Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55441

⸱

28 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CD Laboratory for the Restoration of Extremity Function, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Medical University of Vienna, 2Core Facility Imaging, Core Facilities, Medical University Vienna, 3Department of Hand, Plastic and Reconstructive Surgery, Burn Center, BG Trauma Center Ludwigshafen, Plastic and Hand Surgery, University of Heidelberg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Streszczenie

Kwantyfikacja populacji włókien mięśniowych dostarcza głębszego wglądu w skutki chorób, urazów i różnych innych czynników wpływających na skład mięśni szkieletowych. Różne czasochłonne metody są tradycyjnie stosowane do badania populacji włókien w wielu dziedzinach badań. Jednak niedawno opracowane metody immunohistochemiczne oparte na ekspresji białek łańcucha ciężkiego miozyny stanowią szybką alternatywę dla identyfikacji wielu rodzajów włókien w jednym przekroju. W tym miejscu przedstawiamy szybki, niezawodny i powtarzalny protokół poprawiający jakość barwienia, umożliwiający automatyczną akwizycję całych przekrojów i automatyczną kwantyfikację populacji włókien za pomocą ImageJ. W tym celu osadzone mięśnie szkieletowe są cięte w przekrojach, barwione za pomocą przeciwciał przeciwko ciężkim łańcuchom miozyny z drugorzędowymi przeciwciałami fluorescencyjnymi i DAPI do barwienia jąder komórkowych. Całe przekroje poprzeczne są następnie automatycznie skanowane za pomocą skanera do slajdów w celu uzyskania złożonych zdjęć o wysokiej rozdzielczości całej próbki. Następnie przeprowadza się analizy populacji włókien w celu ilościowego określenia wolnych, pośrednich i szybkich włókien przy użyciu zautomatyzowanego makra dla ImageJ. Wcześniej wykazaliśmy, że ta metoda może niezawodnie identyfikować populacje włókien w stopniu ±4%. Ponadto metoda ta znacznie zmniejsza zmienność między użytkownikami i czas analiz przy użyciu platformy open source ImageJ.

Wprowadzenie

Skład mięśni szkieletowych ulega głębokim zmianom podczas procesów fizjologicznych, takich jak starzenie się1,2, exercise3,4,5,6,7, lub procesy patofizjologiczne, takie jak choroba8,9,10 lub trauma11. W związku z tym kilka dziedzin badań koncentruje się na skutkach strukturalnych tych procesów, aby zrozumieć zmiany funkcjonalne. Jednym z kluczowych aspektów decydujących o funkcjonowaniu mięśni jest skład włókien mięśniowych. Włókna mięśniowe wyrażają różne białka ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) i dlatego są klasyfikowane jako wolne, pośrednie lub szybkie włókna7,12,13,14,15,16,17. Fizjologicznie mięśnie mają różny skład włókien mięśniowych w zależności od ich funkcji w organizmie. Korzystając z typowania włókien mięśniowych, można określić ilościowo populacje włókien w celu określenia adaptacji do procesów fizjologicznych lub patofizjologicznych7,17. Historycznie rzecz biorąc, w celu rozróżnienia typów włókien mięśniowych zastosowano szereg czasochłonnych metod. W tym celu włókna mięśniowe sklasyfikowano albo na podstawie reaktywności ATPazy miozyny przy różnych poziomach pH, albo aktywności enzymów mięśniowych. Ponieważ nie można było ocenić różnych jakości włókien w jednej sekcji, potrzeba było wielu przekrojów, aby zidentyfikować wszystkie włókna mięśniowe i umożliwić ręczną kwantyfikację14,16,17,18,19,20,21,22. W przeciwieństwie do tego, w ostatnich publikacjach wykorzystano immunohistochemię (IHC) przeciwko białku ciężkiego łańcucha miozyny, aby szybko wybarwić wiele rodzajów włókien w jednym przekroju poprzecznym. Opierając się na zaletach tej procedury, jest ona obecnie uważana za złoty standard w analizie populacji włókien mięśniowych19,23,24. Korzystając z ulepszonych protokołów barwienia IHC, udało nam się niedawno wykazać, że w pełni automatyczne pozyskiwanie przekrojów poprzecznych całych mięśni, a następnie automatyczna kwantyfikacja włókien mięśniowych jest możliwa przy użyciu platformy open source ImageJ. W porównaniu z ręczną kwantyfikacją, nasza procedura zapewniła znaczne skrócenie czasu (około 10% ręcznych analiz) wymaganych na slajd, a jednocześnie była dokładna do ±4%25.

Ogólnym celem tej metody jest opisanie szybkiego, niezawodnego, niezależnego od użytkownika przewodnika do automatycznego oznaczania ilościowego włókien mięśniowych w całych mięśniach szczurów za pomocą platformy open source. Ponadto opisujemy potencjalne modyfikacje, które pozwoliłyby na zastosowanie go do innych okazów, takich jak myszy czy ludzkie mięśnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zabiegi z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi zgodnie z zaleceniami FELASA26. Przed badaniem uzyskano zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu oraz austriackiego Ministerstwa Badań i Nauki (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numer referencyjny: BMWF-66.009/0222-WF/II/3b/2014).

1. Żniwo mięśni

UWAGA: Poprzednia publikacja Meng et al.Dostępny jest 27 opisujący bardzo szczegółowo prawidłowe zamrażanie próbek mięśni.

  1. Uzyskać całe mięśnie lub tkankę wystarczającą do uzyskania całych przekrojów poprzecznych natychmiast po eutanazji zwierząt.
    1. Usuń cały mięsień od znieczulonego lub uśpionego szczura. Usuń całą tkankę łączną i ścięgna otaczające mięsień za pomocą kleszczy i nożyczek. W przypadku znieczulenia lub eutanazji należy postępować zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi FELASA28.
  2. Zważ mięśnie za pomocą skalibrowanej wagi precyzyjnej. Ten szybki krok pozwala na analizę porównawczą między próbkami mięśni, zwłaszcza po zabiegach interwencyjnych.
  3. Umieść mięsień w naczyniu wypełnionym w całości związkiem O.C.T., zgodnie z wielkością mięśnia z marginesem bezpieczeństwa około 1 mm ze wszystkich stron (np. wykonanym z folii aluminiowej).
  4. Zamrozić go w około 2 minutach wstępnie schłodzonego izopentanu przy użyciu ciekłego azotu. Na dnie pojemnika muszą zacząć pojawiać się białe kryształy.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny do zachowania prawidłowej architektury mięśnia, a tym samym umożliwia prawidłowe barwienie i analizę włókien27.
  5. Próbki zakonserwowane w O.C.T. przechowywać przez co najmniej 24 godziny w temperaturze -80 °C. Próbki mogą być jednak przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy, a nawet lat, jeśli są prawidłowo schłodzone.
  6. Wyciąć 10 μm przekrojów poprzecznych ze środkowej części mięśnia w temperaturze -20 °C za pomocą kriotomii. Jeśli cięcie z prędkością 10 μm nie jest możliwe, należy zwiększyć grubość w krokach co 2 μm do maksymalnie 20 μm. Na tym etapie niezbędne są wystarczająco ostre ostrza tnące.
  7. Zastosuj sekcje do szkiełek samoprzylepnych, aproksymując szkiełka do przekrojów poprzecznych. Przekroje automatycznie przykleją się do szkiełek samoprzylepnych. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc przed barwieniem.

2. Barwienie

UWAGA: Dostępna jest duża liczba przeciwciał przeciwko białkom łańcucha ciężkiego miozyny, jednak wysokiej jakości przeciwciała są niezbędne do automatycznego pozyskiwania i analizy. Rozcieńczenia i odniesienie do przeciwciał znajdują się w Tabeli 1. Aby uzyskać plik arkusza kalkulacyjnego do obliczenia prawidłowych rozcieńczeń i sprawdzenia liczby wymaganych ilości roztworu, zobacz Plik uzupełniający 1.

  1. Rozmrozić i wysuszyć zamrożone sekcje mięśni na powietrzu przez 10 minut przed zabiegiem barwienia.
  2. Preparaty należy dokładnie myć roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 0,05% Triton X przez 10 minut, a następnie przez 5 minut. Wykazano, że Triton znacznie poprawia jakość barwienia. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
  3. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu przez 2 minuty i obrysuj poszczególne przekroje na każdym szkiełku za pomocą pisaka hydrofobowego (aby zminimalizować wymaganą ilość przeciwciała) i pozwól na dodatkowe suszenie przez 15 minut.
  4. Zablokuj wszystkie preparaty PBS + 0,05% Triton X (PBST) zawierającym 10% koziej surowicy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Rozcieńczyć wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe (Tabela 1) w koktajlu PBS + 0,05% Triton X (PBST) zawierającym 10% surowicy koziej. Dokładnie wymieszać przed aplikacją. Triton X jest niezbędny do równomiernego barwienia całych przekrojów. Obliczyć około 30 μl pierwszorzędowego koktajlu przeciwciał na przekrój poprzeczny.
  6. W przypadku kroków 2.7-2.13 należy zapewnić wystarczającą ochronę przed światłem. Przyciemnione światła w pomieszczeniu i zakryte tace do barwienia zapewniają odpowiednią ochronę. Dodatkowo napełnij tackę do barwienia płynem na dnie, aby zapewnić wilgotne środowisko podczas barwienia i zapobiec wysychaniu.
  7. Nakładaj koktajle przeciwciał pierwszorzędowych (Tabela 1) na szkiełka przez 1 godzinę w wilgotnej tacy do barwienia w temperaturze pokojowej.
  8. Myć szkiełka preparatem PBS + 0,05% Triton X przez 10 minut, a następnie nowym PBST przez 5 minut.
  9. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w koktajlu PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% surowicy koziej. Obliczyć 30 μl pierwszorzędowego koktajlu przeciwciał na przekrój poprzeczny.
  10. Nakładaj wtórny koktajl przeciwciał na szkiełka przez 1 godzinę.
  11. Myć szkiełka z PBS + 0,05% Triton X (PBST) przez 10 minut, a z nowym PBST przez kolejne 5 minut.
  12. Zastosuj zestaw do barwienia jądrowego DAPI (najlepiej roztwory do użycia) na 15 minut lub zgodnie z instrukcjami producenta do barwienia jąder komórkowych.
  13. Preparaty myć krótko preparatem PBS + 0,05% Triton X (PBST) przez 1 minutę. Następnie pozostaw szkiełka do krótkiego wyschnięcia na powietrzu.
  14. Nałożyć fluorescencyjne podłoże montażowe i szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C chronić przed światłem i optymalnie wykonać obrazowanie w ciągu 24-48 godzin.

3. Mikroskopia

  1. Załaduj slajdy do skanera slajdów. W zależności od skanera slajdów można wykonać maksymalnie 12 slajdów.
  2. Rozpocznij nowy projekt. Dla podglądu ustaw kanał DAPI i obiektyw 2.5X. Do szczegółowej analizy wykorzystaj kanały DAPI, GFP, FITC i Cy5 oraz obiektyw 20X. Autofokus jest rejestrowany przez cały czas trwania projektu w kanale DAPI.
  3. Użyj następujących kolorów dla każdego kanału: DAPI -niebieski, FITC: zielony, Texas Red: czerwony, Cy5: żółty.
  4. Twórz podglądy każdego slajdu za pomocą kanału DAPI. W tym celu należy ręcznie ustawić ostrość na pierwszej próbce i używać jej przez cały czas trwania analizy podglądu, aby uzyskać obrazy podglądu każdej próbki.
  5. Przedstaw każdy przekrój, który powinien zostać uwzględniony w szczegółowym procesie nabycia. Nie rysuj konturów blisko krawędzi próbki, aby zapewnić podpis całego obszaru zainteresowania.
  6. Ustaw czasy ekspozycji dla każdego kanału. W większości przypadków parametry ekspozycji różnych kanałów są identyczne dla wszystkich przekrojów.
  7. Uruchom automatyczne pobieranie obrazu. Sprawdź poprawność akwizycji dla pierwszego pola widoków, aby zapobiec nieprawidłowemu pozyskiwaniu na wczesnym etapie zautomatyzowanego procesu.
  8. W razie potrzeby nawiąż zdalne sterowanie za pomocą oprogramowania do tworzenia kopii lustrzanych pulpitu. Pozwala to na zdalne monitorowanie procesu akwizycji obrazu poprzez odbicie lustrzane ekranu komputera skanera slajdów na innym komputerze za pośrednictwem dowolnej sieci lub połączenia internetowego. Chociaż nie można wprowadzić żadnych zmian w fizycznej konfiguracji dotyczącej używanych slajdów, wirtualne środowisko oprogramowania do akwizycji obrazu umożliwia monitorowanie prawidłowego czasu ostrości lub ekspozycji obrazów. Ponadto szacowany czas realizacji może być regularnie sprawdzany.
  9. Po zakończeniu akwizycji obrazu kontroluj poprawny autofokus wszystkich obrazów, ręcznie kontrolując, czy można rozróżnić architekturę światłowodu, poszczególne włókna i różne typy światłowodów.
  10. Ponowne uzyskanie nieprawidłowo wyostrzonych obszarów obrazu dla pojedynczych pól widzenia lub całych obszarów zainteresowania. W celu ponownego pozyskania pojedynczych obszarów należy oznaczyć obszary lub obrazy w całym projekcie i ponownie uzyskać obszary z ręcznym ustawianiem ostrości. W większości przypadków dodatkowy szczegół obrazu przy innym poziomie ostrości prowadzi do nieprawidłowej ostrości obrazów
  11. Dla każdego przekroju, który powinien zostać uwzględniony w analizach końcowych, wyeksportuj każdy kanał (z wyłączeniem DAPI) osobno jako pliki jpeg. Nazwij i posortuj pliki zgodnie z uwidocznionymi kanałami w folderach o nazwach Texas Red, FITC i Cy5.

4. Automatyczna analiza włókien

UWAGA: Makro można pobrać z następującej strony internetowej: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

  1. Przed analizą należy wyświetlić podgląd każdego obrazu za pomocą konwencjonalnego oprogramowania do edycji obrazu i sprawdzić, czy kontrast między poplamionymi włóknami a tłem jest wystarczający. W razie potrzeby dostosuj kontrast i jasność, aby zwiększyć różnicę, używając poleceń regulacji jasności i kontrastu.
  2. Otwórz ImageJ lub Fidżi. Otwórz makro za pomocą polecenia "Wtyczki - Makra - Edycja". Spowoduje to wyświetlenie kodu źródłowego makr i umożliwi szybkie dostosowanie parametrów. W razie potrzeby zmień katalog folderów dla każdego kanału w kodzie źródłowym makra.
    UWAGA: Wartości do analizy włókien mięśniowych są oparte na bicepsach i mięśniach lędźwiowych szczurów, inne gatunki lub mięśnie mogą wymagać innych wartości.
  3. Użyj polecenia "uruchom", aby uruchomić makro. Wszystkie obrazy folderu są teraz ładowane do makra i określane ilościowo w kolejnej kolejności. Wyniki zostaną wyświetlone w nowym oknie. Ten krok może potrwać od kilku sekund do kilku godzin, w zależności od ilości analizowanych danych.
  4. Wyeksportuj okno wyników jako plik arkusza kalkulacyjnego. Zidentyfikuj wartości dla dodatnio zliczonych włókien Cy5 (wolnych), FITC (pośrednich) i Texas Red (szybkich) i zsumuj całkowitą liczbę włókien.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przekroje poprzeczne całych mięśni szczura barwiono szybko metodą immunohistochemiczną w celu zidentyfikowania włókien mięśniowych MHC I, IIA i IIB. Następnie, przy użyciu skanera preparatów do mikroskopii fluorescencyjnej, automatycznie pozyskano całe przekroje poprzeczne do zautomatyzowanej analizy włókien mięśniowych w programie ImageJ. Koncepcja tej procedury opiera się na zapewnieniu prostego, niezawodnego i wydajnego czasowo przepływu pracy w celu kwantyfikacji włókien mięśniowych.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu demonstrujemy szeroko dostępną metodologię badania i automatycznego oznaczania ilościowego populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych szczurów za pomocą immunohistochemii w sposób efektywny czasowo. W celu zapewnienia odtwarzalności przedstawiamy szczegółowy opis krok po kroku i potencjalne modyfikacje dla zastosowań u innych gatunków, które nie zostały opisane w tym badaniu. Ponadto omawiamy zalety zabiegu, warunki optymalnego działania i jego ograniczenia.

Obecnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Christian Doppler Research Foundation. Chcielibyśmy podziękować Sabine Rauscher z Core Facility Imaging na Uniwersytecie Medycznym w Wiedniu w Austrii za wsparcie przez cały czas trwania projektu. Przeciwciała pierwszorzędowe zostały opracowane przez Schiaffino, S., uzyskane z Banku Hybrydomy Badań Rozwojowych, utworzonego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Związek O.C.TTissue-Tek, Sakura, HolandiaDo zatapiania tkanki mięśniowej
Izopentando odpowiedniego zamrażania tkanki mięśniowej
Prowadnice Superfrost Ultra PlusThermo Scientific, Niemcy1014356190szkiełka samoprzylepne sól fizjologiczna
buforowana fosforanami 
Triton X-100Thermo Scientific, Niemcy85112Detergent Soluation
Kozia surowicaThermo Scientific, Niemcy50197ZKozia surowica
DAKO Fluorescencyjne medium montażoweDako DaniaS3023
Długopis DakoDaniaS200230-2
TissueFAXSi plusTissueGnostics, Wiedeń, Austria
Primary przeciwciała
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Przeciwciała supernatant
drugorzędowe
Alexa  Fluor  633  Kozioł Anty-Mysz IgG2b Thermo Scientific, NiemcyA-21146
Alexa Fluor 488 Koza Anty-Mysz IgG1 ( γ 1)Thermo Scientific, NiemcyA-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (& mikro-łańcuch)Thermo Scientific, NiemcyA-21426
Odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbesThermo Scientific, NiemcyR37606

Bibliografia

  1. Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
  2. Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
  3. Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
  4. Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
  5. Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455(2014).
  6. Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
  7. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  8. Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908(2011).
  9. Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
  10. Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
  11. Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
  12. Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
  13. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
  14. Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
  15. Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
  16. Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
  17. Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
  18. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  19. Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
  20. Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
  21. Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
  22. Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
  23. Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
  24. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273(2012).
  25. Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
  26. Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  27. Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586(2014).
  28. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  29. Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie w kien mi niowychprzekroje mi ni szczurazautomatyzowana analiza obrazumakro ImageJbarwienie fluorescencyjneskaner do preparat wbarwienie DAPIanaliza mi ni szkieletowych
Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.