Artykuł metodologiczny

Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

DOI:

10.3791/55403

⸱

7 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nierównomierna utrata podłoża z płytek mikromiareczkowych wpływa na odtwarzalność jednorodnego tworzenia sferoidów guza wielokomórkowego. Poprawa warunków hodowli w celu zmniejszenia znacznych strat pożywki poprawi odtwarzalność tworzenia sferoidów oraz wyniki testów opartych na sferoidach z wykorzystaniem techniki nakładania cieczy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele nowotworów, które ściśle imitują warunki in vivo, stają się coraz bardziej popularne w odkrywaniu i opracowywaniu leków do badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) skutecznie naśladują warunki fizjologiczne guzów litych, co czyni je doskonałymi modelami in vitro do optymalizacji odprowadzeń i walidacji celu. Spośród różnych dostępnych technik hodowli MCTS, metoda płynnego nakładania agarozy jest jedną z najtańszych metod wytwarzania MCTS. Jednak niezawodny transfer kultur MCTS przy użyciu płynnego nakładania do wysokoprzepustowych badań przesiewowych może być zagrożony przez szereg ograniczeń, w tym powlekanie płytek mikromiareczkowych (MP) agarozą i nieodtwarzalność równomiernego tworzenia MCTS we wszystkich studzienkach. MP są znacznie podatni na efekty krawędziowe, które wynikają z nadmiernego parowania pożywki z zewnętrznej strony płytki, uniemożliwiając użycie całej płytki do testów narkotykowych. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowe ulepszenia techniczne techniki nakładania cieczy w celu zwiększenia skalowalności i odtwarzalności jednolitego tworzenia MCTS. Ponadto przedstawiono szczegółowe informacje na temat prostego, półautomatycznego i uniwersalnego narzędzia programowego do oceny cech MCTS po leczeniu farmakologicznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki rakowe w nowotworach są fizjologicznie ułożone w złożoną, trójwymiarową (3D) strukturę otoczoną macierzą zewnątrzkomórkową i oddziałującymi komórkami. Ponieważ prawie wszystkie komórki w tkankach znajdują się w środowisku 3D, potrzeba bardziej fizjologicznie istotnych modeli nowotworów in vitro, które naśladują cechy guza, zaowocowała opracowaniem kilku technik hodowli 3D1,2,3. Modele te stają się obecnie podstawowymi narzędziami badawczymi do badania roli mikrośrodowiska guza w przerzutach i odpowiedzi komórek na terapie w 3D2. Co więcej, w porównaniu z dwuwymiarowymi (2D) hodowlami komórkowymi 4, modele 3D pozwalają lepiej zrozumieć interakcje guz-zręb, które wpływają na szlaki sygnalizacji komórkowej.

Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTSes) linii komórek nowotworowych są często używane w modelach hodowli komórkowych 3D ze względu na ich względną bliskość do nowotworów in vivo. Spośród kilku stosowanych technik, technika nakładania płynem (LOT) wytwarzania MCTS na płytkach pokrytych agarozą zyskała znaczne zainteresowanie optymalizacją ołowiu i walidacją celu5,6,7,8,9,10,11. Wynika to z ostatnich badań, w których udało się przeprowadzić pilotażowe badania przesiewowe bibliotek złożonych w kulturach MCTS przy użyciu LOT6,7. Jednak zmienność morfologii i wzrostu MCTS między studniami spowodowana nierównomierną utratą pożywki spowodowaną parowaniem jest częstą przeszkodą, która towarzyszy LOT przy użyciu płytek do mikromiareczkowania (MP). W związku z tym powstawanie niejednorodnych MCTS wpływa negatywnie na istotność i istotność danych z testów farmakologicznych8,12,13. Oprócz kwestii odtwarzalności, innym praktycznym problemem, który wpływa na wysokoprzepustowe testy oparte na LOT, jest powlekanie MP agarozą podczas korzystania z automatycznych urządzeń dozujących ciecze. Chociaż jednostka dozująca może być utrzymywana w cieple, aby zapobiec żelowaniu agarozy, zatkanie kasety dozującej i rurki jest potencjalnym problemem dla systemów zrobotyzowanych6.

Aby przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań, niedawno opracowaliśmy kilka modyfikacji w LOT dla kultury MCTS8. Modyfikacje te opierają się głównie na możliwych sposobach zapobiegania nierównomiernym stratom medium z MP za pomocą instrumentów, które są powszechnie spotykane w wysokowydajnych laboratoriach przesiewowych. Szczegółowa procedura zmodyfikowanej LOT do generowania MCTS o jednolitych rozmiarach i odtwarzalności na płytkach 384-dołkowych (WP) została przedstawiona tutaj. W manuskrypcie przedstawiono również półautomatyczną procedurę oceny wielkości MCTS, szczególnie w częściowo rozpadłych, leczonych lekami MCTS, które nie mają jasno określonej granicy pomiaru pola przekroju poprzecznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytek pokrytych agarozą

  1. Odważ 0,75 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia i dodaj ją do 100 ml pożywki McCoy's 5A (z czerwienią fenolową lub bez) bez surowicy. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej i mieszaj co 1-2 minuty, aby całkowicie rozpuścić agarozę. Autoklaw roztworu, aby go wysterylizować.
  2. Schłodzić autoklawowaną agarozę do około 70 °C i przefiltrować ją przez filtr o pojemności 500 ml i 0,22 μm przez filtrację próżniową w komorze z przepływem laminarnym. Podwielokrotnić 0,75% przefiltrowany roztwór agarozy (FAS) na mniejsze objętości, jeśli nie używa się całego roztworu na raz. Gotowy do użycia roztwór agarozy należy przechowywać w warunkach aseptycznych w chłodni lub lodówce o temperaturze 4°C przez okres do 4 tygodni.
  3. Podłącz małą probówkę z plastikową lub metalową końcówką do dozownika odczynników Combi i zalej kasetę 70% etanolem (EtOH), a następnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w skrzynce przepływowej.
  4. Przed użyciem podgrzej przechowywaną porcję FAS w kuchence mikrofalowej, aby ją stopić. Zalać kasetę dozującą roztworem agarozy i pokryć 384-dołkowymi "specjalnymi" mikropłytkami poddanymi kulturom tkankowym (TC) 15 μl FAS. Pozostaw agarozę na talerzu do ostygnięcia przez 15-20 minut przed wysianiem komórek. Płytki pokryte agarozą należy przechowywać w sposób aseptyczny, zawinięty w worek polietylenowy w chłodni lub w temperaturze 4 °C, z dala od bezpośredniego światła.
    UWAGA: Unikać wielokrotnego podgrzewania 0,75% FAS, aby zapobiec zmianie stężenia agarozy w roztworze podstawowym. Płytki pokryte agarozą mogą być przechowywane do 2 tygodni w wyżej wymienionych warunkach. FAS nie wymaga podgrzewania podczas powlekania płyt.
  5. Wyczyść kasetę dozującą, zalewając ją sterylną wodą o temperaturze 70-80 °C, aby usunąć resztki agarozy z końcówek kasety i probówek.

2. Hodowla komórkowa i tworzenie MCTS

  1. Hodowla komórek HCT116 ludzkiego raka jelita grubego, zgodnie z wcześniejszym opisem8.
  2. Usunąć wymaganą liczbę pokrytych agarozą, 384-dołkowych, poddanych działaniu TC mikropłytek z chłodni i zrównoważyć je do temperatury pokojowej (RT) przez 15 minut.
  3. Przygotuj dozownik odczynnika Combi do wysiewu komórek, zalewając standardową kasetę dozującą probówkę 70% EtOH i sterylnym PBS. Dostosuj objętość wysiewu do wymaganej μl, a prędkość dozowania do średniej za pomocą przycisków ustawień ręcznych na dozowniku.
    UWAGA: Cały proces wysiewu komórek odbywa się w sterylnych warunkach i w komorze z przepływem laminarnym.
  4. Oddzielić przylegające komórki od kolby do hodowli tkankowej za pomocą rekombinowanego enzymu dysocjacji komórek. Przygotować zawiesinę komórkową w sterylnej zlewce z komórkami nasiennymi o gęstości 2,5 x 104 komórki/ml na studzienkę w 50 μl kompletnej pożywki wzrostowej. W przypadku wysiewu więcej niż jednego 384-WP, wymieszaj komórki za pomocą mieszadła magnetycznego, aby zapobiec ich osiadaniu na dnie zlewki.
  5. Pozostawić płytki na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przez 15 minut przy 4 x g.
  6. W międzyczasie weź pokrywkę środowiskową redukującą parowanie i napełnij ją 8 ml sterylnegoH2Olub 5% dimetylosulfotlenku (DMSO) po krótszych bokach (po lewej i prawej stronie) za pomocą pipety o pojemności 5 ml (Rysunek 1A). Najpierw wlej 4 ml płynu do napełniania do koryta po lewej stronie, powoli przesuwając końcówkę pipety w górę iw dół. Powtórz ten krok z rynną po prawej stronie.
    UWAGA: Upewnij się, że ciecz dodawana do bocznych koryt nie łączy się na środku pokrywy i pozostaw przerwę na wymianę gazową (Rysunek 1A). Dodanie nadmiaruH2Opowoduje przesiąkanieH2Ona zewnątrz pokrywy, a następnie do zewnętrznych studzienek 384-dołkowych płytek TC.
  7. Napełnij zbiornik cieczy 384-dołkowej płytki TC sterylnymH2Oi zastąp zwykłe pokrywki płytki pokrywkami środowiskowymi wypełnionymi płynem (Rysunek 2A).
  8. Umieść płytki w inkubatorze obrotowym o temperaturze 37 °C o wilgotności 95%, 5% CO2 i 20% O2 i pozwól komórkom zagregować się w MCTS przez 4 dni. W kolejnych dniach należy unikać zbyt długiego otwierania drzwi inkubatora, aby zapobiec nagłemu spadkowi poziomu wilgotności.

3. Wymiana medium za pomocą systemu zrobotyzowanego

  1. W 4 dniu po utworzeniu MCTS dodać 30 μl wstępnie podgrzanego podłoża do dołka za pomocą automatycznego dozownika do myjki do mikropłytek. Pozwól MCTS rosnąć przez dodatkowe 3 dni. Wymieniaj podłoże regularnie co 3 dni, aż osiągną pożądany rozmiar do eksperymentów.
  2. Aby zassać określoną objętość medium z każdej studzienki, empirycznie wyreguluj wysokość z kolektora spryskiwacza. Odessać 30 μl podłoża na studzienkę i zastąpić go 30 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki.
    UWAGA: Ustaw prędkość dozowania i prędkość, z jaką kolektor spryskiwacza zjeżdża do studzienek z najniższą prędkością, aby zminimalizować turbulencje w studzienkach.

4. Obrazowanie MCTS o wysokiej zawartości i półautomatyczna analiza obrazu

  1. Zobrazuj MCTS w zautomatyzowanym systemie obrazowania o wysokiej zawartości przy użyciu obiektywu pneumatycznego 4X (N.A. 16).
  2. Ustaw czas ekspozycji na 11 ms, a binning na 4 x 4. Dostosuj liczbę i odstępy między stosami z oraz grupowanie pikseli zgodnie z potrzebami, aby eksperyment przechwycił cały MCTS na studzienkę.
  3. Przetwarzaj obrazy krok po kroku, zgodnie z opisem w pliku "readme", korzystając z wewnętrznej procedury napisanej w języku programowania.
    UWAGA: Plik .m kodu i plik readme .txt są dostępne jako dodatkowe pliki kodu (Rysunek 1B). Procedura mierzy obszar MCTS, osie główne i pomocnicze, obwód i bryłę na podstawie obrazów 2D.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przygotowanie pokrywek środowiskowych i schemat blokowy procedury półautomatycznej. (A) Obraz pokrywy środowiskowej redukującej parowanie, wypełnionej odpowiednią (po lewej) i nadmiarową (po prawej) ilością płynu wypełniającego (tutaj, 5% DMSO). Strzałka wskazuje rynnę po krótszym boku do dodawania płynu. Gwiazdka pokazuje przerwę na środku pokrywy po dodaniu odpowiedniej objętości DMSO. (B) Przepływ pracy przedstawiający etapy związane z procedurą półautomatycznej analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nierównomierna utrata podłoża, szczególnie z peryferyjnych studni, jest często spotykanym problemem u parlamentarzystów o małej objętości kultury. Znacznie ulepszone warunki hodowli, takie jak inkubatory z dobrze kontrolowanymi systemami temperatury/nawilżania oraz redukujące parowanie MP i pokrywy płytkowe, zmniejszają znaczne straty pożywki w studzienkach8. Aby zmierzyć względne parowanie, do każdej studzienki dodano równe objętości pomarańczy G (OG), a zmianę ab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powlekanie 384-dołkowych płytek TC filtrowaną agarozą

Standardową praktyką w LOT jest stosowanie agarozy o niskiej temperaturze topnienia 1-1,5% do powlekania płytek, co wymaga utrzymywania ciepła agarozy i/lub jednostki dozującej, aby zapobiec żelowaniu agarozy6. Żelowanie agarozy jest potencjalnym problemem podczas przygotowywania wielu płytek przy użyciu kaset dozujących ciecze z małymi otworami na rurki o średnicy od 0,2 do 0,4 mm. Aby przezwyciężyć potencjalny problem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z czeskiego Ministerstwa Edukacji, Młodzieży i Sportu (LO1304) oraz Agencji Technologicznej Republiki Czeskiej (TE01020028). Autorzy pragną podziękować dr Lakshmanowi Varanasiemu za wykonanie zdjęć pokryw środowiskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma-AldrichA9414Niskotopliwy
McCOY's 5A MediumSigma-AldrichM8403
" szybki" Filtr FiltermaxTPP995050,22 μ m, 500 ml
Multidrop™ Dozownik odczynników Combi Thermo Fisher Scientific5840300
z małą tubą Thermo Fisher Scientific24073295Metalowa końcówka 
384-dołkowa płytka TC PerkinElmer6057308Typ płytki - CellCarrier
Standardowa kaseta dozująca rurkiThermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Środowiskowa pokrywkaLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
(SteriStore )HighRes Biosolutions23641Nr. seryjny: D00384
Dozownik do myjek do mikropłytek Nieokreślony model BioTek: EL406 
System obrazowania o wysokiej zawartości (CellVoyager)Yokogawa ElectricCorporationNieokreślony model: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE i handel; Ekspresyjny odczynnik do dysocjacji komórek rekombinowanychThermo Fisher Scientific12604021Bez czerwieni fenolowej
Kaseta dozująca Inkubator obrotowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  2. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
  4. Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
  5. Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).
  6. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
  7. Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
  8. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
  9. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).
  10. Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
  11. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  12. Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
  13. Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
  14. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103(2016).
  15. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  16. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
  17. Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika nak adania warstwy ciek ejRedukcja parowaniaPowlekanie p yt mikrotitracyjnychPrzygotowanie roztworu agarozyProtok wysiewania kom rekWarunki wzrostu sferoid wZautomatyzowana analiza obrazowaniaOcena dzia ania lekuNiwelowanie efektu brzegowego

Powiązane artykuły