikację prawidłowego wykonania protokołu prowadzącego do izolacji form asymetrycznych przeprowadza się pop...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Do rekonstytucji nukleosomów obecny protokół wykorzystuje matrycę DNA o długości 165 pz zawierającą sekwencję pozycjonowania nukleosomów 601-Widom20, ale oczekuje się podobnej wydajności przy użyciu różnych długości matryc DNA. Protokół został zaprojektowany i zastosowany przy użyciu asymetrycznych typów histonu H3. Na tej samej zasadzie metoda może być stosowana również do innych histonów rdzeniowych, a dodatkowo może być stosowana do rekonstytucji kompleksów zawierających dwa odrębne histony rdz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Autor dziękuje Dr. Philippowi Selenko (FMP-Berlin) za udostępnienie przestrzeni i infrastruktury do przeprowadzania eksperymentów oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) za sfinansowanie pracy poprzez grant badawczy (LI 2402/2-1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Guanidinium HClApplichemA14199Użyj wysokiej jakości Gu-HCl
Tris Roth4855.2
DTT ApplichemA1101
NaClVWR chemicals27810.364
EDTARoth8043.2
Na2H2PO4ApplichemA1046
NaH2PO4ApplichemA3902
AplikacjaimidazolowaA1073
d-DesthiobiotinSigmaD1411
Ni-NTA SuperflowQiagen1034557
Strep-Tactin SuperflowIBA2-1207-001
Santa Cruzsc-8036
Sprzężona z paciorkowcem HRPIBA2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28-9893-35
Membrana dializowa 6 - 8 kDaSpectrumlabsspectra/por 1, 132650
50 kDa membrana dializacyjnaSpectrumlabsspectra/por 7, 132129
10 kDa filtr odśrodkowyMerck MilliporeUFC901024
30 kDa jednostkaMerck MilliporeUFC903024
Spektrometr NMR w stanie roztworu o częstotliwości roboczej co najmniej 500 MHz, wyposażony w kriosondę z potrójnym rezonansem
Buffer nameComponent
Unfolding Buffer7 M Guanidinium HCl
20 mM Tris, pH 7,5
10 mM Bufor do ponownego składania naziemnej telewizji cyfrowej
10 mM Tris, pH 7,5
2 M NaCl
1 mM EDTA
2 mM DTT
Bufor testowy25 mM Na2H2PO4, pH 6,8
25 mM NaCl
2 mM DTT
Przeciwciało przeciwko paciorkowcom

Bibliografia

  1. Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
  2. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
  3. Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  4. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
  5. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  6. Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
  7. Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
  8. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  9. Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
  10. Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
  11. Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251(2016).
  12. Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
  13. Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
  15. Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
  16. Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
  17. Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
  18. Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
  19. Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  20. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
  21. Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
  22. Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
  23. Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
  24. Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstytucja nukleosom whistony znakowane izotopowohiston H3oczyszczanie bia ekmembrana dializacyjnafiltracja elowachromatografia powinowactwaspektroskopia NMRmodyfikacje potranslacyjne

Powiązane artykuły