Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

Podsumowanie

Nierównomierna utrata podłoża z płytek mikromiareczkowych wpływa na odtwarzalność jednorodnego tworzenia sferoidów guza wielokomórkowego. Poprawa warunków hodowli w celu zmniejszenia znacznych strat pożywki poprawi odtwarzalność tworzenia sferoidów oraz wyniki testów opartych na sferoidach z wykorzystaniem techniki nakładania cieczy.

Streszczenie

Modele nowotworów, które ściśle imitują warunki in vivo, stają się coraz bardziej popularne w odkrywaniu i opracowywaniu leków do badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) skutecznie naśladują warunki fizjologiczne guzów litych, co czyni je doskonałymi modelami in vitro do optymalizacji odprowadzeń i walidacji celu. Spośród różnych dostępnych technik hodowli MCTS, metoda płynnego nakładania agarozy jest jedną z najtańszych metod wytwarzania MCTS. Jednak niezawodny transfer kultur MCTS przy użyciu płynnego nakładania do wysokoprzepustowych badań przesiewowych może być zagrożony przez szereg ograniczeń, w tym powlekanie płytek mikromiareczkowych (MP) agarozą i nieodtwarzalność równomiernego tworzenia MCTS we wszystkich studzienkach. MP są znacznie podatni na efekty krawędziowe, które wynikają z nadmiernego parowania pożywki z zewnętrznej strony płytki, uniemożliwiając użycie całej płytki do testów narkotykowych. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowe ulepszenia techniczne techniki nakładania cieczy w celu zwiększenia skalowalności i odtwarzalności jednolitego tworzenia MCTS. Ponadto przedstawiono szczegółowe informacje na temat prostego, półautomatycznego i uniwersalnego narzędzia programowego do oceny cech MCTS po leczeniu farmakologicznym.

Wprowadzenie

Komórki rakowe w nowotworach są fizjologicznie ułożone w złożoną, trójwymiarową (3D) strukturę otoczoną macierzą zewnątrzkomórkową i oddziałującymi komórkami. Ponieważ prawie wszystkie komórki w tkankach znajdują się w środowisku 3D, potrzeba bardziej fizjologicznie istotnych modeli nowotworów in vitro, które naśladują cechy guza, zaowocowała opracowaniem kilku technik hodowli 3D^1,2,3. Modele te stają się obecnie podstawowymi narzędziami badawczymi do badania roli mikrośrodowiska guza w przerzutach i odpowiedzi komórek na terapie w 3D². Co wię....

Protokół

1. Przygotowanie płytek pokrytych agarozą

1. Odważ 0,75 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia i dodaj ją do 100 mL pożywki McCoy's 5A (z czerwienią fenolową lub bez niej) bez surowicy. Podgrzewaj roztwór w mikrofalówce, mieszając co 1-2 min, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Poddaj roztwór autoklawowaniu w celu sterylizacji.
2. Ostudź autoklawowaną agarozę do około 70 °C i przefiltruj ją przez filtr lejkowy 0,22 µm o pojemności 500 mL za pomocą filtracji próżniowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Jeśli nie zamierzasz użyć całego roztworu od razu, rozdziel przefiltrowany 0,75% roztwór agarozy (FAS) na mniejsze objętości. Przechowuj t....

Wyniki

Nierównomierne ubytki pożywki, szczególnie w studzienkach peryferyjnych, są często spotykanym problemem w mikroplatekach (MPs) o małych objętościach hodowli. Znacznie poprawione warunki hodowli, takie jak inkubatory z precyzyjnie kontrolowanymi systemami temperatury i wilgotności oraz mikroplateki i pokrywy ograniczające parowanie, zmniejszają istotne straty pożywki w studzienkach⁸. Aby zmierzyć względne parowanie, do każdej studzienki dodano równe objętości pomara.......

Dyskusja

Powlekanie płytek TC z 384 studniami filtrowaną agarozą

Standardową praktyką w technice LOT jest stosowanie agarozy o niskiej temperaturze topnienia w stężeniu 1-1,5% do powlekania płytek, co wymaga utrzymywania agarozy i/lub jednostki dozującej w cieple, aby zapobiec żelowaniu agarozy⁶. Żelowanie agarozy może być problematyczne podczas przygotowywania wielu płytek przy użyciu kaset dozujących z małymi otworami rurek o średnicy od 0,2 do 0,4 mm. Aby wyeliminować potencjaln.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9414	Niskotopliwy
McCOY's 5A Medium	Sigma-Aldrich	M8403
" szybki" Filtr Filtermax	TPP	99505	0,22 μ m, 500 ml
Multidrop™ Dozownik odczynników Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300
z małą tubą	Thermo Fisher Scientific	24073295	Metalowa końcówka
384-dołkowa płytka TC	PerkinElmer	6057308	Typ płytki - CellCarrier
Standardowa kaseta dozująca rurki	Thermo Fisher Scientific	24072670
MicroClime Środowiskowa pokrywka	Labcyte	LLS-0310
DMSO	Sigma	D4540
(SteriStore )	HighRes Biosolutions	23641	Nr. seryjny: D00384
Dozownik do myjek do mikropłytek	Nieokreślony model BioTek		: EL406
System obrazowania o wysokiej zawartości (CellVoyager)	Yokogawa Electric	Corporation	Nieokreślony model: CV7000
Orange G	New England Biolabs	B7022S
TrypLE i handel; Ekspresyjny odczynnik do dysocjacji komórek rekombinowanych	Thermo Fisher Scientific	12604021	Bez czerwieni fenolowej

Kaseta dozująca Inkubator obrotowy