Artykuł metodologiczny

Wdychanie suchego proszku i aerozoli w nebulizach farmaceutyków dostarczanych myszom przy użyciu systemu naświetlania tylko przez nos

42.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55454

⸱

6 kwietnia 2017

 ,  , 
1Inflammation Research, Amgen

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj jednostka inhalacyjna może generować, pobierać próbki do charakterystyki i równomiernie deponować aerozol leku w płucach gryzoni. Umożliwia to przedkliniczne określenie skuteczności i bezpieczeństwa dawek leków zdeponowanych w płucach; kluczowe dane umożliwiające kliniczne opracowanie leków wziewnych.

Streszczenie

Obturacyjne choroby układu oddechowego, takie jak astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), są obecnie leczone za pomocą wziewnych leków przeciwzapalnych i rozszerzających oskrzela. Pomimo dostępności wielu metod leczenia, obie choroby stanowią coraz większe obawy dotyczące zdrowia publicznego. Większość pacjentów z astmą jest dobrze kontrolowana za pomocą obecnych terapii wziewnych, ale znaczna liczba pacjentów z ciężką astmą nie jest. Szacuje się, że astma dotyka około 300 milionów ludzi na całym świecie, a około 20 procent ma ciężką postać choroby. W przeciwieństwie do astmy, istnieje niewiele skutecznych metod leczenia POChP. Szacuje się, że 10% populacji cierpi na POChP, a tendencja w umieralności z powodu POChP rośnie, jednocześnie malejąc w przypadku innych poważnych chorób. Chociaż opracowanie leków do podawania wziewnego jest wyzwaniem, jednostka do inhalacji tylko przez nos umożliwia bezpośrednie dostarczanie nowych leków do płuc gryzoni w celu przeprowadzenia przedklinicznych badań skuteczności i bezpieczeństwa/toksykologii. Dostarczanie leków wziewnych ma wiele zalet w przypadku chorób układu oddechowego, w których wysokie stężenie w płucach poprawia skuteczność i minimalizuje ogólnoustrojowe skutki uboczne. Wziewne kortykosteroidy i leki rozszerzające oskrzela korzystają z tych zalet, a podawanie wziewne może również mieć potencjał dla przyszłych terapii biologicznych. Opisana w niniejszym dokumencie jednostka inhalacyjna może generować, pobierać próbki do charakterystyki i równomiernie osadzać aerozol leku w płucach gryzoni. Umożliwia to przedkliniczne określenie skuteczności i bezpieczeństwa dawek leków zdeponowanych w płucach gryzoni, które są kluczowymi danymi wymaganymi przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Wprowadzenie

Istnieje wiele zalet wziewnego podawania leków stosowanych w leczeniu chorób układu oddechowego. Podawanie wziewne polega na nałożeniu środka terapeutycznego bezpośrednio na miejsce działania, czyli do płuc. Wysokie miejscowe stężenie leku w płucach stanowi istotną zaletę, która minimalizuje dawkę i narażenie ogólnoustrojowe oraz maksymalizuje skuteczność. Jest to ważna zaleta, która może znacznie zwiększyć indeks terapeutyczny (TI, stosunek dawki leku, która powoduje efekt uboczny, do dawki leku, która zapewnia skuteczność) leku. Wziewni agoniścireceptorów 2-adrenergicznych, kortykosteroidy i leki antycholinergiczne β okazały się skuteczne w poprawie czynności płuc u pacjentów z astmą i POChP, jednocześnie minimalizując ogólnoustrojowe skutki uboczne (tachykardia, immunosupresja i zaparcia) obserwowane podczas przyjmowania doustnego. Nowe klasy leków (na przykład inhibitory PDE41 i inhibitory BTK2) okazały się ostatnio skuteczne w poprawie czynności płuc w przedklinicznych modelach chorób zwierzęcych, ale podobnie jak β2-agonistów, kortykosteroidy i leki antycholinergiczne, cierpią na ogólnoustrojowe działania niepożądane, które można zminimalizować przez podawanie wziewne. Ze względu na dodatkowe koszty związane z opracowaniem leków wziewnych w porównaniu z doustnymi, preparat wziewny powinien być brany pod uwagę we wskazaniach oddechowych tylko wtedy, gdy skuteczne podanie doustne/ogólnoustrojowe wykaże ogólnoustrojowe działania niepożądane ograniczające dawkę.

Przedklinicznie, związki wziewne są zoptymalizowane pod kątem zwiększenia TI, co wymaga pomiarów skuteczności in vivo i skutków ubocznych. Początkowo pomiary te można wykonać w oddzielnych testach, zwykle pomiarze skuteczności podawanym miejscowo i pomiarze skutków ubocznych dostarczanym systemowo, ale aby naprawdę porównać związki, skuteczność i skutki uboczne powinny być mierzone u tych samych zwierząt po podaniu wziewnym. Wymaga to badań dawka/odpowiedź, które pozwalają uzyskać wystarczającą ilość związku podawanego do płuc, aby wywołać mierzalny efekt uboczny. Obecnie jedynym sposobem na równomierne rozprowadzenie dużych dawek leku w płucach wielu małych zwierząt jednocześnie jest inhalacja tylko do nosa3,4,5. Mocne i słabe strony różnych technik narażenia inhalacyjnego zostały niedawno przeanalizowane6,7,8. Specjalistyczny sprzęt i duża ilość badanego związku (ilości w gramach) są wymagane do dostarczania leku wziewnego tylko do nosa, ale badania potwierdzające słuszność koncepcji mogą być możliwe za pomocą innych środków.

Gdy ilość leku jest ograniczona (ilości mg), bezpośrednie metody podawania są opcją, ale wszystkie cierpią z powodu niejednorodnego odkładania, z większą ilością leku skoncentrowanego wzdłuż centralnych dróg oddechowych i słabiej reprezentowanym w obszarach miąższowych/pęcherzykowych3,4,5. Skuteczna dawka dostarczana przez bezpośrednie wkroplenie jest zawsze wyższa i nigdy nie może być bezpośrednio porównana z dawkami wziewnymi4. Metody bezpośredniego wkraplania, w tym donosowe9, płyn dotchawiczy10,11 i wkraplanie w sprayu12, lub inufflation suchym proszkiem13,14 mogą być używane jako narzędzie przesiewowe do określenia przybliżonego zakresu dawek dla późniejszych badań inhalacji tylko przez nos lub do określenia rankingu skuteczności/toksyczności dla serii strukturalnie Podobne leki15. Ze względu na wzorzec osadzania się w centralnych drogach oddechowych, metody bezpośredniego podawania mogą być bardziej przydatne do określenia wpływu związków działających na ośrodkowe drogi oddechowe (leki rozszerzające oskrzela lub inhibitory komórek tucznych) niż w płucach obwodowych (leki przeciwzapalne).

W przeciwieństwie do ludzi, którzy mogą wdychać znaczną dawkę skoncentrowanego aerozolu z inhalatora za jednym głębokim oddechem, ciągłe wytwarzanie respirabilnego aerozolu (0,5-5 μm o średniej średnicy aerodynamicznej, MMAD) przez okres do godziny, jest wymagane do zdeponowania skutecznej dawki leku w płucach spontanicznie oddychającego gryzonia w systemie inhalacyjnym tylko do nosa16. Generatory aerozoli (nebulizator strumieniowy lub Wright dust feed17), które mogą w sposób ciągły wytwarzać wymaganą wielkość i stężenie cząstek aerozolu do badań inhalacyjnych tylko przez nos, nie są zbyt wydajne w generowaniu wysokiej jakości (respirabilnych) aerozoli. Szybkość podawania leku do tych generatorów aerozoli dla silnych związków (IC50 pM do nM w testach funkcjonalnych opartych na komórkach) jest zwykle w zakresie od 1 do 10 mg / min i zwykle mniej niż 1% tego aerozolu leku dociera do strefy oddychania zwierząt (ryc. 1). Wiele z wytwarzanych cząstek jest zbyt dużych (>5 μm), aby dostać się do płuc i są usuwane przez klasyfikator aerozolowy (separator wstępny lub cyklon o punkcie odcięcia 5 μm), aby uniknąć dużej dawki leku w nosie. Nieskuteczność systemów inhalacyjnych tylko przez nos zwiększa mały zakres wielkości cząstek (od 0,5 do 5 μm MMAD) dla cząstek respirabilnych. Wiele cząsteczek aerozolu mniejszych niż 0,5 μm jest wydychanych (jak dym papierosowy) i nie osadza się w płucach18. Ponadto wiele "większych" cząstek aerozolu (~ 5 μm) osadzających się w nosie jest wchłanianych lub transportowanych przez klirens śluzowo-rzęskowy w kierunku tylnej części gardła, gdzie są połykane do żołądka19. W przypadku stosowania inhalacji tylko do nosa, dawka zdeponowana w nosie jest zawsze większa niż dawka zdeponowana w płucach, a dawka donosowa może przyczynić się do ekspozycji ogólnoustrojowej i skutków ubocznych20. Z natury rzeczy dawki leków wziewnych są małe (w zakresie mikrogramów), co minimalizuje wszelkie potencjalne ogólnoustrojowe skutki uboczne leku wchłanianego przez tkanki nosa, płuc lub przewodu pokarmowego. Nawet jeśli wielkość cząstek aerozolu dostarczanego zwierzętom mieści się w zakresie respirabilnym, średnio tylko 4% cząstek aerozolu, które docierają do strefy oddychania zwierząt, osadza się w płucach. Dostępne są bardziej wydajne generatory aerozoli, ale nebulizator strumieniowy i dozownik pyłu Wright nie mają sobie równych pod względem zdolności do wytwarzania ciągłych aerozoli z różnych preparatów cieczy i suchych proszków.

Respirabilny aerozol z separatora wstępnego przechodzi do urządzenia do inhalacji tylko do ekspozycji na nos21, który jest oparty na projekcie przepływu obok nosa22. Jednostka inhalacyjna składa się z 3 poziomów (na rysunku 1 pokazano tylko dwa poziomy), a każdy poziom zawiera 10 portów do ekspozycji zwierząt i pobierania próbek aerozoli. Porty są rozmieszczone obwodowo wokół centralnej komory aerozolowej. Świadome myszy umieszcza się w szklanych uchwytach przytrzymujących (6 cali długości i 1,2 cala średnicy) i wdychają zawartość aerozolu jednostki inhalacyjnej. Myszy nie są przyzwyczajone do urządzeń ograniczających23. Wcześniejsze doświadczenia wykazały, że myszy tolerują krótsze niż godzinę unieruchomienie rurki w podobny sposób, z adaptacją lub bez2.

Jednostka inhalacyjna jest zaprojektowana do dostarczania aerozoli leków bezpośrednio do płuc zwierząt, unikając kontaktu z operatorami. Siła działania/toksyczność tych leków jest zwykle nieznana i stosuje się wiele inżynieryjnych środków kontroli bezpieczeństwa, aby uniknąć narażenia operatorów. Operatorzy muszą zawsze nosić środki ochrony osobistej (rękawice, fartuchy laboratoryjne, respiratory i okulary ochronne). Zewnętrzna komora inhalacyjna jest pod podciśnieniem przez cały czas pracy, co pozwala na bezpieczne usuwanie pojedynczych zwierząt lub grup zwierząt bez wyłączania generatora aerozolu. Urządzenie do inhalacji jest również umieszczone w dodatkowej obudowie utrzymywanej pod podciśnieniem przez otwór wylotowy w suficie, aby zapobiec ucieczce aerozolu do pomieszczenia w przypadku nieprawidłowego działania. Całe powietrze ściekowe z systemu inhalacyjnego jest filtrowane przez filtr HEPA przed uwolnieniem do środowiska. System naświetlania nosa użyty w tym manuskrypcie został zakupiony od jednego dostawcy (patrz uzupełniający Spis Materiałów).

Protokół

Myszy wykorzystane w tych badaniach były utrzymywane zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, ósma edycja24. Myszy przebywały w grupach w placówce akredytowanej przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) w sterylnych wentylowanych mikroizolatorach na ściółce z kolb kukurydzy. Podczas pomiaru skurczu oskrzeli myszy znieczulono pentobarbitalem w dawce 100 mg/kg i.p., a głębokość znieczulenia monitorowano poprzez brak odruchu na uciśnięcie palca i podtrzymywano znieczuleniem i.p. w razie potrzeby. Po zakończeniu eksperymentów myszy poddano eutanazji poprzez zwichnięcie stawów szyjnych po przedawkowaniu barbituranów. Potwierdzenie eutanazji stwierdzono na podstawie braku oddechu. U myszy nie przeprowadzano zabiegów chirurgicznych z przeżyciem. Wszystkie protokoły badawcze zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Formułowanie i dobór urządzenia do generowania aerozoli farmaceutycznych

UWAGA: Dobór formulacji i urządzenia zależy od właściwości fizykochemicznych poszczególnych leków przeznaczonych do aerozolizacji, dlatego poniżej przedstawiono ogólne protokoły, a czytelnika odsyłamy do przeglądów literatury opracowanych przez Zeng25 oraz O'Riordana26.

  1. Aerozole z proszków suchych
    1. Zmikronizuj suche proszki leku w młynku kulowym, młynku strumieniowym lub podobnym urządzeniu27 i upewnij się, że rozkład wielkości cząstek (PSD) zawiera cząstki o rozmiarze respirabilnym (0,5-5 μm średnicy aerodynamicznej masy mediany, MMAD). Zmieszaj silnie działające związki testowe wymagające rozcieńczenia z zmikronizowaną laktozą.
      UWAGA: Jeśli ilość zmikronizowanego proszku jest niewystarczająca do wyznaczenia PSD za pomocą impaktora kaskadowego, PSD małej (submiligramowej) próbki zmikronizowanego proszku można zmierzyć metodą rozpraszania światła, aby potwierdzić obecność małych cząstek respirabilnych.
    2. Wygeneruj aerozol z proszku suchego, używając generatora aerozoli z proszku suchego Wright dust feed. Wprowadź zmikronizowany proszek leku/laktozy do cylindrycznego zbiornika za pomocą ręcznej prasy hydraulicznej przy ciśnieniu około 1000 funtów na cal kwadratowy (psi), aby uzyskać skomprymowane kostki proszku używane jako materiał wejściowy w generatorze aerozoli Wright dust feed17.
    3. Przykręć cylindryczny zbiornik do urządzenia Wright dust feed, przesuwając go, aż łopatka skrobająca zetknie się z kostką leku.
    4. Podłącz wylot urządzenia Wright dust feed do cyklonu, a wlot do źródła sprężonego powietrza z ustawionym przepływem 15 L/min (maksymalne ciśnienie 90 psi).
    5. Ustaw kontrolę szybkości podawania na 0,7 obrotu na minutę (rpm) i włącz generator aerozoli Wright dust feed.
      UWAGA: Wartość 0,7 rpm odpowiada szybkości podawania kostki substancji testowej wynoszącej 1 g/h przy użyciu małego cylindrycznego zbiornika Wright dust feed. Urządzenie Wright dust feed ściera cienką warstwę skomprymowanego proszku z kostki substancji testowej poprzez obracanie zbiornika. Powietrze wynosi pył z urządzenia Wright dust feed, przeprowadza go przez dyszę soniczną w celu reaglomeracji, a następnie do cyklonu, aby usunąć cząstki nierepirabilne i aglomeraty.
    6. Podłącz wylot cyklonu do centralnej komory aerozolu jednostki inhalacyjnej (Rysunek 1).
      UWAGA: Związki w zbiorniku Wright dust feed mogą być sprężane w zakresie od 300 do 1500 psi. Celem jest dostateczne ściśnięcie cząstek, aby pozostały w zbiorniku po odwróceniu, ale nie tak mocno, by urządzenie Wright dust feed nie mogło ściąć cienkiej warstwy do ponownej aerozolizacji. Należy pamiętać, że manometr w ręcznej prasie hydraulicznej wskazuje wartość w funtach, a tłok w małym zbiorniku do podawania proszku ma powierzchnię około 0,25 cala kwadratowego. Zatem siła kompresji 250 funtów na 0,25 cala kwadratowego jest równoważna 1000 psi.
  2. Nebulizowane aerozole ciekłe
    1. Rozpuść lek w 100 mL wody lub soli fizjologicznej.
    2. Napełnij strzykawkę 100 mL roztworem leku i umieść ją w pompie strzykawkowej z ustawionym przepływem 1 mL/min.
    3. Podłącz pompę strzykawkową do nebulizatora strumieniowego i usuń powietrze z linii doprowadzającej do nebulizatora.
    4. Podłącz źródło sprężonego powietrza do nebulizatora strumieniowego i ustaw przepływomierz powietrza na 10 L/min.
    5. Włóż nebulizator strumieniowy do preseparatora. Preseparator łączy nebulizator z centralną komorą aerozolu jednostki inhalacyjnej (Rysunek 1).
      UWAGA: Wiele związków leków ma ograniczoną rozpuszczalność w wodzie i lepiej formułować je jako aerozole z proszków suchych. Jeśli z zmikronizowanego związku (MMAD < 5 μM) można przygotować stabilną zawiesinę, można ją stosować z nebulizatorem strumieniowym. Należy zachować ostrożność, ponieważ zawiesina może zapchać nebulizator. Stosowano stężenia podawane do nebulizatora od 1 mg/mL dla silnie działających związków (takich jak lek rozszerzający oskrzela ipratropium) do zawiesin 40 mg/mL (dla związków słabiej działających, np. siarczanu salbutamolu). Szybkość podawania pompy strzykawkowej ustawiono na 1 mL/min z powodów praktycznych: aby okres równoważenia stężenia aerozolu oraz 45-minutowa ekspozycja mogły zostać zakończone bez konieczności ponownego napełniania strzykawki.

2. Przygotowanie eksperymentu ekspozycji na aerozol

  1. Zmierz stężenie leku (poprzez gromadzenie aerozolu na filtrze absolutnym) oraz rozkład wielkości cząstek (poprzez gromadzenie aerozolu za pomocą impaktora kaskadowego) aerozolu, który wpłynął do jednostki inhalacyjnej po wstępnym separatorze/cyklonie. Wykorzystaj te parametry wraz z minutową wentylacją zwierzęcia, masą ciała oraz czasem ekspozycji, aby oszacować dawkę leku osadzoną w płucach.
    1. Zważ filtr absolutny i zanotuj jego masę. Umieść filtr w uchwycie i zmontuj uchwyt filtra. Podłącz wlot uchwytu filtra absolutnego do portu próbkowania centralnego plenum aerozolu, a wylot do źródła próżni ustawionego na pobieranie aerozolu z przepływem 1 L/min przez cały czas trwania eksperymentu.
      UWAGA: Masa leku na filtrze po 45 min próbkowania może mieścić się w zakresie submikrogramowym i/lub być zmieszana z laktozą, solą NaCl lub innym nośnikiem. Niezbędna jest mikrowaga o rozdzielczości 0,1 µg. Aby uzyskać dokładną masę leku osadzonego na filtrze, filtr musi zostać wyrównany i zważony w środowisku o kontrolowanej wilgotności. Masę leku na filtrach można wykorzystać w obliczeniach dawki tylko wtedy, gdy w formulacji nie ma nośnika lub nośnikiem jest woda. W przypadku zastosowania nośnika innego niż woda, masa substancji na filtrze stanowi jedynie szacunkowy punkt wyjścia do dalszej analizy zawartości leku za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
    2. Zważ i zanotuj masę filtrów z 7 stopni impaktora kaskadowego oraz jednego końcowego filtra „ogona”. Umieść filtr na każdym z siedmiu stopni impaktora kaskadowego i zmontuj impaktor kaskadowy Mercer28. Podłącz wlot impaktora kaskadowego do portu próbkowania centralnego plenum aerozolu, a wylot do źródła próżni ustawionego na pobieranie aerozolu z przepływem, na który skalibrowano impaktor kaskadowy (zazwyczaj 0,5 lub 1 L/min) przez cały czas trwania eksperymentu.
    3. Monitoruj zawartość aerozolu w jednostce inhalacyjnej za pomocą monitora aerozolu w czasie rzeczywistym (patrz Tabela materiałów i odczynników), aby potwierdzić, że generatory aerozolu są sprawne i wytwarzają stabilny aerozol przez cały czas trwania eksperymentu. Podłącz wlot monitora aerozolu w czasie rzeczywistym do portu próbkowania centralnego plenum aerozolu, a wylot do źródła próżni ustawionego na pobieranie aerozolu z przepływem 1 L/min przez cały czas trwania eksperymentu.
      UWAGA: Sygnał z monitora aerozolu w czasie rzeczywistym jest podawany w μg/L, ale jest on skalibrowany dla pyłu drogowego i musi zostać ponownie skalibrowany dla każdego poszczególnego aerozolu leku, aby uzyskać poprawne wartości stężenia aerozolu. Kalibracja nie jest wymagana do korzystania z monitora w celu potwierdzenia obecności lub braku oraz stabilności czasowej stężenia aerozolu.
    4. Ustaw parametry kontroli procesu (przepływ powietrza, próżnię, ciśnienie, moc generatora aerozolu) na wartości wymagane w zależności od liczby zwierząt podłączonych do jednostki inhalacyjnej. Jednostka inhalacyjna i generatory aerozolu są stale kontrolowane/monitorowane przez komputerowy system sterowania procesem/akwizycji danych (DACO) dostarczony przez producenta (patrz Tabela materiałów i odczynników). Przepływ powietrza do jednostki inhalacyjnej powinien wynosić minimum około 2 razy całkowity minutowy współczynnik wentylacji wszystkich zwierząt w jednostce inhalacyjnej, aby uniknąć gromadzenia się CO2.
  2. Umieść myszy w ogranicznikach typu „nose-only” (tylko nos) przed poddaniem ich działaniu aerozolu w jednostce inhalacyjnej typu „nose-only”. Umieść również zwierzęta kontrolne poddane stresowi z ograniczenia w ogranicznikach, aby oddychały powietrzem pokojowym.
    UWAGA: Eksperyment dawka/odpowiedź składa się z wielu grup myszy eksponowanych na aerozol przez różny czas. Czas ekspozycji jest wykorzystywany do kontrolowania dawki otrzymywanej przez każdą grupę podczas eksperymentu dawka/odpowiedź.
    1. Podczas umieszczania zwierząt skieruj rurkę ograniczającą pod kątem do góry, w stronę sufitu, ponieważ mają one tendencję do ucieczki w górę. Skierowanie rurek w dół podczas ładowania może zachęcić zwierzęta do obrócenia się i ucieczki tyłem z rurki. Upewnij się, że nos myszy jest skierowany w stronę zaostrzonego końca rurki i zamocuj tłok o zmiennej pozycji w tylnej części ogranicznika.
      UWAGA: Tłok jest tak skonstruowany, aby umożliwić wystawanie ogona myszy z uchwytu, co pozwala myszy regulować temperaturę ciała podczas przebywania w ograniczniku.
    2. Dostosuj położenie tłoka tak, aby myszy mogły się obracać, ale nie mogły odwrócić się od głowy do ogona, co zapewni inhalację aerozolu.
    3. Stale monitoruj myszy przebywające w rurkach ograniczających. Po ustawieniu tłoka małe myszy (<20 g) często próbują odwrócić się w rurkach od głowy do ogona i przyjmują pozycję w kształcie litery U, w której mają trudności z oddychaniem. Zachowanie to jest najpowszechniejsze w ciągu pierwszych 5 minut ograniczenia, po czym myszy rzadko próbują się odwrócić.

3. Podawanie aerozolu

  1. Włóż korki, aby zamknąć porty doprowadzające jednostki inhalacyjnej, a następnie uruchom generator aerozolu, kontroler przepływu sprężonego powietrza oraz pompę próżniową jednostki inhalacyjnej za pomocą oprogramowania do sterowania procesem.
  2. Gdy odczyty z monitora aerozolu w czasie rzeczywistym wykażą, że stężenie aerozolu osiągnęło stan równowagi (~30 min, Rysunek 2), zacznij wyjmować korki i wprowadzać do jednostki inhalacyjnej rurki ograniczające dostęp tylko do nosa, w których znajdują się myszy. Powtarzaj czynność, aż wszystkie myszy przeznaczone do ekspozycji na lek zostaną podłączone do jednostki inhalacyjnej.
    UWAGA: W eksperymencie przykładowym całkowity przepływ powietrza dostarczanego do jednostki inhalacyjnej przez generator aerozolu i powietrze rozcieńczające jest ustawiony tak, aby zapewnić przepływ 0,5 L/min do każdego z używanych portów ekspozycji zwierząt. Na przykład całkowity przepływ powietrza rzędu 15 L/min jest wystarczający do zasilenia każdego z 30 portów w jednostce inhalacyjnej. Jest to przepływ powietrza znacznie większy niż wymagana minutowa wentylacja myszy, jednak większy przepływ jest niezbędny do dostarczenia energii (spadek ciśnienia w generatorze aerozolu) w celu wytworzenia (atomizacji/deaglomeracji) aerozolu.
  3. Po załadowaniu wszystkich zwierząt do jednostki ekspozycyjnej, włącz za pomocą oprogramowania do sterowania procesem pompy próżniowe do pobierania próbek, które są podłączone do filtra absolutnego i impaktora kaskadowego.
  4. Po zakończeniu wszystkich ekspozycji wyłącz generator aerozolu i wyjmij pozostałe myszy z jednostki inhalacyjnej.
    UWAGA: Zwierzęta będą obsługiwane w komorze stacji przeładunkowej lub przez personel noszący maseczki ochronne. Po zakończeniu podawania aerozolu myszy są wyjmowane z rurek, a rurki są dezynfekowane po każdym użyciu.

4. Obliczanie dawki osadzonej

  1. Aby obliczyć dawkę zdeponowaną29 w μg/kg (Równanie 1), należy pomnożyć stężenie leku w aerozolu (μg/L) przez wentylację minutową (L/min), czas ekspozycji (min), frakcję inhalacyjną oraz frakcję depozycji płucnej, a następnie podzielić wynik przez masę ciała (kg).
  2. Stężenie aerozolu (μg/L) oblicza się, dzieląc masę leku na filtrze absolutnym (μg) przez przepływ powietrza przez filtr (L/min) pomnożony przez czas próbkowania (min). Wentylację minutową myszy szacuje się za pomocą równania allometrycznego opartego na masie ciała30. Frakcja inhalacyjna wynosi 1, ponieważ aerozol przepuszczono przez preseparator w celu usunięcia cząstek nierespirabilnych, a frakcję depozycji płucnej określa się na podstawie MMAD aerozolu leku (Rycina 3), wykorzystując eksperymentalne krzywe kalibracyjne dla aerozoli monodyspersyjnych (Rycina 4)31.

Równanie dawki wprowadzonej; stężenie, objętość minutowa, czas trwania, IF, DF w stosunku do masy ciała; wzór.

Wyniki

Lek rozszerzający oskrzela, bromek ipratropium, rozpuszczono w 0,9% soli fizjologicznej do stężenia 1 mg/mL. Strzykawkę o pojemności 100 mL napełniono roztworem preparatu ipratropium i umieszczono ją w pompie strzykawkowej ustawionej na podawanie do nebulizatora strumieniowego (Rysunek 1) z przepływem 1 mL/min. Aktywacja systemu sterowania jednostką inhalacyjną uruchamia przepływ powietrza 10 L/min do nebulizatora strumieniowego, przepływ powietrza rozcieńczającego 5 L/min do komory rozcieńczania oraz przepływ powietrza próżniowego 15,5 L/min w celu wyciągnięcia aerozolu leku z jednostki inhalacyjnej po przejściu przez nosy myszy. Uruchomiono pompę strzykawkową oraz pompę próbkującą monitora aerozolu w czasie rzeczywistym. Dwadzieścia cztery myszy umieszczono w jednostce inhalacyjnej po potwierdzeniu przez monitor aerozolu w czasie rzeczywistym, że stężenie aerozolu w jednostce inhalacyjnej osiągnęło stan równowagi (15-30 min, Rysunek 2). Pompy próbkujące dla filtra absolutnego (1 L/min) i impaktora kaskadowego (0,5 L/min) włączono po podłączeniu wszystkich myszy do jednostki inhalacyjnej. Pierwszą grupę 8 myszy wyjęto z jednostki inhalacyjnej po 5 min, drugą po 15 min, a trzecią po 45 min. Skurcz oskrzeli32 mierzono jako wzrost oporu układu oddechowego (Rrs) po podaniu pojedynczej znebulizowanej dawki metacholiny (30 mg/mL) 2 h po podaniu ipratropium, przy użyciu respiratora dla gryzoni 33. Do ilościowego określenia skurczu oskrzeli wykorzystano procentowy wzrost Rrs dla każdego zwierzęcia, obliczony jako maksymalne Rrs w 3-minutowym odstępie po znebulizowanej metacholinie (Rmax) minus wartość Rrs pomiaru bazowego przed metacholiną (Rbase), podzielone przez Rbase (% wzrostu Rrs = (Rmax-Rbase)/Rbase).

Aerozol osadzony na filtrach impaktora kaskadowego oraz filtrze absolutnym podczas 45 min ekspozycji na aerozol rozpuszczono w 50% acetonitrylu, a masę ipratropium oznaczono za pomocą HPLC (Tabela 1). Obliczoną wartość MMAD x/ GSD aerozolu ipratropium wyniosła 1,7 x/ 1,5 μm (Rycina 3), a dla myszy przyjęto frakcję depozycji (DF) wynoszącą 0,037 dla aerozolu o MMAD 1,7 μm (Rycina 4). Frakcja wdychalna (IF) wynosiła 1, ponieważ aerozol przepuszczono przez preseparator w celu usunięcia cząstek nierespirabilnych. Średnie stężenie ipratropium w aerozolu (0,5 μg/L) obliczono, dzieląc masę ipratropium na filtrze absolutnym (22 μg) przez przepływ powietrza przez filtr (1 L/min) i mnożąc przez czas pobierania próbek (45 min). Średnia masa ciała myszy wynosiła 0,019 kg, a ich przewidywana wentylacja minutowa została obliczona jako 0,021 L/min. Zgodnie z Równaniem 1, dawki zdeponowane dla grup eksponowanych przez 5, 15 i 45 min wyniosły odpowiednio 0,1, 0,3 i 0,9 μg/kg.

Ipratropium zahamował skurcz oskrzeli indukowany nebulizacją metacholiny u 8-tygodniowych myszy C57Bl/6. Metacholina zwiększyła Rrs w ciągu kilku sekund od podania drogą nebulizacji (Rycina 5, panel górny). Rrs w grupie kontrolnej (eksponowanej na powietrze pokojowe zamiast aerozolu z ipratropium) wzrosła z wartości bazowej 0,62 ± 0,03 cmH2O*s/mL do wartości maksymalnej 1,66 ± 0,12 cmH2O*s/mL, co stanowi wzrost Rrs o 168 ± 9% 70 s po podaniu aerozolu z metacholiną. Procentowy wzrost oporu układu oddechowego był hamowany w sposób zależny od dawki przez wziewne dawki ipratropium. Procentowy wzrost Rrs został zahamowany o 51 ± 9%, 79 ± 14% oraz 89 ± 2% (Rycina 5, panel dolny) przy wziewnych dawkach depozycyjnych ipratropium wynoszących odpowiednio 0,1, 0,3 i 0,9 µg/kg.

Schemat systemu generowania aerozolu z gryzoniami, przedstawiający konfigurację ścieżki przepływu do badań inhalacyjnych.
Rycina 1: Jednostka inhalacyjna z podłączonym generatorem aerozolu z suchego proszku. Po prawej stronie przedstawiono nebulizator służący do generowania aerozolu z formulacji ciekłych. 1) dozownik pyłu Wright, 2) cyklon, 3) pompa strzykawkowa, 4) nebulizator strumieniowy wstawiony do preseparatora, 5) mieszacz powietrza rozcieńczającego. Podczas podawania aerozoli nebulizowanych, dozownik pyłu i cyklon są zastępowane przez pompę strzykawkową, nebulizator strumieniowy/preseparator oraz mieszacz powietrza rozcieńczającego. Powiększony widok (zmodyfikowany na podstawie pracy Oldham21) pokazuje ścieżkę przepływu aerozolu w strefie oddychania wokół nosa zwierzęcia, która powstaje poprzez włożenie rury ograniczającej do jednostki inhalacyjnej. Aerozol wypełnia centralną komorę (szarą) jednostki inhalacyjnej, wypływa w stronę nosa zwierzęcia, skąd jest wciągany przez lekką próżnię w zewnętrznej (białej) komorze do filtrów zbierających odpady (nie pokazano). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres stężenia aerozolu w funkcji czasu, przedstawiający pomiar absorbancji w eksperymencie spektroskopowym.
Rycina 2: Pomiary z monitora aerozolu w czasie rzeczywistym potwierdzają, że stężenie aerozolu w jednostce inhalacyjnej osiąga stan równowagi około 30 min po włączeniu generatora aerozolu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozkład wielkości cząstek, wykres, MMAD/GSD=1,7/1,5 µm, znormalizowana częstotliwość masy w funkcji średnicy odcięcia.
Rycina 3: Masa ipratropium zebrana na każdym stopniu impaktora kaskadowego (niebieski wykres słupkowy) z nałożonym dopasowaniem krzywej (czarna krzywa) użytym do obliczenia MMAD i GSD rozkładu wielkości cząstek aerozolu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres frakcji depozycji w funkcji średnicy aerodynamicznej w badaniu tchawiczo-oskrzelowym u myszy.
Rycina 4: Frakcja depozycji w płucach myszy w funkcji MMAD dla aerozoli podawanych drogą inhalacyjną wyłącznie przez nos (zmodyfikowano na podstawie Hsieh31). Dla rozmiarów cząstek mniejszych niż 0.5 µm większość aerozolu jest wydychana i nie osadza się w płucach (podobnie jak dym papierosowy). Dla rozmiarów cząstek większych niż 5 µm większość aerozolu jest filtrowana przez nos. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza oporu dróg oddechowych, aerozol z metacholiny, odpowiedź na dawkę ipratropium, wyniki na wykresie.
Rycina 5: Gwałtowny wzrost oporu układu oddechowego wywołany podaniem myszom nebulizowanej metacholiny jest blokowany przez ipratropium podane myszom drogą inhalacji wyłącznie przez nos (n = 8 na grupę, górny panel). Ipratropium zahamowało wywołany metacholiną wzrost oporu układu oddechowego z ED50 wynoszącym 0,1 µg/kg dawki zdeponowanej (*p <0,05 vs. kontrola, dolny panel). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dane z impaktora kaskadowego wykorzystywane do obliczenia MMAD i GSD
Filtr przedmiotowyIpratropium na filtrze
metodą HPLC (mg)		Cięcie etapowe
Średnica (mm)
10.0026
20.194.5
31.432.5
42.551.5
52.951.2
61.030.7
70.370.5

Tabela 1: Dane z impaktora kaskadowego użyte do obliczenia MMAD i GSD

Dyskusja

Opisano system inhalacji tylko przez nos i jego działanie polegające na dostarczaniu aerozoli farmaceutycznych do płuc gryzoni. Krępowanie zwierząt w uchwytach tylko na nos jest powszechnie stosowaną metodą wystawiania zwierząt na kontakt z materiałem unoszącym się w powietrzu. Przeprowadzono eksperyment wykazujący, że przeciwcholinergiczny lek rozszerzający oskrzela bromekipratropium 34 może silnie odwracać zwężenie oskrzeli wywołane metacholiną, gdy jest dostarczany przez inhalację tylko do nosa myszom z ED50 wynoszącym 0,1 μg / kg zdeponowanej dawki. Do rozszerzenia oskrzeli po podaniu dotchawiczym (ED50dotchawicze = 1,3 μg/kg, dane nie pokazane) wymagane było ponad 10-krotne zwiększenie skutecznej dawki ipratropium. Wynika to z niejednorodnego wzorca odkładania się leku w płucach wytwarzanego przez dotchawicze dawkowanie 3,5,10. 10-krotne i większe różnice w skutecznych dawkach między technikami dawkowania wziewnego i dotchawiczego dla innych leków były wcześniej obserwowaneprzez inne 4.

Niejednorodny wzorzec osadzania się leku w płucach wytwarzany przez dawkowanie dotchawicze również spowalnia wchłanianie leku przez płuca35, zmniejszając szybkość, z jaką lek dostaje się do krążenia ogólnoustrojowego i zmniejszając szanse na wystąpienie ogólnoustrojowych działań niepożądanych. Dlatego, aby zoptymalizować bezpieczeństwo/skuteczność (indeks terapeutyczny)36 nowych leków wziewnych, należy stosować podawanie wziewne wyłącznie do nosa. Osadzanie dotchawicze da niedokładne oszacowanie TI poprzez generowanie błędnie wysokich dawek skutecznych w płucach i niskich dawek dla krążenia ogólnoustrojowego.

W miarę opracowywania nowych leków podawanych drogą wziewną konieczne jest odpowiednie przełożenie dawki skutecznego leku z przedklinicznych badań skuteczności w celu przewidzenia skutecznej dawki dla ludzi na potrzeby badań klinicznych. Niesławna śmierć słonia Tuskojest często cytowana w literaturze, aby przypomnieć nam o stosowaniu skalowania allometrycznego do przewidywania międzygatunkowych dawek leków i o tym, że międzygatunkowe dawki leków nie powinny być ekstrapolowane liniowo na podstawie prostego porównania mas ciała. Powszechne jest stosowanie podejścia allometrycznego z wykładnikiem allometrycznym b wynoszącym 0,67 w celu przewidywania dawek leków stosowanych u ludzi na podstawie przedklinicznych badań skuteczności38. Za pomocą myszy wdychano ED90 wynoszące 0,9 μg/kg dla ipratropium, wykładnika allometrycznego 0,67, masy ciała myszy 0,03 kg i masy ciała człowieka 60 kg; szacowany ludzki ED90 wynoszący 0,07 μg / kg ((0,9 * (0,03 / 60) (1-0,67) = 0,07) można obliczyć jako przewidywaną dawkę zdeponowaną u ludzi na podstawie naszych danych na myszach. Ta przewidywana wartość jest porównywalna z rzeczywistą skuteczną zdeponowaną dawką u człowieka wynoszącą 0,26 μg/kg, którą można obliczyć na podstawie dostarczonej dawki 40 μg39 podzielonej przez masę ciała ludzkiego wynoszącą 60 kg pomnożoną przez ludzką frakcję16 do wziewnego osadzania się w płucach wynoszącą 0,4 ((40/60)*0,4 = 0,26). Oszacowanie skutecznej dawki zdeponowanej przez człowieka wziewnie pomaga również w planowaniu dostarczonych dawek stosowanych w badaniach toksykologicznych wziewnych wymaganych w badaniach klinicznych40.

Specjalistyczny sprzęt i duża ilość badanego związku (ilości w gramach) wymagane do podawania leku wziewnego tylko do nosa mogą stanowić istotne ograniczenia przy opracowywaniu techniki inhalacji tylko przez nos. Próba kalibracji bez obecności zwierząt jest konieczna, jeśli do badania (zwykle toksykologicznego, a nie skuteczności dawka/odpowiedź) wymagana jest określona dawka, a ta próba kalibracji będzie wymagała dostępności większej ilości leku. Ta kalibracja jest konieczna, ponieważ właściwości fizykochemiczne każdego leku/preparatu mogą różnić się na tyle, aby znacznie wpłynąć na zdeponowaną dawkę leku w płucach. Optymalizacja szybkości przepływu powietrza i leków do generatora aerozoli podczas przebiegu kalibracji jest wymagana w celu uzyskania wielkości i stężenia cząstek aerozolu dla określonej wymaganej dawki. Podczas gdy generator aerozolu powietrze i szybkość podawania leku sugerowane w metodach są rozsądnym punktem wyjścia, istnieje możliwość, że dla określonego preparatu leku zostanie wygenerowany aerozol nierespirabilny (o wielkości cząstek >5 mm). Na etapie przedklinicznym często nie ma wystarczającej ilości leku, aby przeprowadzić serię kalibracji i niemożliwe jest określenie a priori, jakie dawki (jeśli w ogóle) dostają się do płuc. Ponadto podczas procesu wytwarzania aerozolu wytwarzana jest elektryczność statyczna, która może wpływać na czas potrzebny do zrównoważenia stężenia aerozolu. Ważne jest, aby odpowiednio uziemić sprzęt, aby zminimalizować ładunki elektrostatyczne. Inną opcją zminimalizowania elektryczności statycznej jest dodanie wilgoci do powietrza dostarczanego do urządzenia inhalacyjnego w celu zwiększenia przewodności i rozproszenia ładunków elektrostatycznych na cząstkach25. Nawilżanie powietrza dostarczanego do generatora aerozoli nie jest wymagane dla zapewnienia komfortu zwierząt podczas krótkich (< 1 godzin) sesji dozowania, ale powinno być brane pod uwagę, jeśli stosowane są dłuższe czasy dozowania.

Leki mogą być dostarczane do płuc zwierząt poprzez bierną inhalację tylko do nosa lub bezpośrednie metody podawania dotchawiczego, które omijają osadzanie się z nosogardzieli. Podawanie wziewne tylko do nosa jest powszechnie stosowane w dziedzinie toksykologii inhalacyjnej41, ale jest rzadko stosowane na wczesnym etapie procesu odkrywania leków. Multidyscyplinarny zespół badawczy jest potrzebny do prowadzenia badań nad inhalacją tylko do nosa ze względu na: zapotrzebowanie na duże ilości leków, specjalistyczną wiedzę wymaganą do formułowania, generowania i charakteryzowania aerozoli; obsługiwać złożony sprzęt i mierzyć skuteczność leków w zwierzęcych modelach chorób układu oddechowego. Opisane w niniejszym dokumencie techniki dostarczania są wykorzystywane do opracowywania małocząsteczkowych leków wziewnych, ale w przyszłości mogą być stosowane do opracowywania wziewnych leków biologicznych42,43. Miejmy nadzieję, że procedury i wskazówki udokumentowane w tym manuskrypcie ułatwią nowym badaczom zajmującym się przedklinicznym odkrywaniem leków i toksykologią zdobycie umiejętności niezbędnych do dostarczania leków gryzoniom poprzez wdychanie aerozolu.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy zatrudnieni przez Amgen. Opłaty za publikację tego artykułu wideo są opłacane przez firmę Amgen.

Podziękowania

Dziękujemy: Dr. Thomasowi Budimanowi z TSE Systems GmbH za jego wiedzę techniczną i dostosowanie sprzętu. Johnowi Fry'owi (Battelle Inc.) i dr Rudy'emu Jaegerowi (CH Technologies Inc.) za ich pomocne dyskusje. Tian Wu, Samowi Mboggo, April Miller i Seanowi Davisowi (Amgen) za pomoc w eksperymentach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Urządzenie do inhalacji tylko do ekspozycji na nosSystemy TSE700100-KNES-040-ssDostępne konfiguracje niestandardowe
System akwizycji danych DACOSystemy TSE700400-PRO-C-D/1
MC One Młyn strumieniowyJetpharmaDEC MicroJet 10
Turbula MixerGlenMills IncT2F
Mikronizowana laktozaDFE PharmaPrasa hydrauliczna Lactohale 200
SpecacGS15011
Kaskadowe filtry udarowePall Life Sciences7219Filtr Emfab
Filtry absolutneWhatman10370302średnicy 5 cm
Monitor aerozolu w czasie rzeczywistym
Monitor Microdust Pro Casella		CEL-712
Bromek IpratropiumSpectrum ChemicalI1178wstępnie zmikronizowany
system flexiVent FX1scireqFV-FXCS

Bibliografia

  1. Chapman, R. W., et al. Pharmacology of a potent and selective inhibitor of PDE4 for inhaled administration. Eur J Pharmacol. 643 (2-3), 274-281 (2010).
  2. Phillips, J. E., et al. Btk inhibitor RN983 delivered by dry powder nose-only aerosol inhalation inhibits bronchoconstriction and pulmonary inflammation in the ovalbumin allergic mouse model of asthma. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 29 (3), 233-241 (2016).
  3. Zecchi, R., et al. Impact of drug administration route on drug delivery and distribution into the lung: an imaging mass spectrometry approach. Eur J Mass Spectrom. 19 (6), 475-482 (2013).
  4. Cooper, A. E., Ferguson, D., Grime, K. Optimisation of DMPK by the inhaled route: challenges and approaches. Curr Drug Metab. 13 (4), 457-473 (2012).
  5. Leong, B. K., Coombs, J. K., Sabaitis, C. P., Rop, D. A., Aaron, C. S. Quantitative morphometric analysis of pulmonary deposition of aerosol particles inhaled via intratracheal nebulization, intratracheal instillation or nose-only inhalation in rats. J Appl Toxicol. 18 (2), 149-160 (1998).
  6. Pauluhn, J. Overview of inhalation exposure techniques: strengths and weaknesses. Exp Toxicol Pathol. 57 Suppl 1, 111-128 (2005).
  7. Wong, B. A. Inhalation exposure systems: design, methods and operation. Toxicol Pathol. 35 (1), 3-14 (2007).
  8. Phalen, R. F. Inhalation Studies Foundations and Techniques. , 2nd, Informa Healthcare. (2009).
  9. Siddiqui, S., et al. Pulmonary eosinophilia correlates with allergen deposition to the lower respiratory tract in a mouse model of asthma. Clin Exp Allergy. 38 (8), 1381-1390 (2008).
  10. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
  11. Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
  12. Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur J Pharm Biopharm. 61 (3), 214-218 (2005).
  13. Morello, M., et al. Dry-powder pulmonary insufflation in the mouse for application to vaccine or drug studies. Tuberculosis (Edinb). 89 (5), 371-377 (2009).
  14. Guillon, A., et al. Pulmonary delivery of dry powders to rats: tolerability limits of an intra-tracheal administration model. Int J Pharm. 434 (1-2), 481-487 (2012).
  15. Pauluhn, J., Mohr, U. Inhalation studies in laboratory animals--current concepts and alternatives. Toxicol Pathol. 28 (5), 734-753 (2000).
  16. Snipes, M. B., McClellan, R. O., Mauderly, J. L., Wolff, R. K. Retention patterns for inhaled particles in the lung: Comparisons between laboratory animals and humans for chronic exposures. Health Phys. 57 (Sup 1), 69-78 (1989).
  17. Wright, B. M. A new dust-feed mechanism. J Sci Inst. 27, 12-15 (1950).
  18. Scheuch, G., Siekmeier, R. Novel approaches to enhance pulmonary delivery of proteins and peptides. J Physiol Pharmacol. 58 Suppl 5 (Pt 2), 615-625 (2007).
  19. Phillips, J. E., Ji, L., Rivelli, M. A., Chapman, R. W., Corboz, M. R. Three-dimensional analysis of rodent paranasal sinus cavities from X-ray computed tomography (CT) scans. Can J Vet Res. 73 (3), 205-211 (2009).
  20. Wolff, R. K. Toxicology studies for inhaled and nasal delivery. Mol Pharm. , (2015).
  21. Oldham, M. J., Phalen, R. F., Budiman, T. Comparison of predicted and experimentally measured aerosol deposition efficiency in BALB/c mice in a new nose-only exposure system. Aerosol Sci Technol. 43 (10), 970-977 (2009).
  22. Cannon, W. C., Blanton, E. F., McDonald, K. E. The flow-past chamber: an improved nose-only exposure system for rodents. Am Ind Hyg Assoc J. 44 (12), 923-928 (1983).
  23. Narciso, S. P., Nadziejko, E., Chen, L. C., Gordon, T., Nadziejko, C. Adaptation to stress induced by restraining rats and mice in nose-only inhalation holders. Inhal Toxicol. 15 (11), 1133-1143 (2003).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
  25. Zeng, X., Martin, G., Marriott, C. Particulate Interactions in Dry Powder Formulations for Inhalation. , Taylor & Francis. (2001).
  26. O'Riordan, T. G. Formulations and nebulizer performance. Respir Care. 47 (11), 1305-1313 (2002).
  27. Pilcer, G., Amighi, K. Formulation strategy and use of excipients in pulmonary drug delivery. Int J Pharm. 392 (1-2), 1-19 (2010).
  28. Mercer, T. T., Tillery, M. I., Newton, G. J. A multi-stage, low flow rate cascade impactor. J. Aerosol Sci. 1 (1), 9-15 (1970).
  29. Forbes, B., et al. Challenges in inhaled product development and opportunities for open innovation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (1-2), 69-87 (2011).
  30. Alexander, D. J., et al. Association of inhalation toxicologists (AIT) working party recommendation for standard delivered dose calculation and expression in non-clinical aerosol inhalation toxicology studies with pharmaceuticals. Inhal Toxicol. 20 (13), 1179-1189 (2008).
  31. Hsieh, T. H., Yu, C. P., Oberdorster, G. Deposition and clearance models of Ni compounds in the mouse lung and comparisons with the rat models. Aerosol Sci Technol. 31 (5), 358-372 (1999).
  32. Phillips, J. E., et al. House dust mite models: will they translate clinically as a superior model of asthma. J Allergy Clin Immunol. 132 (1), 242-244 (2013).
  33. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. JoVE. (75), e50172(2013).
  34. Storms, W. W., DoPico, G. A., Reed, C. E. Aerosol Sch 1000. An anticholinergic bronchodilator. Am Rev Respir Dis. 111 (4), 419-422 (1975).
  35. Schanker, L. S., Mitchell, E. W., Brown, R. A. Jr Species comparison of drug absorption from the lung after aerosol inhalation or intratracheal injection. Drug Metab Dispos. 14 (1), 79-88 (1986).
  36. Biju, P., et al. Steroidal C-21 mercapto derivatives as dissociated steroids: discovery of an inhaled dissociated steroid. Bioorg Med Chem Lett. 21 (21), 6343-6347 (2011).
  37. West, L. J., Pierce, C. M., Thomas, W. D. Lysergic acid diethylamide: Its effects on a male asiatic elephant. Science. 138 (3545), 1100-1103 (1962).
  38. Boxenbaum, H., DiLea, C. First-time-in-human dose selection: allometric thoughts and perspectives. J Clin Pharmacol. 35 (10), 957-966 (1995).
  39. Spina, D. Current and novel bronchodilators in respiratory disease. Curr Opin Pulm Med. 20 (1), 73-86 (2014).
  40. Degeorge, J. J., et al. Considerations for toxicology studies of respiratory drug products. Regul.Toxicol.Pharmacol. 25 (2), 189-193 (1997).
  41. McClellan, R. O., Henderson, R. F. Concepts in Inhalation Toxicology. , Taylor & Francis Group. (1989).
  42. Patton, J. S., et al. The particle has landed--characterizing the fate of inhaled pharmaceuticals. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 23 Suppl 2, S71-S87 (2010).
  43. Depreter, F., Pilcer, G., Amighi, K. Inhaled proteins: Challenges and perspectives. Int J Pharm. 447 (1-2), 251-280 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Aerozol z proszku suchegoznebulizowany aerozol ciekłysystem dozowania pyłu Wrightaimpaktor kaskadowymonitor aerozolu w czasie rzeczywistymuchwyt filtra absolutnegomikronizacja w młynie strumieniowymręczna prasa hydraulicznawysokosprawna chromatografia cieczowa
Wdychanie suchego proszku i aerozoli w nebulizach farmaceutyków dostarczanych myszom przy użyciu systemu naświetlania tylko przez nos
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.