Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55403

⸱

7 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

W tym artykule

Podsumowanie

Nierównomierna utrata podłoża z płytek mikromiareczkowych wpływa na odtwarzalność jednorodnego tworzenia sferoidów guza wielokomórkowego. Poprawa warunków hodowli w celu zmniejszenia znacznych strat pożywki poprawi odtwarzalność tworzenia sferoidów oraz wyniki testów opartych na sferoidach z wykorzystaniem techniki nakładania cieczy.

Streszczenie

Modele nowotworów, które ściśle imitują warunki in vivo, stają się coraz bardziej popularne w odkrywaniu i opracowywaniu leków do badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) skutecznie naśladują warunki fizjologiczne guzów litych, co czyni je doskonałymi modelami in vitro do optymalizacji odprowadzeń i walidacji celu. Spośród różnych dostępnych technik hodowli MCTS, metoda płynnego nakładania agarozy jest jedną z najtańszych metod wytwarzania MCTS. Jednak niezawodny transfer kultur MCTS przy użyciu płynnego nakładania do wysokoprzepustowych badań przesiewowych może być zagrożony przez szereg ograniczeń, w tym powlekanie płytek mikromiareczkowych (MP) agarozą i nieodtwarzalność równomiernego tworzenia MCTS we wszystkich studzienkach. MP są znacznie podatni na efekty krawędziowe, które wynikają z nadmiernego parowania pożywki z zewnętrznej strony płytki, uniemożliwiając użycie całej płytki do testów narkotykowych. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowe ulepszenia techniczne techniki nakładania cieczy w celu zwiększenia skalowalności i odtwarzalności jednolitego tworzenia MCTS. Ponadto przedstawiono szczegółowe informacje na temat prostego, półautomatycznego i uniwersalnego narzędzia programowego do oceny cech MCTS po leczeniu farmakologicznym.

Wprowadzenie

Komórki rakowe w nowotworach są fizjologicznie ułożone w złożoną, trójwymiarową (3D) strukturę otoczoną macierzą zewnątrzkomórkową i oddziałującymi komórkami. Ponieważ prawie wszystkie komórki w tkankach znajdują się w środowisku 3D, potrzeba bardziej fizjologicznie istotnych modeli nowotworów in vitro, które naśladują cechy guza, zaowocowała opracowaniem kilku technik hodowli 3D1,2,3. Modele te stają się obecnie podstawowymi narzędziami badawczymi do badania roli mikrośrodowiska guza w przerzutach i odpowiedzi komórek na terapie w 3D2. Co więcej, w porównaniu z dwuwymiarowymi (2D) hodowlami komórkowymi 4, modele 3D pozwalają lepiej zrozumieć interakcje guz-zręb, które wpływają na szlaki sygnalizacji komórkowej.

Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTSes) linii komórek nowotworowych są często używane w modelach hodowli komórkowych 3D ze względu na ich względną bliskość do nowotworów in vivo. Spośród kilku stosowanych technik, technika nakładania płynem (LOT) wytwarzania MCTS na płytkach pokrytych agarozą zyskała znaczne zainteresowanie optymalizacją ołowiu i walidacją celu5,6,7,8,9,10,11. Wynika to z ostatnich badań, w których udało się przeprowadzić pilotażowe badania przesiewowe bibliotek złożonych w kulturach MCTS przy użyciu LOT6,7. Jednak zmienność morfologii i wzrostu MCTS między studniami spowodowana nierównomierną utratą pożywki spowodowaną parowaniem jest częstą przeszkodą, która towarzyszy LOT przy użyciu płytek do mikromiareczkowania (MP). W związku z tym powstawanie niejednorodnych MCTS wpływa negatywnie na istotność i istotność danych z testów farmakologicznych8,12,13. Oprócz kwestii odtwarzalności, innym praktycznym problemem, który wpływa na wysokoprzepustowe testy oparte na LOT, jest powlekanie MP agarozą podczas korzystania z automatycznych urządzeń dozujących ciecze. Chociaż jednostka dozująca może być utrzymywana w cieple, aby zapobiec żelowaniu agarozy, zatkanie kasety dozującej i rurki jest potencjalnym problemem dla systemów zrobotyzowanych6.

Aby przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań, niedawno opracowaliśmy kilka modyfikacji w LOT dla kultury MCTS8. Modyfikacje te opierają się głównie na możliwych sposobach zapobiegania nierównomiernym stratom medium z MP za pomocą instrumentów, które są powszechnie spotykane w wysokowydajnych laboratoriach przesiewowych. Szczegółowa procedura zmodyfikowanej LOT do generowania MCTS o jednolitych rozmiarach i odtwarzalności na płytkach 384-dołkowych (WP) została przedstawiona tutaj. W manuskrypcie przedstawiono również półautomatyczną procedurę oceny wielkości MCTS, szczególnie w częściowo rozpadłych, leczonych lekami MCTS, które nie mają jasno określonej granicy pomiaru pola przekroju poprzecznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie płytek pokrytych agarozą

  1. Odważ 0,75 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia i dodaj ją do 100 mL pożywki McCoy's 5A (z czerwienią fenolową lub bez niej) bez surowicy. Podgrzewaj roztwór w mikrofalówce, mieszając co 1-2 min, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Poddaj roztwór autoklawowaniu w celu sterylizacji.
  2. Ostudź autoklawowaną agarozę do około 70 °C i przefiltruj ją przez filtr lejkowy 0,22 µm o pojemności 500 mL za pomocą filtracji próżniowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Jeśli nie zamierzasz użyć całego roztworu od razu, rozdziel przefiltrowany 0,75% roztwór agarozy (FAS) na mniejsze objętości. Przechowuj ten gotowy do użycia roztwór agarozy aseptycznie w chłodni lub lodówce w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 4 tygodnie.
  3. Przymocuj małą probówkę z kasetą dozującą z plastikową lub metalową końcówką do dozownika odczynników Combi, a następnie przepłucz kasetę 70% etanolem (EtOH), a następnie sterylnym solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  4. Przed użyciem podgrzej przechowywaną alikwot FAS w mikrofalówce, aby ją roztopić. Wypełnij kasetę dozującą roztworem agarozy i pokryj 384-dołkowe „specjalne” mikropłytki do hodowli tkankowej (TC) 15 µL FAS. Pozostaw agarozę na płytce do wystygnięcia przez 15-20 min przed zasiewem komórek. Przechowuj płytki pokryte agarozą aseptycznie, zapakowane w worek polietylenowy w chłodni lub w temperaturze 4 °C, z dala od bezpośredniego światła.
    UWAGA: Unikaj wielokrotnego podgrzewania 0,75% FAS, aby zapobiec zmianie stężenia agarozy w roztworze zapasowym. Płytki pokryte agarozą mogą być przechowywane do 2 tygodni w wyżej wymienionych warunkach. FAS nie wymaga podgrzewania podczas pokrywania płytek.
  5. Oczyść kasetę dozującą, przepłukując ją sterylną wodą o temperaturze 70-80 °C, aby usunąć pozostałą agarozę z końcówek i rurek kasety.

2. Hodowla komórek i tworzenie MCTS

  1. Hodować ludzkie komórki raka jelita grubego HCT116 zgodnie z wcześniejszym opisem8.
  2. Wyjąć z przechowywania w niskiej temperaturze wymaganą liczbę 384-dołkowych mikropłytek TC-treated pokrytych agarozą i pozostawić je na 15 min w temperaturze pokojowej (RT) w celu wyrównania temperatury.
  3. Przygotuj dozownik odczynników Combi do wysiewu komórek, przepłukując standardową kasetę dozującą do probówek 70% EtOH oraz sterylnym PBS. Dostosuj objętość wysiewu do wymaganej µL oraz prędkość dozowania na średnią, używając przycisków ustawień ręcznych na dozowniku.
    UWAGA: Cały proces wysiewania komórek jest przeprowadzany w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  4. Oddziel komórki adherentne od kolby do hodowli tkankowej, używając rekombinowanego enzymu dysocjującego komórki. Przygotuj w sterylnym zlewce zapas zawiesiny komórkowej z komórkami szczepionkowymi o gęstości 2,5 x 104 komórek/ml na studzienkę w 50 µL pełnego pożywki wzrostowej. Przy wysiewaniu więcej niż jednej płytki 384-WP należy mieszać komórki za pomocą mieszadła magnetycznego, aby zapobiec ich osiadaniu na dnie zlewki.
  5. Pozostawić płytki na 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez 15 min przy 4 x g.
  6. W międzyczasie należy wziąć pokrywkę środowiskową ograniczającą parowanie i napełnić ją 8 ml sterylnej wody H2O2lub 5% dimetylosulfotlenku (DMSO) na krótkich bokach (lewym i prawym) przy użyciu pipety 5 ml (Rysunek 1A). Najpierw należy nalać 4 ml płynu wypełniającego do lewego koryta, powolnym ruchem przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół. Powtórzyć ten krok w przypadku prawego koryta.
    UWAGA: Należy upewnić się, że ciecz dodana do bocznych korytek nie łączy się w centralnej części pokrywy i pozostawić przerwę w celu wymiany gazowej (Rycina 1A). Dodanie nadmiaru H2O prowadzi do przesiąkania H2O na zewnętrzną stronę pokrywki, a następnie do zewnętrznych studzienek płytek TC z 384 studzienkami.
  7. Napełnij zbiornik na ciecz płytki TC z 384 dołkami sterylnym H2i zastąp zwykłe pokrywki płytek pokrywkami środowiskowymi wypełnionymi cieczą (Rycina 2A).
  8. Umieść płytki w 37 °C inkubator obrotowy z wilgotnością 95% i 5% CO22, i 20% O22i pozostawić komórki do agregacji w MCTSE przez 4 dni. W kolejnych dniach należy unikać zbyt długiego otwierania drzwi inkubatora, aby zapobiec gwałtownemu spadkowi poziomu wilgotności.

3. Wymiana pożywki przy użyciu systemu robotycznego

  1. W 4. dniu po utworzeniu MCTS, za pomocą automatycznego dozownika myjki do mikropłytek, dodać 30 µL uprzednio ogrzanej pożywki do każdej studzienki. Pozostawić MCTS do wzrostu przez kolejne 3 dni. Pożywkę wymieniać regularnie co 3 dni, aż sferoidy osiągną pożądaną wielkość do przeprowadzenia eksperymentu.
  2. Aby odessać określoną objętość pożywki z każdej studzienki, empirycznie dostosować wysokość z głowicy myjki. Odessać 30 µL pożywki z każdej studzienki i zastąpić ją 30 µL świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki.
    UWAGA: Prędkość dozowania oraz prędkość opuszczania głowicy myjki do studzienek należy ustawić na najniższą wartość, aby zminimalizować turbulencje w studzienkach.

4. Obrazowanie wysokotreściowe MCTS i półautomatyczna analiza obrazu

  1. Wykonaj obrazowanie MCTS w zautomatyzowanym systemie obrazowania wysokoprzepustowego (high-content), używając obiektywu powietrznego 4X (N.A. 16).
  2. Ustaw czas ekspozycji na 11 ms oraz binning na 4 x 4. Dostosuj liczbę i odstępy stosów z-stacks oraz binning pikseli zgodnie z wymogami eksperymentu, aby uchwycić cały MCTS w każdej studzience.
  3. Przetwarzaj obrazy krok po kroku, zgodnie z opisem w pliku „readme”, korzystając z wewnętrznej procedury napisanej w języku programowania.
    UWAGA: Kod .m oraz pliki readme .txt są dostępne jako uzupełniające pliki z kodem (Rysunek 1B). Procedura ta mierzy powierzchnię MCTS, osie główną i pomocniczą, obwód oraz zwartość (solidity) na podstawie obrazów 2D.

Prawidłowe napełnienie vs nadmiar cieczy w płytce; schemat blokowy preprocessingu i segmentacji dla analizy obrazu.
Rysunek 1: Przygotowanie pokrywek środowiskowych oraz schemat blokowy rutyny półautomatycznej. (A) Obraz pokrywki środowiskowej ograniczającej parowanie, napełnionej prawidłową (lewo) oraz nadmierną (prawo) ilością cieczy wypełniającej (tutaj 5% DMSO). Strzałka wskazuje rynienkę na krótszym boku służącą do dodawania cieczy. Gwiazdka pokazuje przerwę na środku pokrywki po dodaniu prawidłowej objętości DMSO. (B) Schemat przedstawiający kroki wchodzące w skład rutyny półautomatycznej analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nierównomierna utrata pożywki, szczególnie z studzienek peryferyjnych, jest często występującym problemem w przypadku wielodołkowych płyt (MPs) o małych objętościach hodowli. Znacznie poprawione warunki hodowli, takie jak inkubatory z dobrze kontrolowanymi systemami temperatury i wilgotności oraz płyty i pokrywy ograniczające parowanie, redukują istotną utratę pożywki pomiędzy studzienkami8. Aby zmierzyć względne parowanie, do każdej studzienki dodano równe objętoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powlekanie płytek TC z 384 studzienkami filtrowaną agarozą

Standardową praktyką w LOT jest stosowanie 1-1,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do pokrywania płytek, co wymaga utrzymywania agarozy i/lub jednostki dozującej w cieple, aby zapobiec żelowaniu agarozy6. Żelowanie agarozy może stanowić problem podczas przygotowywania wielu płytek przy użyciu kaset do dozowania cieczy z małymi otworami rurek o średnicy od 0,2 do 0,4 mm. Aby wyeliminować potencjalny problem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z czeskiego Ministerstwa Edukacji, Młodzieży i Sportu (LO1304) oraz Agencji Technologicznej Republiki Czeskiej (TE01020028). Autorzy pragną podziękować dr Lakshmanowi Varanasiemu za wykonanie zdjęć pokryw środowiskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma-AldrichA9414Niskotopliwy
McCOY's 5A MediumSigma-AldrichM8403
" szybki" Filtr FiltermaxTPP995050,22 μ m, 500 ml
Multidrop™ Dozownik odczynników Combi Thermo Fisher Scientific5840300
z małą tubą Thermo Fisher Scientific24073295Metalowa końcówka 
384-dołkowa płytka TC PerkinElmer6057308Typ płytki - CellCarrier
Standardowa kaseta dozująca rurkiThermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Środowiskowa pokrywkaLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
(SteriStore )HighRes Biosolutions23641Nr. seryjny: D00384
Dozownik do myjek do mikropłytek Nieokreślony model BioTek: EL406 
System obrazowania o wysokiej zawartości (CellVoyager)Yokogawa ElectricCorporationNieokreślony model: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE i handel; Ekspresyjny odczynnik do dysocjacji komórek rekombinowanychThermo Fisher Scientific12604021Bez czerwieni fenolowej
Kaseta dozująca Inkubator obrotowy

Bibliografia

  1. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  2. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
  4. Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
  5. Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).
  6. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
  7. Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
  8. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
  9. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).
  10. Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
  11. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  12. Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
  13. Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
  14. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103(2016).
  15. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  16. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
  17. Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika nak adania warstwy ciek ejRedukcja parowaniaPowlekanie p yt mikrotitracyjnychPrzygotowanie roztworu agarozyProtok wysiewania kom rekWarunki wzrostu sferoid wZautomatyzowana analiza obrazowaniaOcena dzia ania lekuNiwelowanie efektu brzegowego
Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.