Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Podsumowanie

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy zawierają dwie kopie histonu (histony siostrzane) ozdobione odrębnymi zestawami modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Są to nowo zidentyfikowane gatunki o nieznanych sposobach osiedlania się i implikacjach funkcjonalnych. Obecne metody analityczne są niewystarczające do wykrycia specyficznego dla kopii występowania PTM na siostrzanych histonach nukleosomalnych. Protokół ten przedstawia biochemiczną metodę odtwarzania in vitro nukleosomów zawierających histony siostrzane znakowane izotopowo. Powstały kompleks może być również modyfikowany asymetrycznie, po włączeniu wstępnie zmodyfikowanej puli histonów podczas ponownego fałdowania podkompleksów histonowych. Te asymetryczne preparaty nukleosomów mogą być łatwo reagowane z enzymami modyfikującymi histony w celu zbadania mechanizmów przesłuchów modyfikacji narzuconych przez asymetrycznie wstępnie włączony PTM za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). W szczególności reakcje modyfikacji w czasie rzeczywistym mogą być odwzorowywane niezależnie na dwóch siostrzanych histonach, wykonując różne typy eksperymentów korelacji NMR, dostosowanych do odpowiedniego typu izotopu. Metodologia ta zapewnia środki do badania mechanizmów przesłuchów, które przyczyniają się do powstawania i propagacji asymetrycznych wzorców PTM w kompleksach nukleosomalnych.

Wprowadzenie

DNA eukariotyczne jest ciasno upakowane w jądrach komórkowych w chromatynie. Podstawowym budulcem chromatyny jest cząstka rdzenia nukleosomu, która zawiera ~ 147 pz DNA owiniętego wokół kompleksu oktamerycznego składającego się z dwóch kopii każdego z czterech histonów rdzenia (H3, H4, H2A, H2B). Białka histonowe zawierają mnóstwo modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Te substytucje kowalencyjne wywołują zmiany w strukturze chromatyny, zarówno bezpośrednio, wpływając na chemię fizyczną układu, jak i pośrednio poprzez rekrutację działań związanych z przebudową chromatyny^1,2,3. W....

Protokół

1. Rekonstytucja nukleosomów za pomocą histonów siostrzanych znakowanych izotopowo (i asymetrycznie modyfikowanych)

UWAGA: Obecny protokół opisuje odtwarzanie nukleosomów za pomocą histonu H3 znakowanego izotopami. W tym celu wykorzystano dwie pule histonu H3; jeden był znakowany ¹⁵N i zawierał znacznik 6xHhis na N-końcu, a drugi był znakowany ¹³C i zawierał peptyd Strep (WSHPQFEK) połączony na N-końcu. Oba znaczniki zostały oddzielone od natywnej sekwencji H3 za pomocą miejsca rozpoznawania proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Aby przygotować dodatkowe asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy, jedna z dwóch p....

Wyniki

Właściwie refoldowane formy oktameryczne są izolowane po przepuszczeniu mieszaniny rekonstytuującej przez kolumnę do filtracji żelowej (Rysunek 2). Rekonstytuowana pula oktamerów zawierająca trzy różne typy oktamerów jest poddawana schematowi tandemowego oczyszczania powinowactwa. Próbki są pobierane na każdym etapie i analizowane metodą SDS-PAGE, a następnie WB. Weryfikację prawidłowego wykonania protokołu prowadzącego do izolacji form asymetrycznych przeprowadza się pop.......

Dyskusja

Do rekonstytucji nukleosomów obecny protokół wykorzystuje matrycę DNA o długości 165 pz zawierającą sekwencję pozycjonowania nukleosomów 601-Widom²⁰, ale oczekuje się podobnej wydajności przy użyciu różnych długości matryc DNA. Protokół został zaprojektowany i zastosowany przy użyciu asymetrycznych typów histonu H3. Na tej samej zasadzie metoda może być stosowana również do innych histonów rdzeniowych, a dodatkowo może być stosowana do rekonstytucji kompleksów zawierających dwa odrębne histony rdz.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Guanidinium HCl	Applichem	A14199	Użyj wysokiej jakości Gu-HCl
Tris	Roth	4855.2
	DTT Applichem	A1101
NaCl	VWR chemicals	27810.364
EDTA	Roth	8043.2
Na2H2PO4	Applichem	A1046
NaH2PO4	Applichem	A3902
Aplikacja	imidazolowa	A1073
d-Desthiobiotin	Sigma	D1411
Ni-NTA Superflow	Qiagen	1034557
Strep-Tactin Superflow	IBA	2-1207-001
	Santa Cruz	sc-8036
Sprzężona z paciorkowcem HRP	IBA	2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28-9893-35
Membrana dializowa 6 - 8 kDa	Spectrumlabs	spectra/por 1, 132650
50 kDa membrana dializacyjna	Spectrumlabs	spectra/por 7, 132129
10 kDa filtr odśrodkowy	Merck Millipore	UFC901024
30 kDa jednostka	Merck Millipore	UFC903024
Spektrometr NMR w stanie roztworu			o częstotliwości roboczej co najmniej 500 MHz, wyposażony w kriosondę z potrójnym rezonansem
Buffer name	Component
Unfolding Buffer	7 M Guanidinium HCl
	20 mM Tris, pH 7,5
	10 mM Bufor do ponownego składania naziemnej telewizji cyfrowej
	10 mM Tris, pH 7,5
	2 M NaCl
	1 mM EDTA
	2 mM DTT
Bufor testowy	25 mM Na2H2PO4, pH 6,8
	25 mM NaCl
	2 mM DTT

Przeciwciało przeciwko paciorkowcom