Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wstrzyknięcie dosercowe pod kontrolą ultradźwięków ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia naprowadzania do jelita do stosowania w mysich modelach eksperymentalnych chorób zapalnych jelit

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55367

⸱

1 września 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology and Liver Disease, University Hospitals, Digestive Health Research Institute, Case Western Reserve University, 2Case Cardiovascular Research Institute, School of Medicine, Case Western Reserve University, 3Department of Medicine, Harrington Discovery Institute, Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Case Medical Center, 4Department of Radiology, University Hospitals Case Medical Center, 5Department of Biology - Skeletal Research Center, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

Mysie badania na modelach zapalenia jelita grubego wykazały, że niewielki procent (1 - 5%) mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wstrzykniętych dożylnie lub dootrzewnowo do miejsca zapalnego jelita grubego1,2. Badanie to pokazuje, że dosercowe wstrzyknięcia MSC pod kontrolą USG powodują zwiększoną lokalizację w jelicie.

Streszczenie

Choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) jest powszechną przewlekłą chorobą zapalną jelita cienkiego i grubego. Mysie i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał immunosupresyjny i wykazano, że hamują stan zapalny w mysich modelach zapalenia jelit, mimo że droga podania może ograniczać ich naprowadzanie i skuteczność 1,3,4,5. Miejscowe zastosowanie MSCs w modelach uszkodzeń okrężnicy wykazało większą skuteczność w łagodzeniu stanu zapalnego w okrężnicy. Istnieje jednak niedostatek danych na temat technik zwiększających lokalizację MSC pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego (hMSC) w jelicie cienkim, miejscu zapalenia w modelu SAMP-1/YitFc (SAMP) eksperymentalnej choroby Leśniowskiego-Crohna. W pracy opisano nowatorską technikę dosercowego wstrzykiwania hMSC pod kontrolą USG myszom SAMP – dobrze scharakteryzowanego spontanicznego modelu przewlekłego zapalenia jelit. Jako grupę kontrolną użyto myszy AKR/J (AKR) dopasowane pod względem płci i wieku, wolne od stanu zapalnego. Aby przeanalizować biodystrybucję i lokalizację, hMSC transdukowano lentiwirusem zawierającym potrójny reporter. Potrójny reporter składał się z lucyferazy świetlików (fl), do obrazowania bioluminescencyjnego; monomeryczne białko czerwonej fluorescencji (MRFP) do sortowania komórek; oraz kinazę tymidynową wirusa opryszczki pospolitej (TTK), do obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET). Wyniki tego badania pokazują, że 24 godziny po podaniu dosercowym hMSC lokalizują się w jelicie cienkim myszy SAMP w przeciwieństwie do myszy AKR wolnych od stanu zapalnego. To nowatorskie, sterowane ultradźwiękami wstrzyknięcie hMSC do lewej komory myszy SAMP zapewnia wysoki wskaźnik powodzenia dostarczania komórek, umożliwiając szybki powrót do zdrowia myszy przy minimalnej zachorowalności i śmiertelności. Technika ta może być użyteczną metodą dla zwiększonej lokalizacji MSCs w innych modelach zapalenia jelita cienkiego, takich jak TNFΔRE6. Przyszłe badania określą, czy zwiększona lokalizacja hMSC przez dostarczanie dotętnicze może prowadzić do zwiększenia skuteczności terapeutycznej.

Wprowadzenie

Choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) jest powszechną przewlekłą chorobą zapalną jelita cienkiego i grubego i uważa się, że wynika z niewłaściwej reakcji układu odpornościowego gospodarza na drobnoustroje jelitowe7,8. Ostatnie badania wykazały, że zarówno mysie, jak i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mogą tłumić stan zapalny w mysich modelach zapalenia jelit1,3,4,5. Prowadzonych jest wiele badań klinicznych, w których wykorzystuje się ludzkie MSCs pochodzące ze szpiku kostnego lub tkanki tłuszczowej w leczeniu pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD), w tym CD9. W tych badaniach klinicznych zastosowano dwie drogi terapii MSC: jedna obejmuje infuzję ogólnoustrojową (tj. dożylną) MSC w przypadku nieswoistego zapalenia jelit (w tym CD), a druga obejmuje miejscowe zastosowanie/wstrzyknięcie komórek macierzystych w przetokę u pacjentów z okołoodbytniczą chorobą ChLC. W niedawnej metaanalizie terapii MSC w NZJ, ogólnoustrojowa (tj. dożylna) terapia MSC w świetle IBD (w tym CD) była skuteczna u 40% (95% CI: 7 - 79%) pacjentów, podczas gdy skuteczność była znacznie wyższa, na poziomie 61% (95% CI: 36 - 85%), gdy MSCs wstrzykiwano miejscowo do chorej przetoki CD9. Niedawne wieloośrodkowe, randomizowane, kontrolowane placebo badanie fazy III allogenicznych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej wstrzykniętych bezpośrednio do przetoki okołoodbytniczej pacjentów z CD wykazało statystycznie istotne kliniczne i radiologiczne dowody gojenia się przetok okołoodbytniczych, potwierdzając wyniki metaanalizy10. Przyczyny niskiej skuteczności terapii MSC podawanej dożylnie w przypadku DLD światła nie zostały odpowiednio zbadane, ale jedną z przyczyn może być nieodpowiednie naprowadzanie MSCs do miejsca zapalenia. Badania na myszach w modelach zapalenia okrężnicy wykazały, że tylko niewielki odsetek MSCs (1 - 5%) wstrzykiwanych dożylnie dociera do jelita grubego objętego stanem zapalnym; pozostałe MSC są filtrowane przez płuca (efekt pierwszego przejścia)1,2,5,11,12. W związku z tym w wielu badaniach naukowych na myszach wykorzystano drogę dootrzewnową (i.p.) do podawania MSC w zwierzęcych modelach zapalenia jelita grubego4. Jednak wykazali również, że tylko niewielka część komórek dociera do okrężnicy i wszczepia się do niej, a skuteczność jest związana z wydzielaniem rozpuszczalnych czynników parakrynnych, takich jak białko genu 6 indukowane czynnikiem martwicy nowotworu (TSG-6)2. Mechanizm immunosupresji i leczenia MSC obejmuje wielotorowe podejście, które obejmuje parakrynnę; czynniki niezależne od bliskości komórek, takie jak TSG-6; oraz czynniki zależne od bliskości komórek, takie jak ligand programowanej śmierci 1 (PD-L1); lub Jagged 1. W związku z tym lokalizacja MSC w miejscu zapalenia może skutkować zwiększoną skutecznością9,13. W rzeczywistości niedawne badanie wykazało, że MSCs bezpośrednio zagnieżdżone w miejscu uszkodzenia okrężnicy powodowały gojenie poprzez wydzielanie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego promującego angiogenezę (VEGF). Z drugiej strony, minimalny efekt leczniczy odnotowano po wstrzyknięciu dożylnym5. Aby zwiększyć ich lokalizację w miejscu zapalenia (tj. Jelicie cienkim u myszy SAMP), opracowano tę technikę wstrzykiwania dosercowego pod kontrolą USG do podawania MSC do lewej komory. Iniekcja sterowana obrazem zapewnia dokładne wstrzyknięcie, co prowadzi do wyższego wskaźnika sukcesu oraz do zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności. Co więcej, wstrzyknięcie MSCs do lewej komory dostarcza je do krążenia tętniczego, gdzie mogą dotrzeć do stanu zapalnego jelita cienkiego, zanim zostaną uwięzione w płucach.

W tym badaniu, ludzkie MSCs pochodzące ze szpiku kostnego (hMSC) zostały użyte do wstrzyknięcia w mysim modelu SAMP-1/YitFc (SAMP) klasy CD14. SAMP jest dobrze scharakteryzowanym, spontanicznym, mysim modelem przewlekłego stanu zapalnego, który rozwija zapalenie jelita cienkiego z prawie 100% penetracją14. Stan zapalny rozwija się w odpowiedzi na mikroflorę przy braku jakiejkolwiek manipulacji chemicznej, immunologicznej lub genetycznej i bardzo przypomina ludzką klasę CD11. W badaniu wykorzystano dopasowane pod względem płci i wieku myszy AKR/J (AKR) (AKR), myszy kontroli rodzicielskiej SAMP.

hMSCs zostały wyizolowane i rozszerzone w laboratorium z próbek szpiku kostnego (BM) pobranych od normalnych, niezidentyfikowanych dawców po świadomej zgodzie przy użyciu zatwierdzonych i wcześniej opublikowanych protokołów15,16. Po wyizolowaniu i ekspansji, zdolność MSC do różnicowania osteogennego, adipogennego i chondrogennego oceniono w laboratorium za pomocą wielu testów15. Osteogenny test funkcjonalny przeprowadzono poprzez wszczepienie podskórnie ceramicznych kostek matrycy hydroksyapatytu/fosforanu trójwapniowego zawierającej hMSC u myszy z obniżoną odpornością CB17-Prkdc SCID17. Test sześcienny wykazuje potencjał osteogenezy i chondrogenezy i jest uważany za ostateczny test do oceny poszczególnych preparatów MSC17. Aby uwidocznić hMSC in vivo po wstrzyknięciu, lentiwirus został wykorzystany do transdukcji hMSC za pomocą potrójnego konstruktu genu reporterowego, który składa się z lucyferazy świetlika (fl), monomerycznego białka czerwonej fluorescencji (mRFP) i kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej (ttk), napędzanej przez zmodyfikowany promotor wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego (MND)18. Lucyferazy świetlika w potrójnym reporterze jest enzymem, który zakrywa wstrzykniętą lucyferynę do oksylucyferyny w hMSC i wytwarza fotony/światło białe. Jest to wykrywane przez czułą kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) (bioluminescencja) w systemie obrazowania optycznego in vivo, umożliwiając wizualizację żywych hMSC u myszy. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) jest czułą techniką, która może być stosowana seryjnie do śledzenia komórek i do analizy ex vivo. Zastosowanie silnego promotora mnd napędza ciągłą ekspresję konstruktu genu reporterowego potrójnej fuzji i pozwala na obrazowanie wstrzykniętych hMSC przez ponad 16 tygodni19. hMSC są trudne do wydedukowania i mają niską wydajność transdukcji. Korzystając ze zoptymalizowanego protokołu, poprawiono wydajność transdukcji hMSCs i zwiększono ekspresję transgenu18. Wykorzystując ekspresję mRFP (jednego z potrójnych genów reporterowych) w cytometrii przepływowej, wykazano zdolność do transdukcji hMSC z wysoką skutecznością do 83%. Testy różnicujące i testy sześcienne in vivo wykazały zdolność transdukowanych hMSC do różnicowania się w chondrocyty, adipocyty i osteocyty17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i procedury na myszach w badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Case Western Reserve. Procedury zostały przeprowadzone w placówce akredytowanej przez Stowarzyszenie Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC). BM został odessany zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Uniwersytecką Komisję Rewizyjną Szpitali Uniwersyteckich w ośrodku komórek macierzystych na Uniwersytecie Case Western Reserve po uzyskaniu świadomej zgody.

1. Hodowla i transdukcja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (hMSC)

UWAGA: Izolacja hMSC jest szczegółowo opisana w poprzednich publikacjach15,20.

  1. Hodowla wyizolowanych hMSC w pożywce Modified Eagle Medium-low glucose (DMEM-LG) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Hodować komórki w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 w kolbach T175 z 25 ml pożywki wzrostowej. Wymieniaj pożywkę co 3 - 4 dni. W dniu 14 wykonaj pierwotne przejście hMSC.
    1. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, należy całkowicie usunąć starą pożywkę i delikatnie umyć komórki 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; dla 75-centymetrowych kolb do hodowli tkankowych).
    2. Wyjąć PBS z kolby i dodać 4 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5-10 minut. Czas ekspozycji powinien być jak najkrótszy.
    3. Gdy większość komórek stanie się dobrze zaokrąglona lub odłączy się od szalki hodowlanej, zatrzymaj reakcję, dodając objętość surowicy cielęcej bydła równą połowie objętości trypsyny.
    4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości. Odwirować komórki o sile 400 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.
    5. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki (DMEM-LG + 10% FBS) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: W tym momencie komórki mogą być subhodowane lub transdukowane za pomocą potrójnego reportera.
  2. Wykonaj transdukcję hMSC za pomocą potrójnego reportera.
    1. Nasiona 1,5 x 106 komórek w jednej kolbie T175. Hodować komórki w 25 ml pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C, 95%, wilgotności i 5% CO2 . Poczekaj 24 godziny, aż ogniwa się przyczepią.
    2. Przygotuj koktajl wirusów w probówkach o pojemności 15 ml, zgodnie z opisem w odnośniku 18.
      1. Rozmrozić lentiwirusa w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Dodać 160 μl roztworu siarczanu proteaminy o stężeniu 5 mg/ml w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco do 8 ml pożywki hodowlanej (DMEM-LG + 10% FBS), aby uzyskać końcowe stężenie 100 μg/ml. Wir przez 3 s. Dodaj wielokrotność infekcji wirusa (MOI) wynoszącą 5 (po raz pierwszy rozmrożony).
    3. Usunąć pożywkę z kolby do hodowli komórkowej (etap 1.2.1) i dodać koktajl wirusa do komórek. Inkubować przez 10 godzin w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 .
  3. Dodaj 4 ml 100 μg/ml siarczanu proteaminy do 4 ml DMEM-LG + 10% FBS i inkubuj przez dodatkowe 14 godzin.
  4. Zatrzymaj transdukcję po 24 godzinach, zastępując ją 25 ml pożywki (DMEM-LG + 10% FBS).
  5. Potwierdź wydajność transdukcji, oceniając ekspresję mRFP za pomocą cytometrii przepływowej18.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano hMSC, które były transdukowane z ponad 65% wydajnością.
  6. Rozszerz komórki, zastępując je 25 ml świeżej pożywki (DMEM-LG + 10% FBS) dwa razy w tygodniu. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 . Komórki pasażowe po osiągnięciu 80% konfluencji.
  7. Po osiągnięciu żądanej liczby komórek wykonaj trypsynizację zgodnie z krokami 1.1.2 - 1.1.4.
  8. Policz komórki i zawiesić je w sterylnym PBS (1x) w końcowym stężeniu 1 x 106 komórek/75 μl. Trzymaj komórki na lodzie w celu transportu do aparatu ultrasonograficznego. Do eksperymentów użyj hMSC z fragmentów o numerach 2 - 5.

2. Wstrzyknięcie dosercowe hMSC pod kontrolą USG do lewej komory

UWAGA: Użyj SAMP1/YitFc z ustalonym zapaleniem jelita cienkiego oraz myszami AKR/J dopasowanymi pod względem wieku i płci do eksperymentów. Utrzymuj myszy SAMP i AKR w określonych warunkach wolnych od patogenów, karm je standardową karmą laboratoryjną i utrzymuj je w 12-godzinnych cyklach światła/ciemności. W tym przypadku zastrzyki kardiologiczne pod kontrolą USG zostały wykonane w dedykowanym, wolnym od patogenów pomieszczeniu ultrasonograficznym serca znajdującym się w ośrodku badawczym CWRU, które zostało zdezynfekowane środkiem dezynfekującym i spłukane 70% alkoholem. Personel badawczy laboratorium musi nosić środki ochrony osobistej, w tym fartuchy, maski na twarz z osłonami oczu oraz sterylne rękawiczki podczas iniekcji dosercowych. Ciepłota ciała myszy musi być utrzymywana przez cały czas trwania zabiegu.

  1. Skonfiguruj system obrazowania ultrasonograficznego przed znieczuleniem myszy. Do tego protokołu należy użyć aparatu ultrasonograficznego przeznaczonego do echokardiogramu myszy.
    1. Włącz zasilanie i zainicjuj przetwornik (30 MHz), aby skonfigurować nowe badanie.
  2. Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej za pomocą 3 - 4% izofluranu w 100% tlenu w ilości 0,2 - 0,5 l/min. Utrzymuj zwierzę przez cały zabieg za pomocą 2% izofluranu w 100% tlenu przez stożek nosowy. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przed wykonaniem obrazowania, ściskając palec u nogi, obracając myszą i obserwując brak ruchu.
    UWAGA: Maść okulistyczną należy nakładać na oczy po indukcji znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Przenieś znieczulone myszy do maszyn do obrazowania (tj. systemu obrazowania bioluminescencyjnego i ultradźwięków), gdzie otrzymają podtrzymującą dawkę znieczulającego izofluranu. Określ czas rozpoczęcia znieczulenia i głębokość znieczulenia, obserwując brak reakcji na szczypanie ogona i opuszki stopy co 10 minut przez cały czas trwania znieczulenia.
  3. Ustaw temperaturę stołu do obrazowania i żelu ultradźwiękowego na 37 °C.
  4. Całkowicie usuń sierść nad klatką piersiową znieczulonej myszy za pomocą kremu do depilacji.
  5. Umieść mysz na stole do obrazowania w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz zarówno górną, jak i dolną kończynę taśmą klejącą, aby uniknąć ruchów ciała podczas zabiegu. Podczas zabiegu należy używać monitora elektrokardiograficznego dla wszystkich myszy.
  6. Oczyść skórę w okolicy klatki piersiowej za pomocą 10% wacika z powidonu/jodu, a następnie wacika z 70% etanolu. Nałóż grubą warstwę żelu na obszar klatki piersiowej myszy.
  7. Zamontuj przetwornik w uchwycie i dostosuj jego położenie, aż lewa komora będzie wyraźnie widoczna w polu widzenia.
  8. Załadować 150 μl transdukowanej zawiesiny komórek hMSC (2 x 10 6 hMSC w 150 μl sterylnego PBS) do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 28 G i przymocować strzykawkę do odpowiedniego uchwytu. Aby uwidocznić pulsującą krew, trzymaj małą kolumnę powietrza w strzykawce. Aby uniknąć zbrylania się, przed wstrzyknięciem należy zawiesić komórki.
  9. Przesuń strzykawkę w kierunku klatki piersiowej myszy, wyreguluj trajektorię igły za pomocą wskazówek ultrasonograficznych i wprowadź do lewej komory.
  10. Postępując zgodnie ze wskazówkami obrazowania ultrasonograficznego, wbić igłę strzykawki przez przestrzeń międzyżebrową do lewej komory myszy.
    UWAGA: Końcówka igły strzykawki powinna być wyraźnie widoczna w lewej komorze na obrazie ultrasonograficznym. Prawidłowe umieszczenie krwi powinno być dodatkowo potwierdzone przez świeży odpływ krwi tętniczej do strzykawki. Są to oznaki udanego wprowadzenia.
  11. Zawiesinę komórek hMSC należy wstrzykiwać bardzo powoli przez 2 minuty, delikatnie uciskając.
  12. Po wstrzyknięciu zawieszonych komórek delikatnie wyjmij igłę, wyczyść żel ultradźwiękowy i uwolnij mysz z ograniczników taśmy.
  13. Umieść zwierzę w nowej, czystej klatce z podgrzaną podkładką.
    UWAGA: Po zakończeniu zabiegu myszom należy zapewnić ciepłe środowisko do czasu wyzdrowienia. Należy unikać przegrzania, ponieważ rozszerzenie naczyń obwodowych utrudnia regenerację. Myszy powinny być ściśle monitorowane i trzymane w izolacji od innych myszy do czasu ich pełnego wyzdrowienia, co wskazuje na ich zdolność do utrzymania pozycji leżącej mostka.
  14. Monitorować zwierzę aż do całkowitego wyzdrowienia po znieczuleniu i codziennie do końca eksperymentu.

3. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) hMSC

  1. Obrazowanie myszy 24 godziny po wstrzyknięciu dosercowym w systemie obrazowania bioluminescencyjnego. Uruchom oprogramowanie do obrazowania in vivo. Zainicjuj system obrazowania i otwórz nowe badanie.
    1. Na panelu sterowania ustaw parametry obrazowania, klikając "ustawienia sekwencji". W trybie obrazowania wybierz "luminescencja" i "zdjęcie". Ustaw czasy naświetlania od 0.5 s do 10 min. Ustaw binning na "średni", a F/stop na "1". Ustaw filtr wzbudzenia na "blok", a filtr emisji na "otwarty". Ustaw pole widzenia na "C"" dla dwóch myszy. Dodaj konfigurację sekwencji do kreatora obrazów, klikając panel sterowania akwizycją.
  2. Włączyć pompę tlenową i ustawić izofluran na 2,5% zarówno w komorze indukcyjnej, jak i w stożku nosowym wewnątrz urządzenia.
  3. Wstrzyknąć myszowi i.p. 300 μl D-lucyferyny (12,5 mg/ml).
  4. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia.
    1. Po 2 - 3 minutach przenieś mysz do komory obrazowania in vivo, z głową w stożku nosowym na kolektorze anestezjologicznym. Nałóż maść optyczną, aby chronić oczy podczas obrazowania. Aby zobrazować wiele myszy, użyj czarnej przegrody świetlnej, aby zapobiec odbijaniu się światła od sąsiednich myszy.
  5. Kliknij przycisk "pobierz", aby rozpocząć akwizycję obrazu 10 minut po wstrzyknięciu D-Lucyferyny.
  6. Powtórz kroki 3.3 - 3.5, aby zobrazować więcej myszy.
  7. Po uzyskaniu obrazu in vivo należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć. Wykonaj analizę ex vivo.
    1. Jeśli analiza ex vivo jest wykonywana po 20 minutach, powtórz wstrzyknięcie lucyferyny (krok 3.3) przed poświęceniem myszy; sygnał BLI może się zmniejszyć 20 minut po wstrzyknięciu lucyferyny.
  8. Przeprowadź sekcję myszy, aby usunąć cały przewód pokarmowy (tj. Od żołądka do odbytnicy), krezkowy węzeł chłonny (MLN), płuca, śledzionę i wątrobę. Umieść je na szalkach Petriego za pomocą kleszczy i nożyczek2,4.
  9. Umieścić szalkę Petriego zawierającą eksplantowane narządy w komorze obrazowania i uzyskać obrazy BLI zgodnie z krokami 3.1 - 3.6.
  10. Po uzyskaniu obrazu przenieś eksplantowane narządy do form próbnych zawierających związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Zamrozić formy w temperaturze -80 °C za pomocą suchego lodu. Wykonaj immunohistochemię przy użyciu przeciwciała anty-lucyferazy na zamrożonych skrawkach, aby potwierdzić obecność hMSCs16.
  11. Aby określić ilościowo natężenie światła, użyj narzędzia obszaru zainteresowania (ROI) w palecie narzędzi16,19. Wybierz ramkę ROI i przenieś ją do obszaru zainteresowania na obrazie. Kliknij "Pomiar ROI" i zapisz dane w formacie pliku SEQ. Wyeksportuj dane jako plik .txt i użyj oprogramowania statystycznego do wykonania podstawowych testów statystycznych w celu kwantyfikacji16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje, że hMSC można transdukować potrójnym reporterem z wysoką wydajnością, przy zachowaniu ich właściwości komórek macierzystych. Transdukowane hMSC można wizualizować w czasie rzeczywistym za pomocą BLI (Rysunek 1C, Rysunek 3). Ta nowatorska, prowadzona pod kontrolą ultradźwięków iniekcja hMSC do lewej komory myszy SAMP zapewnia bardzo wysoki wskaźnik sukcesu zabiegu, umożliwiając szy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniu tym opisano nowatorską technikę dosercowego wstrzykiwania hMSC pod kontrolą ultradźwięków w mysim modelu eksperymentalnej CD w jelicie cienkim. Technika ta ma bardzo wysoki wskaźnik przeżycia i sukcesu, ponieważ trajektorię igły można dostosować na podstawie obrazów lewej komory myszy w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości, dostarczonych przez ultradźwięki. Zaletą dostarczania do lewej komory jest to, że hMSC są następnie rozprowadzane dotętniczo i omijają krążenie żylne, unikając w ten sposób agregacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Maneesh Dave jest wspierany przez PR141774 grantów Departamentu Obrony oraz Nagrodę Rozwoju Kariery Fundacji Crohna i Colitis w Ameryce. Laboratorium Fabio Cominelli jest wspierane przez granty NIH DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) i DK07948 (FC). Laboratorium Arnolda Caplana jest częściowo wspierane przez Fundację L. Davida i E. Virginii Baldwinów. Agencje finansujące nie odgrywały żadnej roli w badaniu, analizie ani pisaniu manuskryptu. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM-LG   Gibco31600-091
0,25% trypsyna-EDTAGibco25-200-072
Siarczan proteamineSigma AldrichP4020-1G
D-LucyferinGoldbioluck-500
Surowica płoduGibco26140-079
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyGibco15240-062
PBSHyCloneSH30256.01
Kolby do bibułek 175 cmCorning431080
Kolby do cięcia tkanek 75 cmCorning430720
Probówki wirówkoweCrysalgen23-2265
Tissue-Plus Związek O.C.T.Fisher HealthCare4585
Cryomold StandardTissue-Tek 4557
Lenti-Pac System pakowania ekspresji HIVGeneCopoeiaHPK-LVTR-20 
Waciki jonidynowe powidonuMedlineMDS093901
Krem do depilacjiNairN/A
Isoflurane Piramal Helathcare NDC 66794 013 25
Kleszcze Fine Science Tools11200-33
Nożyczki preparacyjne (Wagner)Fine Science ToolsWagner 14068-12
Maść weterynaryjna PuralubePuralubeNDC 17033-211-38
Żel do transmisji ultradźwięków Aquasonic 100laboratories01 08
Szalka PetriegoFisher ScientificFB0875711A
MyszySAMPCleveland Digestive Disease Research Core Center
Myszy AKRCleveland Digestive Disease Research Core Centre
System obrazowania Vevo 770  Visual Sonics, Toronto, Kanada
  System serii widma IVIS PerkinElmer, Waltham, MA
Oprogramowanie do żywego obrazu CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA
Potrójny reporterUprzejmie dostarczony przez Dr. Zheng-Hong Lee, CWRU, (cytat 19)
Parker

Bibliografia

  1. Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
  2. Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
  3. Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
  4. Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
  5. Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
  6. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  7. Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
  8. Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
  9. Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
  10. Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
  13. English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
  16. Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
  17. Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
  18. Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
  19. Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
  20. Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
  21. Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
  22. Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
  23. Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
  24. Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie bioluminescencyjnepotrójny system reporterowyhoming do jelita cienkiegomodel myszy SAMPwskaźnik sukcesu dostarczania komórekanaliza przewodu pokarmowego
Wstrzyknięcie dosercowe pod kontrolą ultradźwięków ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia naprowadzania do jelita do stosowania w mysich modelach eksperymentalnych chorób zapalnych jelit
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.