Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Zmiany w ekspresji, dystrybucji i montażu receptorów zostały powiązane z wieloma różnymi chorobami, w tym chorobą Alzheimera, chorobą Parkinsona, mukowiscydozą i uzależnieniem od narkotyków1^,2,3,4,5. Na przykład nikotyna i inne ligandy nikotynowe wpływają na transport nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR), prowadząc do zmian w transporcie, ekspresji i regulacji w górę^{1,2,5,6,7,8,9,10}. Nikotyna zwiększa całkowitą liczbę złożonych nAChR w komórce, zwiększa transport w kierunku błony plazmatycznej i zmienia składanie podjednostek, aby faworyzować wersję niektórych podtypów o wysokiej czułości. Rozwiązanie wyraźnych zmian w transporcie, składaniu i ekspresji receptorów w modelu choroby dostarcza kluczowych szczegółów mechanistycznych, które są niezbędne do zdefiniowania celów leku. Idealnym podejściem byłoby szybkie różnicowanie receptorów wewnątrzkomórkowych od tych zlokalizowanych na błonie plazmatycznej. Jest to szczególnie trudne w przypadkach, gdy większość danego białka znajduje się wewnątrzkomórkowo, na przykład w przypadku nAChR. Ponieważ większość nAChR jest zlokalizowana w retikulum endoplazmatycznym, tradycyjne pomiary nie mają rozdzielczości czasoprzestrzennej niezbędnej do określenia lokalizacji i zmian w transporcie wzdłuż szlaku wydzielniczego. Badania nad transportem i ekspresją receptorów nAChR prowadzono głównie przy użyciu wiązania radioligandów¹¹, testów biotynylacji¹², western blotting¹³, lub technik immunoprecypitacji¹². Zależą one od specyficzności wiązania cząsteczki reporterowej lub utrwalenia komórek i nie mają zdolności do jednoczesnego rozróżniania receptorów rezydentnych w błonie plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych. Dlatego badania nad składaniem kanałów jonowych i dynamiką pęcherzyków w dużej mierze opierały się na technikach elektrofizjologicznych o niskiej przepustowości¹⁴.

Doskonała rozdzielczość przestrzenna i czasowa jest możliwa dzięki postępom w mikroskopii fluorescencyjnej. Genetycznie kodowane cząsteczki reporterowe, takie jak białko zielonej fluorescencji (GFP) i jego warianty, eliminują niespecyficzne problemy z wiązaniem i zwiększają czułość¹⁵. Wrażliwy na pH wariant GFP, znany jako superekliptyczna pHluorin (SEP), może być wykorzystany do wykorzystania nieodłącznych różnic pH między przedziałami w komórce w celu określenia lokalizacji5^{,7,8,9,16,17,18}. SEP fluoryzuje, gdy pH jest wyższe niż 6, ale pozostaje w stanie wyłączonym przy niższym pH. Dlatego receptory oznaczone SEP po stronie światła są wykrywane, gdy są obecne w retikulum endoplazmatycznym (ER) lub po wprowadzeniu do błony plazmatycznej (PM), ale nie wtedy, gdy są ograniczone do pęcherzyka transportowego. Manipulowanie zewnątrzkomórkowym pH w kontakcie z receptorami na błonie plazmatycznej w konsekwencji zmienia fluorescencję, a tym samym wykrywanie tych receptorów. Jeśli ta sama komórka jest sekwencyjnie obrazowana zarówno przy neutralnym pH zewnątrzkomórkowym, jak i przy pH niższym niż 6, różnica między obrazami jest przypisywana receptorom znajdującym się na błonie plazmatycznej. Pozwala to na jednoczesny pomiar receptorów wewnątrzkomórkowych (obwodowych ER) i rezydujących w błonie komórkowej^5,7,8,9. Przypadki przyczepienia pojedynczych pęcherzyków mogą być również rozwiązane, gdy pH zewnątrzkomórkowe jest neutralne. Gdy pęcherzyk transportujący o niskim pH połączy się z błoną plazmatyczną, luminalna strona pęcherzyka jest wystawiona na działanie obojętnego roztworu zewnątrzkomórkowego, powodując przejście wykryte jako wybuch fluorescencji^7,18,19,20. SEP umożliwia pomiar receptorów zlokalizowanych w błonie plazmatycznej i obwodowej retikulum endoplazmatycznym oraz zapewnia środki do pomiaru transportu receptorów między tymi regionami subkomórkowymi^5,7,18.

Aby osiągnąć wyższą rozdzielczość na błonie plazmatycznej, receptor z genetycznie kodowanym SEP jest obrazowany za pomocą mikroskopii florescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM). Metoda ta jest szczególnie przydatna, jeśli większość receptorów jest zlokalizowana w regionach wewnątrzkomórkowych, ponieważ TIRFM zwiększa widoczność błony plazmatycznej. TIRFM umożliwia również rozwiązanie dynamiki transportu pojedynczych pęcherzyków przenoszących receptory znakowane SEP po wprowadzeniu do PM. Całkowite odbicie wewnętrzne występuje na styku materiałów o różnych współczynnikach załamania, takich jak między komórką a szklanym szkiełkiem nakrywkowym^21,22. SEP fluoryzuje po napromieniowaniu wzbudzeniem o długości fali 488 nm, które jest zorientowane na uzyskanie całkowitego wewnętrznego odbicia na granicy faz roztworu szkła i ogniwa. W ten sposób powstaje fala ulotna, która wnika w głąb próbki na około 150 nm, wzbudzając tylko fluorofory w tej objętości. Wykrywane są tylko receptory zawierające SEP w środowisku o neutralnym pH w tym zakresie wzbudzenia, odpowiadające receptorom znajdującym się na błonie plazmatycznej lub obwodowej retikulum endoplazmatycznym. Ponieważ detekcja jest ograniczona do wzbudzenia przez falę ulotną, fluorescencja tła z obszaru wewnątrzkomórkowego jest zmniejszona, a stosunek sygnału do szumu zwiększony^21,22. Ponadto, ponieważ promieniowanie nie przenika do większości komórki, fotouszkodzenia są zminimalizowane, co umożliwia obrazowanie żywych komórek w miarę upływu czasu. W rezultacie, TIRFM w połączeniu z genetycznie kodowanym SEP zapewnia wysoką rozdzielczość i czułość wymaganą do pomiaru lokalizacji subkomórkowej i dynamiki transportu receptorów błonowych wzdłuż szlaku wydzielniczego.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

1. Utrzymuj mysie komórki nerwiaka zarodkowego 2a (N2a) w pożywce wzrostowej.
   1. Przygotuj 500 ml pożywki wzrostowej N2a z 200 ml pożywki Dulbecco's Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, 250 ml pożywki o obniżonej surowicy, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny/streptomycyny (100x).
   2. Utrzymać komórki w kolbie T75 w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
   3. W razie potrzeby podziel komórki w stosunku 1:15 lub przy około 80-90% zbieżności. Zazwyczaj jest to 2-3 razy w tygodniu.
2. Naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm pokryć poli-D-lizyną.
   1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym dodać 200 μl 0,1 μg/ml poli-D-lizyny na szklane dno sterylnego naczynia o średnicy 35 mm.
   2. Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
   3. Ostrożnie spłucz naczynie środkiem ddH₂O 3-4 razy.
   4. Pozostaw naczynia do całkowitego wyschnięcia na dłużej niż 1 godzinę.
   5. W razie potrzeby wysterylizuj naczynia za pomocą światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Płytki N2a komórki do obrazowania TIRFM.
   1. Usuń pożywkę wzrostową z przylegających komórek.
   2. Oderwać komórki od kolby, inkubując z 1 ml 1x trypsyna (+EDTA) przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
   3. Dezaktywuj trypsynę, dodając 9 ml pożywki wzrostowej. Wymieszaj podłoże, trypsynę i oderwane komórki za pomocą pipety.
   4. Wizualnie policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz prawidłową objętość, aby dodać 90 000 komórek do każdego naczynia ze szklanym dnem pokrytym poli-D-lizyną. Gęstość ta jest wymagana do wydajnej transfekcji i obrazowania TIRF pojedynczych komórek.
   5. Dodaj 2 ml pożywki wzrostowej do każdego naczynia ze szklanym dnem zawierającego 90 000 komórek.
   6. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniem_{CO2 przez} 16-24 godziny.
4. Transfekcja N2a
   1. Uzyskać konstrukt plazmidowy zawierający fluorofor SEP wbudowany w zewnątrzkomórkowy region białka będącego przedmiotem zainteresowania. Do wygenerowania konstruktu można użyć standardowych technik klonowania, takich jak amplifikacja PCR⁵.
      UWAGA: SEP powinien być włączony do zewnątrzkomórkowego regionu białka błonowego, tak aby znajdował się w świetle retikulum endoplazmatycznego lub pęcherzyków transportowych i był wystawiony na działanie roztworu zewnątrzkomórkowego, gdy znajduje się na błonie plazmatycznej. SEP ma podobny rozmiar do GFP i można stosować podobne strategie klonowania.
   2. Zastąp pożywkę wzrostową na pożywkach posianych 1,5 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM), około 30 minut przed dodaniem odczynnika do transfekcji.
      UWAGA: Aby zbadać zmiany w receptorach wywołane przez lek, można dodać odpowiednie stężenie leku w czasie transfekcji.
   3. Dodać 500 ng każdego pożądanego konstruktu plazmidowego do 250 μl zredukowanej pożywki surowicy (probówka 1).
   4. Dodać 2 μl odczynnika do transfekcji do oddzielnej probówki zawierającej 250 μl zredukowanej pożywki surowicy. Inkubować probówkę 2 w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Stosunek odczynnika do transfekcji do plazmidowego DNA powinien być zoptymalizowany w celu ekspresji każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
   5. Połączyć probówki 1 i 2, aby uzyskać roztwór zawierający 500 μl odczynnika do transfekcji i mieszaniny plazmidu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
   6. Dodać 500 μl mieszanki do transfekcji do wstępnie posianych komórek, aby uzyskać łączną objętość 2 ml na naczynie.
   7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniem_{CO2 przez} 24 godziny.
   8. Po 24 godzinach usuń mieszankę do transfekcji i przepłucz komórki pożywką wzrostową, a następnie dodaj 2 ml pożywki wzrostowej do każdego naczynia.
      UWAGA: Jeśli lek został dodany w momencie transfekcji, można go ponownie uzupełnić na tym etapie.
   9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniem_{CO2 przez} 24 godziny.
   10. Komórki obrazu 48 godzin po transfekcji.

2. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

1. Konfiguracja obrazowania
   1. Wykonaj obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego ze stolikiem skanującym, jak pokazano na rysunku 1. Wymaga to ustawienia źródła lasera DPSS 488 nm, silnika krokowego do regulacji położenia wiązki 488 nm oraz obiektywu o dużej aperturze numerycznej (1,49 NA) 60X lub 100X zanurzonego w oleju.
   2. Przepuść wiązkę lasera przez odpowiedni filtr wzbudzenia (pasmo przepustowe 488/10 nm). Wyrównaj spolaryzowaną wiązkę laserową przez światłowód jednomodowy podłączony do wyrzutni zamontowanej na silniku krokowym. W trybie epifluorescencji wiązka wzbudzenia jest wyśrodkowana w środku tylnej apertury obiektywu.
   3. Aby uzyskać TIRF, użyj silnika krokowego, aby przesunąć skupioną wiązkę laserową przez tylny otwór soczewki obiektywu, aż do osiągnięcia kąta krytycznego i wiązka nie będzie już przesyłana przez próbkę, a zamiast tego zostanie całkowicie odbita od granicy faz szklana-komórka.
   4. Rejestruj obrazy za pomocą EMCCD (512 x 512 pikseli) sterowanego za pomocą oprogramowania do obrazowania (np. Metamorph) z odpowiednim filtrem emisyjnym zamontowanym na ścieżce emisji (525/50 nm).
2. Przygotowanie roztworu do obrazowania
   1. Przygotować 200 ml roztworu zewnątrzkomórkowego (ECS), mieszając 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES i 10 mM glukozy w ddH₂O. Roztwory podstawowe NaCl, KCl, MgCl₂ i CaCl₂ można przygotować z wyprzedzeniem i połączyć ze świeżym HEPES i glukozą w dniu obrazowania.
   2. Doprowadzić pH roztworu zawierającego 100 ml ECS do pH 7.4. Doprowadzić pozostałe 100 ml ECS do pH 5,4. Przepłukać transfekowane komórki 2 ml ECS (pH 7,4).
   3. Dodać 2 ml ECS (pH 7,4) do transfekowanych komórek przed obrazowaniem.
3. Obrazowanie żywych komórek w TIRF
   1. Włącz cały system, w tym laser 488 nm, kamerę, stolik translacyjny i program do obrazowania. Skoncentruj wiązkę epifluorescencji i dostosuj moc do około 1 mW przy obiektywie 60X.
   2. Dodaj olej do celu i umieść naczynie z transfekowanymi komórkami na etapie translacji. Zabezpiecz antenę na miejscu za pomocą uchwytów scenicznych, aby upewnić się, że nie porusza się w stosunku do stolika, aby komórki można było obrazować wiele razy.
   3. W trybie epifluorescencji ustaw ostroskop i zlokalizuj fluorescencyjne, transfekowane komórki. Komórki pozostaną wyostrzone na kilku płaszczyznach ostrości. Zlokalizuj pojedyncze, odizolowane komórki, aby kontynuować pracę z TIRF.
   4. W programie do obrazowania ustaw czas ekspozycji na 200 ms i zoptymalizuj intensywność fluorescencji, ustawiając wzmocnienie EM.
   5. Przekształć wiązkę laserową w TIRF, przesuwając wiązkę w poprzek obiektywu w sposób stopniowy za pomocą silnika krokowego. W miarę zbliżania się kąta krytycznego wiązka będzie widocznie przesuwać się w poprzek krawędzi naczynia, aż zbiegnie się w punkcie całkowitego wewnętrznego odbicia na płaszczyźnie próbki.
   6. Sprawdź, czy komórki są w trybie TIRF, regulując pokrętło ostrości. W TIRF można skupić tylko jedną płaszczyznę komórek (tj. około 150 nm od szklanego interfejsu), co daje bardzo wyraźny obraz błony plazmatycznej o wysokiej rozdzielczości.
4. Obrazowanie SEP w celu określenia lokalizacji subkomórkowej
   1. Zlokalizuj zdrowe, transfekowane, pojedyncze komórki w płaszczyźnie obrazowania.
   2. Uzyskaj skoncentrowany obraz komórki o pH 7,4. Receptory znakowane SEP na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym powinny być widoczne.
   3. Szybko zablokuj wiązkę lasera przed dotarciem do próbki, aby zapobiec fotowybielaniu.
   4. Zapamiętaj pozycje stolika odpowiadające każdej komórce za pomocą oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, które może rejestrować wiele lokalizacji xy.
   5. Powtórz kroki 2.4.1-2.4.4 dla 20-30 komórek na czaszę, używając oprogramowania do rejestrowania pozycji każdej komórki.
   6. Po zebraniu wszystkich obrazów komórek o pH 7,4 ręcznie usuń roztwór ECS o pH 7,4 za pomocą pipety. Nie dotykaj naczynia, ponieważ może to przesunąć zapamiętane pozycje stage.
   7. Ostrożnie dodaj do naczynia 2 ml pH 5,4 ECS i odczekaj 10 minut. W tym czasie zapisz wcześniej pozyskane obrazy.
   8. W identycznym zestawie warunków używanych do zbierania obrazów o pH 7,4 przesuń stolik do każdej zapisanej pozycji i uzyskaj obraz tej samej komórki o pH 5,4. Komórki powinny wyglądać na mniej zdefiniowane, ponieważ cała wykryta fluorescencja pochodzi z receptorów znakowanych SEP w retikulum endoplazmatycznym. Zapisz obrazy komórek o pH 5,4.
5. Obrazowanie pojedynczych przypadków wprowadzenia pęcherzyka w żywych komórkach
   1. Zastąp pożywkę wzrostową transfekowanych komórek 2 ml ECS o pH 7,4 lub pożywką L-15 firmy Leibovitz. pH podłoża L-15 firmy Leibovitz jest niezależne od_CO2, co w razie potrzeby pozwala na obrazowanie przez długi czas.
   2. Umieść naczynie z transfekowanymi komórkami na stoliku mikroskopu. Zabezpiecz pojedynczą komórkę w TIRF i skoncentruj się, wykonując krok 2.3 powyżej.
   3. Jeśli jest na wyposażeniu, ustaw autofokus tak, aby ostrość nie dryfowała w okresie obrazowania.
   4. Nagraj serię 1,000 klatek, ciągle rejestrując obrazy z szybkością 200 ms. W tym czasie widoczne będą wybuchy fluorescencji, odpowiadające pęcherzykom transportowym o niskim pH łączącym się z błoną plazmatyczną, wystawiając SEP na zewnątrzkomórkowe pH 7,4.
   5. Znajdź kolejną pojedynczą komórkę i powtórz powyższy krok. W razie potrzeby zresetuj autofokus.

3. Analiza obrazu i przetwarzanie danych

1. Analiza fluorescencji SEP w celu określenia lokalizacji subkomórkowej
   1. Otwórz obrazy komórek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Metamorph lub ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Odejmij tło od obrazów o pH 5,4 i pH 7,4, korzystając z ustawienia toczącej się kuli.
   2. Użyj progu opartego na intensywności, aby określić ilościowo fluorescencję z pojedynczej komórki. Ręcznie wybierz interesujący Cię obszar wokół komórki na obrazie pH 7,4.
   3. Zmierz obszar komórki, średnią intensywność i zintegrowaną gęstość za pomocą wtyczki w ImageJ lub za pomocą wbudowanej funkcji "Zmierz" w zakładce Analizuj.
   4. Powtórz kroki 3.1.1-3.1.3 dla tej samej komórki o pH 5,4, ostrożnie dostosowując w ten sam sposób próg oparty na intensywności i obszar zainteresowania.
   5. Po uzyskaniu zintegrowanej gęstości dla obrazów komórek zarówno przy pH 7,4, jak i 5,4, oblicz gęstość zintegrowaną błony plazmatycznej, odejmując wartość pH 5,4 od wartości pH 7,4. Różnica odpowiada względnej liczbie receptorów na błonie plazmatycznej w regionie wzbudzenia TIRF.
   6. Jako miarę transportu należy obliczyć względny procent receptorów znakowanych SEP zlokalizowanych na błonie plazmatycznej w porównaniu z pozostałymi receptorami widocznymi w objętości wzbudzenia TIRF, dzieląc gęstość zintegrowaną błony plazmatycznej przez całkowitą gęstość zintegrowaną przy pH 7,4, pomnożoną przez 100.
2. Analiza zdarzeń związanych z wprowadzaniem pojedynczych pęcherzyków
   1. Otwórz serię 1,000 obrazów tiff za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Odejmij tło od wszystkich klatek, korzystając z ustawienia toczącej się kuli.
   2. Dostosuj balans kolorów nagrania, aby zmaksymalizować intensywne obszary odpowiadające zdarzeniom wprowadzania pęcherzyków. Ręcznie policz wybuchy fluorescencji trwające dłużej niż 3 klatki (>600 ms).

Włączenie SEP do receptora umożliwia bezpośrednie wykrycie tego receptora w żywej komórce. W połączeniu z TIRFM pozwala to na ocenę względnych poziomów ekspresji na błonie plazmatycznej i rozmieszczenia receptorów w lokalizacjach subkomórkowych w regionie wzbudzenia TIRF. Można również rozwiązać przypadki transportu pojedynczych pęcherzyków.

Względne poziomy ekspresji receptorów znakowanych SEP na błonie plazmatycznej

Fluorescencja SEP po wzbudzeniu jest podyktowana pH otaczającego roztworu. Gdy SEP jest połączony z receptorami rezydującymi w błonie komórkowej, zewnątrzkomórkowym pH można manipulować, aby włączyć lub wyłączyć tę fluorescencję5,7,8,9,17. Gdy pH roztworu zewnątrzkomórkowego wynosi fizjologiczne 7,4, receptory zarówno z błony plazmatycznej, jak i retikulum endoplazmatycznego w obszarze wzbudzenia TIRF fluoryzują. Roztwór zewnątrzkomórkowy można następnie wymienić na identyczny roztwór o pH 5,4. Powoduje to, że SEP rezydujący w błonie plazmatycznej przechodzi w stan wyłączenia, co oznacza, że cała obserwowana fluorescencja pochodzi teraz z retikulum endoplazmatycznego. Rysunek 2 przedstawia przykład komórek zobrazowanych zarówno przy pH 7,4 (A), jak i pH 5,4 (B). Względna liczba receptorów na błonie plazmatycznej w porównaniu z obwodową retikulum endoplazmatycznym w obszarze wzbudzenia TIRF jest następnie obliczana matematycznie, odejmując zintegrowaną gęstość fluorescencji przy pH 5,4 od gęstości przy pH 7,4, przedstawionej na rysunku 2C. Ta obliczona gęstość zintegrowana błony plazmatycznej odpowiada względnej liczbie receptorów znakowanych SEP zlokalizowanych na błonie plazmatycznej i w objętości wzbudzenia TIRF. Ponieważ błona plazmatyczna i pobliska obwodowa retikulum endoplazmatyczne są preferencyjnie wzbudzane przez TIRF, to porównanie dystrybucji subkomórkowej odbywa się między receptorami zlokalizowanymi w tych regionach, a nie całym wewnątrzkomórkowym regionem komórki.

Subkomórkowa dystrybucja receptorów znakowanych SEP

Handel receptorami można zmierzyć, porównując stosunek receptorów znajdujących się na błonie plazmatycznej do retikulum endoplazmatycznego. Dzielenie gęstości zintegrowanej błony plazmatycznej przez całkowitą gęstość zintegrowaną przy pH 7,4, pomnożoną przez 100, daje względny procent receptorów znakowanych SEP zlokalizowanych na błonie plazmatycznej5,7. Jako kontrola, brefeldyna A może być dodawana do komórek w celu zakłócenia wewnątrzkomórkowego transportu białek. Gdy brefeldyna A jest obecna, praktycznie wszystkie wykryte receptory w regionie wzbudzenia TIRF będą ograniczone do retikulum endoplazmatycznego, co spowoduje niższy % PM. Dodatkowo, zmutowany (Δ508-I539T) regulator transbłonowy mukowiscydozy (Δ508-I539T-CFTR) może być stosowany jako kontrola pozytywna. W obecności dostępnego na rynku VX-809 ekspresja Δ508-I539T-CFTR na powierzchni komórki wzrasta od 2 do 3-krotnie.

Pojedyncze zdarzenia wprowadzania pęcherzyków

SEP nie fluoryzuje ani nie fotowybiela w niskim pH pęcherzyka transportowego, ale odzyskuje fluorescencję po wystawieniu na zewnątrzkomórkowe pH 7,4 na błonie komórkowej7,16,18. Zdarzenia insercji są wizualizowane jako wybuch fluorescencji na błonie plazmatycznej trwający co najmniej 3 klatki (600 ms), odpowiadający pełnemu wtopieniu się pęcherzyka transportowego do błony plazmatycznej, jak pokazano na rysunku 3. Przed włożeniem (ryc. 3B) nie ma zauważalnego pęknięcia. Wzrost intensywności fluorescencji obserwuje się, gdy pęcherzyk transportowy dociera (ryc. 3C), dyfundując przez błonę (ryc. 3D-3G), aż do włączenia się do masowej fluorescencji komórki (ryc. 3H-3I).

Rysunek 1: Schemat mikroskopu TIRF. Ta konfiguracja TIRF wykorzystuje laser DPSS o długości fali 488 nm do wzbudzenia SEP, światłowód sprzężony z silnikiem krokowym w celu dostosowania krytycznego kąta wiązki wzbudzenia poprzez translację wiązki przez tylny otwór obiektywu. Komórki są obrazowane za pomocą obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 60X, 1,49 NA. Emisja jest wykrywana za pomocą urządzenia sprzężonego z ładunkiem zwielokrotniającym elektrony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Ekspresja i transport na błonie plazmatycznej. Komórka N2a wykazująca ekspresję α3-sep/β4-wt nAChRs przy pH 7,4 (A) wykazuje receptory zlokalizowane na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym. Przy pH 5,4 (B) receptory na błonie plazmatycznej nie fluoryzują, więc widoczne są tylko receptory rezydentne retikulum endoplazmatycznego. Różnica między gęstością zintegrowaną przy pH 7,4 a pH 5,4 (C) odpowiada receptorom zlokalizowanym w błonie komórkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Zdarzenie wprowadzenia pojedynczego pęcherzyka. Komórka N2a eksprymująca α3-sep / β4-wt nAChRs o zewnątrzkomórkowym pH 7,4 pokazano w (A). Bezpośrednio przed insercją (B) nie jest widoczny wybuch fluorescencji. Przybywa pęcherzyk transportowy przenoszący SEP (C), a receptory znakowane SEP dyfundują przez błonę plazmatyczną (DG), aż stają się nie do odróżnienia od wcześniej wstawionych receptorów (H-I). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.