Artykuł metodologiczny

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

DOI:

10.3791/55464

⸱

17 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research in Mass Spectrometry, York University, 3The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka wewnętrznie nieuporządkowane (IDP) od dawna stanowią wyzwanie dla biologów strukturalnych ze względu na brak stabilnych drugorzędowych elementów strukturalnych. Wymiana wodorowo-deuterowa (HDX) mierzona w szybkich skalach czasowych jest wyjątkowo dostosowana do wykrywania struktur i sieci wiązań wodorowych, które są krótko zapełnione, co pozwala na scharakteryzowanie przejściowych konformerów w natywnych zespołach. Sprzężenie HDX ze spektrometrią mas oferuje kilka kluczowych korzyści, w tym wysoką czułość, niskie zużycie próbki i brak ograniczeń co do wielkości białka. Technika ta znacznie się rozwinęła w ciągu ostatnich kilku dekad, w tym dzięki możliwości monitorowania czasów etykietowania HDX w milisekundowej skali czasowej. Ponadto, dzięki włączeniu przepływu pracy HDX do platformy mikroprzepływowej, w której znajduje się mikroreaktor proteazy kwasowej, jesteśmy w stanie zlokalizować właściwości dynamiczne na poziomie peptydów. W tym badaniu wykorzystano spektrometrię mas z jonizacją elektrorozpylającą w czasie (TRESI-MS) sprzężoną z HDX, aby uzyskać szczegółowy obraz struktury resztkowej w białku tau, a także przesunięć konformacyjnych wywołanych hiperfosforylacją.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat poczyniono znaczne postępy w rozwoju technik analitycznych przeznaczonych do pomiaru struktury i dynamiki białek1,2,3,4. Podczas gdy krystalografia rentgenowska pozostaje głównym narzędziem do określania struktury białek, potrzebne są wysokie stężenia białka i konieczna jest szeroko zakrojona optymalizacja w celu wytworzenia kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Białka, które są trudne do krystalizacji, takie jak białka związane z błoną i wewnętrznie nieuporządkowane, były klasycznie badane za pomocą wymiany wodorowo-deuterowej (HDX) NMR5. Jednak w ostatnich dziesięcioleciach sprzężenie spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) z HDX szybko zyskało na popularności6,7.

Spektrometria mas oferuje rozwiązanie wielu ograniczeń stawianych przez krystalografię rentgenowską i NMR. W szczególności stwardnienie rozsiane jest bardzo wrażliwe (wymagane stężenia od nM do μM) i praktycznie nie ma ograniczeń co do wielkości białka. Ponadto wysoki cykl pracy analizy stwardnienia rozsianego pozwala na badanie białek w trakcie ich przemiany enzymatycznej, nieprawidłowego fałdowania, kompleksowania i innych biologicznie istotnych procesów. Procesy te często zachodzą w skali od milisekundy do sekundy i wymagają szybkiego wymieszania odczynników przed analizą.

Rozwój Time-Resolution ElectroSpray Ionization (TRESI) przez Wilsona i Konermanna w 2003 roku pozwolił na monitorowanie reakcji w pseudo-czasie rzeczywistym przez ESI-MS. Ich konfiguracja obejmowała mieszalnik kapilarny z płynnie regulowaną objętością komory reakcyjnej8. Urządzenie składa się z dwóch koncentrycznych kapilarn, z wewnętrzną kapilarą uszczelnioną i nacięciem wyciętym w jej boku, aby umożliwić mieszanie w wąskiej przestrzeni międzykapilarnej od wcięcia do końca wewnętrznej kapilary (zwykle 2 mm). W przypadku zastosowania do eksperymentów HDX, wewnętrzna kapilara przenosi interesujące białko, zewnętrzna kapilara przenosi znakowany roztwór D2O, który następnie ulega mieszaniu z białkiem przed wejściem do regulowanej komory reakcyjnej, co pozwala na znakowanie HDX przed bezpośrednim przeniesieniem do źródła ESI.

Krótko mówiąc, HDX opiera się na wodorach amidowych w szkielecie, które są wymieniane z atomami deuteru w roztworze9,10. Wymiana jest katalizowana zasadą przy fizjologicznym pH, przy czym kataliza kwasowa staje się powszechna przy pH poniżej około 2,6. Szybkość wymiany opiera się na czterech głównych czynnikach: pH, temperaturze, dostępności rozpuszczalnika i wewnątrzcząsteczkowych wiązaniach wodorowych. Ponieważ dwa pierwsze czynniki są utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu, szybkość wymiany, szczególnie w pozycjach amidów szkieletu peptydowego, zależy przede wszystkim od struktury białka11. Ciasno pofałdowane obszary z rozległymi, stabilnymi sieciami wiązań wodorowych w α-helisach i β-arkuszach będą pobierać deuter w znacznie wolniejszym tempie w porównaniu z pętlami i nieuporządkowanymi obszarami (a czasami wcale)12. Pozwala to na globalną analizę białek, w której zaburzenia struktury (np. podczas agregacji lub wiązania substratu) prowadzą do zróżnicowanego wychwytu deuteru (ryc. 1).

Kinetyczny mieszalnik kapilarny może być włączony do platformy mikroprzepływowej zawierającej komorę proteolityczną do lokalizacji poboru deuteru. Ta komora proteolityczna jest utrzymywana w niskim pH, aby skutecznie wygasić reakcję wymiany i wymaga unieruchomionej proteazy kwasowej w celu strawienia białka do zlokalizowanych peptydów (ryc. 2). Monitorowanie wymiany szkieletowej w skali od milisekundy do sekundy jest szczególnie ważne dla charakterystyki zmian konformacyjnych w trudnych do scharakteryzowania regionach pętli, stopionych kulełkach i wewnętrznie nieuporządkowanych białkach (IDPs)13,14. Alternatywnie, TRESI-HDX może być również używany do charakteryzowania białek, które obecnie nie mają rozwiązanej struktury atomowej za pomocą metod krystalografii rentgenowskiej i NMR, przy użyciu wymiany deuteru sprzężonej z podejściem algorytmu COREX (DX-COREX)15,16. Ten szczegółowy protokół zastosuje TRESI-HDX do badania tau, IDP, zarówno w jego natywnej formie, jak i w stanie patogennej hiperfosforylacji. Podczas gdy rodzime tau jest jednym z najlepiej przebadanych IDP, niewiele wiadomo o jego amyloidogennym odpowiedniku13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem. Opary wytwarzane przez ablację laserową poli(metakrylanu metylu) (PMMA) mogą być toksyczne. Upewnij się, że grawer laserowy jest podłączony do działającego systemu wentylacji. Podczas budowy urządzenia mikroprzepływowego należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym stosowanie kontroli technicznej (wyciąg, pojemnik na ostre przedmioty) i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, maska na twarz, rękawice, fartuch laboratoryjny, spodnie na całej długości, buty z zakrytymi palcami). Niezwykle ważne jest, aby w miarę możliwości używać odczynników do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), przy czym wszystkie powinny mieć klasę ACS lub wyższą, aby zmniejszyć zanieczyszczenia zakłócające podczas analizy.

1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego

  1. Budowa platformy mikroprzepływowej PMMA
    1. Zaopatrz się w standardowy blok PMMA (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) i dokonaj laserowej ablacji kanału wejściowego do wprowadzania odczynników, komory proteolizy i kanału wyjściowego za pomocą grawera laserowego17,18.
      UWAGA: Wytrawić komorę proteolizy w wydłużony owalny kształt (30 x 5 x 0,05 mm). Kanał wejściowy i wyjściowy musi rozciągać się do końca bloku PMMA i nie może być większy niż 75 μm zarówno pod względem szerokości, jak i głębokości, aby pomieścić kapilarnę o ciśnieniu 30 ga.
    2. Pokrój metalową kapilę ze stali nierdzewnej o wadze 30 ga na dwie części po około 10 cm każdy za pomocą narzędzia obrotowego z tarczą tnącą o grubości 1/64 cala. Użyj papieru ściernego, aby wygładzić końce naczyń włosowatych (można to ułatwić, oglądając pod mikroskopem świetlnym).
    3. Rozpuść kapilary w wytrawionym bloku z poli(metakrylanu metylu) za pomocą lutownicy. Kanał wejściowy zostanie podłączony do zautomatyzowanych pomp strzykawkowych, a kanał wyjściowy zostanie wykorzystany do sprzężenia z MS.
  2. Budowa mieszalnika kinetycznego o przepływie ciągłym i rozdzielczości czasowej
    1. Uzyskać kapilarę ze stopionego szkła krzemionkowego (ID: 75 μm, OD: 150 μm) o długości około 40 cm i włożyć ją do kapilary metalowej ze stali nierdzewnej o długości około 15 cm, o długości około 15 cm. W zależności od wymaganego czasu reakcji, użyj dłuższej zewnętrznej kapilary metalowej lub takiej, która ma większy ID.
      UWAGA: Określenie "prawdziwej" średnicy wewnętrznej metalowej kapilary ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych czasów reakcji. Można to zrobić, podłączając metalową kapilarnę do HPLC, przepływając rozpuszczalnik przez kapilarnę i rejestrując ciśnienie wsteczne. Można dokonać obliczenia przeciwciśnienia do średnicy wewnętrznej i określić rzeczywistą średnicę wewnętrzną metalowej kapilary. Można to obliczyć za pomocą oprogramowania Kalkulator masy cząsteczkowej (dla systemu Windows w wersji 6.49).
    2. Wykonaj nacięcie o średnicy 2 mm za pomocą ustawień grawera laserowego o małej mocy na jednym końcu wewnętrznej szklanej kapilary i uszczelnij ten koniec wewnętrznej szklanej kapilary (Rysunek 2). Alternatywnie wykonaj nacięcie za pomocą noża kapilarnego ze szkła ceramicznego lub szlifierki obrotowej z precyzyjnym ostrzem tnącym.
    3. Wyrównaj wewnętrzną szklaną kapilarnę z końcem metalowej kapilary (można to ułatwić, oglądając pod mikroskopem świetlnym).
    4. Przymocuj ten mikser kinetyczny do jednego końca trójnika mieszającego (Rysunek 2).
    5. Przymocuj kapilarę ze stopionego szkła krzemionkowego (ID: 75 μm, OD: 150 μm) o długości około 40 cm do przeciwległego końca mieszalnika kinetycznego na trójniku mieszającym. Służy do dostarczania kwasu (5% kwasu octowego, pH 2,4) w celu wygaszenia reakcji.
      UWAGA: Reagenty są dostarczane do urządzenia za pomocą gazoszczelnych strzykawek przez rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) za pomocą automatycznych pomp infuzyjnych.
  3. Aktywacja pepsyny
    1. Odważyć 20 mg pepsyny z błony śluzowej żołądka świń i zawiesić ją w 1 ml buforu sprzęgającego (0,1 M fosforanu sodu, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
    2. Odważyć 50 mg kulek agarozy aktywowanych N-hydroksysukcynimidem (NHS), dodać do ponownie zawieszonej proteazy i delikatnie obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Wirować w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać żywicę.
    4. Odessać niezwiązaną proteazę.
    5. Inkubować agarozę w 1 ml buforu blokującego (1 M Tris-HCl, pH 6,0) i delikatnie obracać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    6. Wirować w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać żywicę.
    7. Zassać bufor blokujący.
    8. Inkubować agarozę pepsyny z 1 ml 5% kwasu octowego o pH 2,4 przez 5 minut.
    9. Wiruj w dół przy 1,000 x g przez 2 minuty, aby zebrać żywicę.
    10. Odessać supernatant.
    11. Powtórz kroki 1.3.8 - 1.3.10, co daje w sumie trzy prania.
    12. Przechowuj kulki w 1 ml kwasu octowego w temperaturze 4 °C do długotrwałego stosowania.
  4. Montaż urządzenia
    1. Napełnij komorę proteolizy zawiesiną aktywowanych kulek pepsyny-agarozy w 5% kwasie octowym za pomocą sterylnej szpatułki.
    2. Umieść platformę mikroprzepływową PMMA pomiędzy dwoma pustymi blokami PMMA jako osłonę do uszczelnienia urządzenia, wyłożoną gumą silikonową, aby uzyskać płynne uszczelnienie.
    3. Użyj metalowych płytek zaciskowych, aby uszczelnić urządzenie.
      UWAGA: Zacisk został wykonany na zamówienie, aby pasował do platformy mikroprzepływowej i składa się z dwóch płytek o wymiarach 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm.
    4. Przepływ 5% kwasu octowego, pH 2,4 z szybkością 10 μl/min. Przepływ 50 mM buforu octanu amonu (pH 6,9) przez linię białkową z szybkością 1 μL/min.
      UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby kwas octowy stale przepływał przez urządzenie przez cały czas trwania eksperymentu. Upewnij się, że nie ma wycieków i że płyn wypływa tylko z kanału wyjściowego, który będzie służył jako źródło ESI.
    5. Sprzęgnij urządzenie z przednim końcem zmodyfikowanego kwadrupolowego spektrometru mas czasu przelotu (Q-TOF) za pomocą regulowanego izolowanego stopnia, aby uzyskać optymalne warunki do elektrorozpylania.
      UWAGA: Przełącznik obejściowy został wprowadzony w celu symulacji obecności komercyjnego źródła ESI. 17

2. Czasowo-rozdzielcza jonizacja ElectroSpray Wymiana wodorowo-deuterowa

  1. Pozyskiwanie pepsyny i samych białek Spectra
    UWAGA: Akwizycja ESI-MS odbywa się w trybie jonów dodatnich o napięciu od +4 500 do +5 000, potencjale deklastrowania 60 V i potencjale ogniskowania 250 V. Widma są rejestrowane w zakresie 350-1,500 m/z z szybkością skanowania 1 s-1.
    1. Zdobądź spektrum tylko pepsyny. Wszelkie piki pojawiające się w tym widmie są odejmowane po dodaniu białka.
    2. Wprowadź 50-100 μM białka tau/fosfo-tau (oczyść i przygotuj zgodnie z wcześniejszym opisem13,19) z szybkością 1 μL/min tam, gdzie wcześniej płynął bufor octanu amonu o pojemności 50 mM.
    3. Uzyskaj widmo tylko białka.
  2. Pozyskiwanie punktów czasowych
    1. Podczas gdy 100 μM białka tau/fosfo-tau przepływa z prędkością 1 μL/min, wprowadźD2Oz szybkością 3 μL/min przez trójnik i pozwól zareagować w mieszalniku kinetycznym. Odczekać, aż system osiągnie równowagę przez co najmniej 10 minut przed uzyskaniem widma.
      UWAGA: Po wymianie reakcja znakowania jest wygaszana przez przepływ kwasu octowego o pH 2,4 przy 10 μl/min, a trawienie znakowanego białka zachodzi w komorze proteolitycznej.
    2. Aby wydłużyć czas etykietowania, należy ręcznie odciągnąć położenie wewnętrznej szklanej kapilary, aby osiągnąć czas mieszania od 42 ms do 8 s. Pozostawić system do zrównoważenia przez co najmniej 10 minut pomiędzy każdym cofnięciem.

3. Dane i analiza statystyczna

  1. Identyfikacja peptydów i obliczanie procentowej wymiany deuteru
    1. Wykonaj analizy widm MS za pomocą oprogramowania mMass, wersja 5.5.020.
    2. Zidentyfikuj peptydy za pomocą serwera proteomicznego ExPASy FindPept i potwierdź za pomocą dysocjacji wywołanej kolizją (CID), gdy jest to wymagane21.
      UWAGA: W tym przypadku inkorporacja deuteru została zmierzona za pomocą opracowanego przez nas oprogramowania FORTRAN do analizy rozkładu izotopowego22,23.
    3. Oblicz teoretyczne współczynniki wewnętrzne na podstawie sekwencji pierwotnej za pomocą narzędzia internetowego SPHERE22,24.
    4. Dopasuj dane za pomocą pojedynczej wykładniczej regresji nieliniowej i znormalizuj za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk (np. SigmaPlot).
      UWAGA: Stosunek kint / kobs daje współczynnik ochrony (PF), półilościową miarę stopnia, w jakim dany region jest zorganizowany w zespole konformacyjnym
      5. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profile trawienia rodzimego i fosfo-tau były podobne, co dało pokrycie sekwencji odpowiednio 77,1 i 71,7%. Wartości wychwytu deuteru w każdym peptydzie określono poprzez dopasowanie obserwowanych rozkładów izotopowych do rozkładów teoretycznych wygenerowanych za pomocą opracowanego przez nas oprogramowania FORTRAN. Przedstawiono najlepsze rozkłady dopasowania (rysunek 3a) wraz z powiązanymi wartościami wychwytu deuteru. Następnie generowane są profile kinetyczne wychwytu,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy metody biologii strukturalnej, takie jak krystalografia rentgenowska i NMR, są korzystne, ponieważ zapewniają niezwykle szczegółowe struktury białek, obrazy te są często statyczne. Charakterystyka gatunków przejściowych i słabo ustrukturyzowanych domen nadal pozostaje nieuchwytna, gdy bada się ją tymi konwencjonalnymi metodami. Dlatego, aby uzyskać dynamiczny wgląd w tego typu systemy, ważne jest, aby pracować w szybkich skalach czasowych. Udało nam się zastosować TRESI-HDX-MS w celu uzyskania szczegółowych i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy Dr. Markusowi Zweckstetterowi za dostarczenie pliku współrzędnych pdb dla 'rodzimego' zespołu tau przewidzianego na podstawie jego pracy NMR, z narzędziami do analizy dostarczonymi przez Dr. Adnana Sljokę. Finansowanie tych prac zostało zapewnione przez program grantowy ENGAGE Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poli(metakrylan metylu) lub PMMAProfesjonalne tworzywa sztuczneSACR.250CCP8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm
Kapilara ze stopionego szkła krzemionkowegoPolymicro Technologies106815-0018ID: 75 µ m, OD: 150 i mikro;
m Kapilary metaloweMcMaster-Carr28 ga – 89875K97
30 ga  - 89875K99
Rurka fluorowanego etylenu propylenu (FEP)IDEX1477
1548		ID: 0.007", OD: 1/16"
ID: 0.020", OD: 1/16"
Standardowy obcinak do rur polimerowychIDEXA-327do 1/16" i 1/8" Rurki OD
Mikrostatyczny trójnik mieszającyIDEXM-540do 1/16 " Rurka OD
lub
trójnik ze stali nierdzewnej, 0,25  mm BoreValco Instruments Co., Inc. (VICI)ZT1Cdla 1/16" Rurka zewnętrzna
Trójnik PEEK do 1/16 " Rurka ODIDEXP-727
10-32 żeńsko-żeńska LuerIDEXP-659
10-32 PEEK Nakrętka dwuskrzydłowaIDEXF-300
Tuleja do 1/16 " Rurka ODIDEXF-142
Seria 100 Narzędzie obrotoweDremelF013010001
Tarcze tnąceJobmateGrubość 1/64 "
Stereomaster Mikroskop z zoomem cyfrowymFisher Scientific12-563-411
LutownicaMastercraft58-6301-2
Laser uniwersalnyVersaLaser
StrzykawkiHamilton81220500  &mikro; Pompy
strzykawkoweAparat Harvard70-4501
Nazwa>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
NHS-aktywowane agaroząFisher Scientific26196
Pepsyna z błony śluzowej żołądka świniSigma-AldrichP6887-250MG
Tlenek deuteruSigma-Aldrich151882-10X0,6ML
Kwas octowySigma-Aldrich695092-100ML
Woda klasy HPLCFisher ScientificW5-4
Octan amonuSigma-AldrichA7330-500G
Fosforan soduFisher ScientificS369-500
Chlorek soduFisher ScientificS671-3
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software/Narzędzia online
CorelDraw X3
Wersja 6.49Open Source MS Tool
dingerWersja 1.5.0.4
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Spektrometr masowy ABSCIEX
o pojemności L Kalkulator masy cząsteczkowej Corel mMass Wersja 5.5.0 Open Source MS Tool ExPASy FindPept Szwajcarski Instytut Bioinformatyki SigmaPlot Systat Wersja oprogramowania 11.0 PyMOL Schrö

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
  2. Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
  3. Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
  4. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574(2015).
  5. Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
  6. Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
  7. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  8. Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
  9. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
  10. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
  11. Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
  12. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
  13. Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416(2015).
  14. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
  15. Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
  16. Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
  17. Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
  18. Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
  19. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
  20. Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
  21. Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
  22. Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
  23. Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
  24. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
  25. Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
  26. Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
  27. Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
  28. Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
  29. Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
  30. Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
  31. Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
  32. Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza struktury bia ekbia ka wewn trznie nieuporz dkowanedynamika bia ka taumapowanie na poziomie peptydowymskala czasowa milisekundowaplatforma mikroprzep ywowaprzesuni cia konformacyjne

Powiązane artykuły