Artykuł metodologiczny

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55498

⸱

1 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Streszczenie

Większość białek działa w połączeniu z innymi; dlatego kluczowe jest scharakteryzowanie tych jednostek funkcjonalnych, aby w pełni zrozumieć procesy biologiczne. Oczyszczanie powinowactwa sprzężone ze spektrometrią mas (AP-MS) stało się metodą z wyboru do identyfikacji interakcji białko-białko. Jednak konwencjonalne badania AP-MS dostarczają informacji na temat interakcji białek, ale informacje organizacyjne są tracone. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy strategię odkrywania odrębnych zespołów funkcjonalnych, w które może być zaangażowane białko, poprzez rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa przed ich scharakteryzowaniem za pomocą spektrometrii mas. Kompleksy białkowe wyizolowane przez oczyszczanie powinowactwa białka przynęty za pomocą znacznika epitopowego i elucji konkurencyjnej są rozdzielane za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy. Porównanie profili migracji białek poprzez profilowanie korelacji przy użyciu ilościowej spektrometrii mas pozwala na przypisanie oddziałujących białek do odrębnych jednostek molekularnych. Metoda ta jest w stanie rozwiązać kompleksy białkowe o bliskiej masie cząsteczkowej, które mogą nie zostać rozwiązane za pomocą tradycyjnych technik chromatograficznych, takich jak filtracja żelowa. Mając niewiele więcej pracy niż konwencjonalny AP-geLC-MS/MS, wykazaliśmy, że strategia ta może w wielu przypadkach być wystarczająca do uzyskania informacji topologicznych kompleksu białkowego jednocześnie do identyfikacji interakcji białkowych.

Wprowadzenie

W komórkach większość białek spełnia swoje funkcje poprzez przejściowe interakcje białko-białko lub poprzez tworzenie stabilnych zespołów białkowych. Scharakteryzowanie interakcji białkowych ma kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia procesów komórkowych. Oczyszczanie powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas (AP-MS) jest jedną z najczęściej stosowanych strategii identyfikacji interakcji z białkami natywnymi. Znacząca poprawa możliwości instrumentów osiągnięta w ciągu ostatniej dekady sprawiła, że podejście to stało się niezwykle skuteczne. Ważne jest, aby zauważyć, że interakcje zidentyfikowane w eksperymentach AP-MS obejmują mieszankę bezpośrednich i pośrednich powiązań między przynętą a zdobyczą. Ponadto często białka biorą udział w kilku różnych kompleksach w tym samym kontekście komórkowym, które mogą pełnić różne role biologiczne, a zatem interakcje zidentyfikowane przez AP-MS mogą reprezentować mieszankę różnych zespołów białek lub jednostek funkcjonalnych. Nie jest możliwe uzyskanie takich informacji topologicznych a priori z jednowymiarowych list białek wygenerowanych przez proste eksperymenty AP-MS. Technika ta może być jednak dalej wykorzystywana do definiowania architektury kompleksów białkowych poprzez połączenie jej z jedną lub kilkoma metodami rozwiązywania tych zespołów.

W celu rozwiązania topologii interakcji białkowych zidentyfikowanych przez AP-MS, zastosowano kilka strategii. Jednym ze sposobów jest przeprowadzenie iteracyjnych eksperymentów AP-MS przy użyciu zdobyczy zidentyfikowanych w poprzedniej rundzie eksperymentów jako przynęty 1. Chociaż jest to bardzo pouczające, jest to dość pracochłonne zadanie zarówno eksperymentalnie, jak i analitycznie. Sieciowanie białek w połączeniu ze spektrometrią mas jest coraz częściej wykorzystywane do uzyskiwania informacji topologicznych o kompleksach białkowych 2,3,4,5. Jednak analiza obliczeniowa usieciowanych peptydów nadal pozostaje trudnym zadaniem, a zatem stanowi wąskie gardło w przepływie pracy. Pojawienie się odczynników sieciujących MS powinno ułatwić mapowanie reszt aminokwasowych, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie w oddziałujących białkach 6,7. Inną alternatywą jest połączenie oczyszczania powinowactwa z wcześniejszymi technikami separacji ortogonalnej 8,9. Frakcjonowanie chromatograficzne za pomocą filtracji żelowej lub wymiany jonowej lub frakcjonowanie gradientowe sacharozy są ostatnio stosowane w połączeniu z ilościową spektrometrią mas do opisywania kompleksów wielobiałkowych na poziomie całego systemu, z pominięciem etapu izolacji złożonej 10,11,12,13. Elektroforeza w monoforze w monochromii poliakrylamidowej (BN-PAGE) jest szeroko stosowana do badania interakcji z białkami natywnymi, zazwyczaj z udziałem kompleksów białek błony mitochondrialnej 14. Ta technika separacji została również niedawno wykorzystana w połączeniu z bezznacznikową kwantyfikacją białek i profilowaniem korelacji, nie tylko na kompleksach mitochondrialnych 15,16,17, ale także do odkrywania innych kompleksów białkowych z całych komórek 18,19. Postawiliśmy hipotezę, że połączenie oczyszczania powinowactwa z późniejszymi natywnymi podejściami do frakcjonowania i ilościowym MS powinno zapewnić użyteczną strategię rozwiązywania wielu zespołów białkowych zawierających określone białko.

Tutaj opisujemy metodę, która łączy ogólne oczyszczanie powinowactwa oparte na epitopach z niebieską natywną elektroforezą w żelu poliakrylamidowym izolowanych kompleksów, a następnie ilościową spektrometrią mas i profilowaniem korelacji białek, w celu rozwiązania wielu zespołów, w które białko może być zaangażowane. Wykorzystujemy mysie embrionalne komórki macierzyste, w których białko będące przedmiotem zainteresowania połączone ze znacznikiem epitopu ulega ekspresji z endogennego locus, aby osiągnąć liczebność bliską fizjologicznej i zapewnić wydajną natywną izolację kompleksu. Takie podejście odkrywa wiele interakcji, w które angażuje się białko, rozkładając je na odrębne zespoły w oparciu o ich profile korelacji, nie wymagając przy tym więcej pracy niż konwencjonalny geLC-MS 20.

Protokół

1. Izolacja natywnych kompleksów białkowych poprzez powinowactwo do FLAG

  1. Przygotowania
    1. Przygotuj 37 °C łaźnia wodna do rozmrażania osadu komórkowego.
    2. Schłodzić mikrocentryfugę do 4 °C.
    3. Umieść w lodzie kilka probówek do mikrocentryfugi o różnych rozmiarach (1,5 ml, 15 ml) oraz homogenizator.
    4. Przygotować 10 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) i przechowywać w lodzie. Bezpośrednio przed użyciem buforu dodać 10 μL 1 M DTT oraz rozkruszonej tabletki inhibitorów proteaz bez EDTA.
  2. Przygotowanie kulek sprzężonych z przeciwciałami
    UWAGA: Kulki powlekane przeciwciałami można przygotować z wyprzedzeniem do tygodnia i przechowywać w lodówce do momentu użycia. Białko G wykazuje wyższe powinowactwo niż białko A do podtypów immunoglobulin większości gatunków, z wyjątkiem królika IgG, w przypadku którego wyższe powinowactwo wykazuje białko A.
    1. Przemywanie 50 μL magnetycznych kuleczek powlekanych proteiną G: przeniesienie 50 μL przenieść zawiesinę kulek do probówki do mikrocentryfugi, umieścić probówkę w magnesie w celu zgromadzenia kulek na ściance probówki i usunąć ciecz. Resuspender kulki w 0,5 ml PBS z dodatkiem 0,01% Tween-20.
    2. Umieść probówkę w magnesie, aby zgromadzić kuleczki na ściance probówki, a następnie usuń ciecz. Resuspenduj kuleczki w 40 μL buforu PBS z 0,01% Tween-20. Dodać 10 μg (10 μL (z roztworu zapasowego o stężeniu 1 mg/mL) przeciwciała M2 anty-FLAG. Inkubować z rotacją przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść probówkę w magnesie, aby zgromadzić kuleczki na ściance naczynia, a następnie usuń ciecz. Przemyj kuleczki 0,5 ml buforu PBS z dodatkiem 0,01% Tween-20.
    4. W celu sieciowania przeciwciała z kuleczkami należy przemyć kuleczki dwukrotnie 1 ml 0,2 M trietanolaminy o pH 8,2. Następnie kuleczki należy resuspender w 1 ml 20 mM DMP (dimetylopimelimidatu) w 0,2 M trietanolaminie o pH 8,2 (roztwór DMP powinien zostać przygotowany bezpośrednio przed użyciem). Inkubować z rotacją w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    5. Umieść probówkę w magnesie. Usuń nadsącz i resuspenduj kulki w 0,5 ml 50 mM Tris-HCl o pH 7,5. Inkubuj w rotacji w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    6. Przemyć koraliki 3 razy 0,5 ml buforu PBS z 0,1% Tween-20. Pozostawić koraliki w ostatniej porcji buforu do momentu ich użycia.
  3. Oczyszczanie powinowactwa oparte na znaczniku FLAG
    UWAGA: Należy zadbać o to, aby kuleczki nie pozostawały bez buforu przez dłuższy czas. Wszystkie bufory i probówki powinny być przez cały czas przechowywane w lodzie. Poniższy protokół został zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów białkowych z 2-5 x 108 komórki (10–20 mg lizatu białkowego) wykazujące endogenny poziom białka z tagiem FLAG 20.
    1. Rozmrozić pellet komórkowy w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C do momentu rozpoczęcia topnienia. Wyjąć probówkę z łaźni, delikatnie nią zakręcić, aż osad całkowicie się rozmrozi, a następnie niezwłocznie umieścić probówkę z zawiesiną komórkową w lodzie.
    2. Do zawiesiny komórkowej dodać 5 ml schłodzonego w lodzie buforu do lizy (zawierającego DTT i inhibitory proteaz), a następnie wymieszać poprzez delikatne wirowanie naczynia. Inkubować w lodzie przez 10 min.
    3. Przenieś lizat do schłodzonego homogenizatora Dounce'a. Przeprowadź lizę, wykonując 20–30 ruchów ciasno dopasowanym tłuczkiem (do momentu ustąpienia wyraźnej lepkości). Przenieś homogenizat do schłodzonych probówek do mikrocentryfugi.
    4. Wirować przy 18 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieś oczyszczony lizat do czystej, schłodzonej probówki. Pozostaw 50 μL pozostałości lizatu. Pobrać 35 μL alikwot lizatu w celu oznaczenia stężenia białka i monitorowania procesu oczyszczania.
    6. Usuń PBS z 0,1% Tween-20 z kulek. Resuspenduj kulki w 1 ml lizatu i wymieszaj z pozostałą częścią lizatu. Inkubuj mieszaninę na rotatorze w 4 °C przez 1-2 h.
    7. Zbierz kuleczki na ściance probówki za pomocą magnesu. Zbierz k 30 μL pobrać alikwot supernatantu, a pozostałą jego część odrzucić. Kuleczki zawiesić ponownie w 0,5 ml buforu IPP150 (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP-40), pipetując 4–6 razy. Przenieść do schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
    8. Powtórzyć płukanie 0,5 ml buforu IPP150 jeszcze dwa razy.
    9. Przemyć paciorki trzykrotnie 0,5 ml natywnego buforu elucyjnego FLAG (20 mM Bis-Tris pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM kwas ε-aminokapronowy). Podczas ostatniego płukania przenieść paciorki do nowej schłodzonej probówki. Całkowicie usunąć bufor.
    10. Resuspendować kuleczki w 100 μL z 200 μg/mL peptyd 3x FLAG w natywnym buforze elucyjnym. Inkubować w 4 °C przez 10 min przy łagodnym obrocie.
    11. Zebrać kuleczki za pomocą magnesu i przenieść nadsącz do nowej, schłodzonej probówki.
    12. Powtórz kroki 1.3.10-1.3.11 dwukrotnie. Połącz wszystkie eluaty.
    13. Skoncentrować eluat do objętości 25 μL w jednostce filtra odśrodkowego (nominalna granica odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa, PES) poprzez wirowanie z przyspieszeniem 10 000 x g przy 4 °CPrzenieść zagęszczony eluat do nowej schłodzonej probówki i dodać glicerol 50% do uzyskania stężenia końcowego 5%. Zagęszczony eluat można przechowywać w 4 °C przez noc, jeśli jest to wymagane.

2. Blue Native PAGE

  1. Przygotowania
    1. Przygotować 1 L 1x buforu anodowego do native PAGE, 1x ciemnoniebieskiego buforu katodowego do native PAGE oraz 1x jasnoniebieskiego buforu katodowego do native PAGE.
    2. Wyjąć grzebień z gotowego żelu native PAGE 3-12% i dwukrotnie wypłukać studzienki 1x ciemnoniebieskim buforem katodowym do native PAGE. Wypełnić studzienki 1x ciemnoniebieskim buforem katodowym do native PAGE. Umieścić żel w komorze elektroforetycznej, ale nie dodawać ciemnoniebieskiego buforu katodowego do komory katody (wewnętrznej).
  2. Przebieg elektroforezy
    1. Przygotować próbkę: do 25 μL stężonego eluatu dodać odpowiednią objętość 4x buforu do nakładania próbek w warunkach natywnych oraz dodatku do próbek 0.5% G-250, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 1x i 0.005%.
    2. Nanieść próbkę oraz natywne markery masy cząsteczkowej, pozostawiając pomiędzy nimi pustą studzienkę. Do wszystkich pozostałych pustych studzienek nanieść 10-20 μL 1x buforu do nakładania próbek w warunkach natywnych.
    3. Wypełnić komorę katody (wewnętrzną) 200 mL 1x ciemnoniebieskiego buforu katodowego do native PAGE, czyniąc to ostrożnie, aby nie zakłócić próbek. Wypełnić komorę anody (zewnętrzną) 550 mL 1x buforu anodowego do native PAGE.
    4. Prowadzić elektroforezę przy napięciu 150 V przez 30 min. Przerwać bieg, usunąć ciemnoniebieski bufor katodowy za pomocą pipety serologicznej i zastąpić go 1x jasnoniebieskim buforem katodowym. Kontynuować elektroforezę przez 60 min. Żel można prowadzić w temperaturze pokojowej lub w 4 °C; temperatura może wpływać na strukturę kompleksów białkowych.
  3. Barwienie żelu
    1. Otworzyć kasetę z żelem i usunąć jedną z jej płytek. Żel pozostanie przytwierdzony do drugiej płytki kasety. Przenieść żel do kuwety lub naczynia zawierającego wystarczającą ilość roztworu utrwalającego (40% metanol, 2% kwas octowy), aby przykrył żel, i inkubować przez 30 min przy delikatnym wytrząsaniu.
    2. Usunąć roztwór utrwalający i dodać wystarczającą ilość wody, aby przykryła żel. Żel można zeskanować do późniejszego wglądu.

3. Analiza spektrometrią mas

Uwaga: Wszystkie kolejne kroki powinny być, jeśli to możliwe, wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić czystość próbek. Wszystkie roztwory należy przygotować z wody klasy HPLC. Omów ten protokół z laboratorium spektrometrii mas, które będzie przeprowadzać analizę.

  1. Przygotowania
    1. Umieść płytkę 96-dołkową z dnami stożkowymi na drugiej płytce 96-dołkowej w celu zbierania odpadów. Przebij dno dołków płytki 96-dołkowej z dnami stożkowymi za pomocą igły 21 G.
    2. Przemyj dołki perforowanej płytki 96-dołkowej.
      1. Dodaj 200 μL do studzienek przepercjonowanej płytki. Inkubować stos płytek w wytrząsarce przez 10 min.
      2. Wirować z prędkością 500 x g przez 1 min, aby ciecz przepłynęła przez otwory do płytki do zbierania odpadów. Odrzucić ciecz odpadową.
      3. Powtórz kroki 3.1.2.1-3.1.2.2 jeszcze dwa razy.
      4. Napełnić dołki perforowanej płytki 96-dołkowej za pomocą 150 μL 50 mM wodorowęglanu amonu (świeżo przygotowanego).
    3. Przemyj dołki 96-dołkowej płytki do filtracji odśrodkowej.
      1. Umieść standardową płytkę 96-dołkową pod płytką do filtracji odśrodkowej w celu zbierania odpadów. Dodaj 200 μL 50% acetonitrylu i 0,25% kwasu mrówkowego do każdego dołka płytki do filtracji odwirowującej.
      2. Wiruj stos płytek z prędkością 200 x g przez 1 min. Usuń odpad.
      3. Powtórzyć kroki 3.1.3.1–3.1.3.2 jeszcze dwa razy.
  2. Wycinanie z żelu i trawienie w żelu
    UWAGA: Podczas wycinania żelu należy zidentyfikować i odnotować fragmenty żelu odpowiadające poszczególnym standardom białkowym. Standardy białkowe mogą zostać wykorzystane do oszacowania przybliżonej masy cząsteczkowej wszystkich wyciętych fragmentów żelu.
    1. Umieść żel wraz z płytką szklaną na czystej powierzchni. Podziel ścieżkę zawierającą próbkę na 48 identycznych plastrów (1,5 mm x 5 mm). Każdy plaster (z wyjątkiem pięciu ostatnich plastrów u góry żelu) podziel na 2-3 mniejsze fragmenty i umieść je sekwencyjnie w poszczególnych dołkach przeporcowanej i wypłukanej płytki 96-dołkowej.
    2. Dodaj 50 μL acetonitrylu do każdej studzienki. Inkubować płytkę wstrząsając przez 30–60 min. Usunąć ciecz poprzez wirowanie, zgodnie z opisem w kroku 3.1.2.2.
    3. Dodaj 200 μL do każdego dołka 2 mM TCEP w 50 mM wodorowęglanie amonu. Inkubować płytkę z wytrząsaniem przez 30 min w temperaturze pokojowej. Usunąć ciecz poprzez wirowanie, zgodnie z opisem w kroku 3.1.2.2.
    4. Dodaj 200 μL 4 mM jodooctanu w 50 mM wodorowęglanie amonu do każdej studzienki. Inkubować płytkę z wytrząsaniem przez 30 min w temperaturze 37 °C w ciemności. Usunąć ciecz poprzez wirowanie, zgodnie z opisem w kroku 3.1.2.2.
    5. Dodaj 150 μL w 50 mM wodorowęglanie amonu oraz 50 μL acetonitrylu i inkubować płytkę z wstrząsaniem przez 30 min w temperaturze pokojowej. Powtarzać ten etap płukania tyle razy, ile będzie wymagane, aż z fragmentów żelu całkowicie zniknie niebieski kolor.
    6. Odwodnij fragmenty żelu poprzez dodanie 200 μL czystego acetonitrylu i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 20 min, aż fragmenty żelu staną się białe i nieprzezroczyste. Usunąć acetonitryl.
    7. Dodaj 150 μL 0,001 mg/ml trypsyny (klasy sekwencyjnej) w zimnym 50 mM wodorowęglanie amonu do każdego dołka. Inkubować płytkę z wytrząsaniem w 37 °C przez 2 h. Po 1 h należy sprawdzić, czy fragmenty żelu są przykryte cieczą; jeśli tak nie jest, należy dodać kolejne 50-100 μL w 50 mM wodorowęglanie amonu. Po 2 h w 37 °Ckontynuuj trawienie w temperaturze 25 °C przez noc.
    8. Pod płytką zawierającą żel należy umieścić czystą płytkę o stożkowym dnie, dbając o prawidłową orientację obu płytek. Ciecz zawierającą peptydy należy zebrać poprzez wirowanie z prędkością 200 x g przez 1 min.
    9. Umieść płytkę zawierającą peptydy w ewaporatorze odwirującym i odparuj ciecz, wykonując jednocześnie następny krok.
    10. Dodaj 150 μL 50% acetonitrylu i 0,25% kwasu mrówkowego do fragmentów żelu. Inkubować przy potrząsaniu w 37 °C przez 30 min.
    11. Zbierz ciecz na częściowo osuszoną płytkę z kroku 3.2.9 poprzez wirowanie z prędkością 200 x g przez 1 min. Kontynuuj odparowywanie z płytki zawierającej peptydy podczas wykonywania następnego kroku.
    12. Powtórz kroki 3.2.10-3.2.11.
    13. Dodaj 200 μL czystego acetonitrylu do każdej studni płytki zawierającej fragmenty żelu. Inkubować z wstrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    14. Zgromadzić ciecz w płytce zawierającej peptydy poprzez wirowanie z prędkością 200 x g przez 1 min.
    15. Należy upewnić się, że końcowe stężenie acetonitrylu we wszystkich dołkach przekracza 55%. W razie potrzeby należy dodać dodatkową ilość czystego acetonitrylu.
    16. Przenieś roztwory peptydów do wypłukanej płyty do filtracji odśrodkowej. Pod płytą umieść czystą płytę z dnem stożkowym w celu zebrania peptydów. Wiruj stos płyt z prędkością 200 x g przez 1 min.
    17. Odparować ciecz z płytki z okrągłym dnem, aż do całkowitego wyschnięcia dołków. Płytkę można przykryć silikonową pokrywą i przechowywać w temperaturze -20 °C na tym etapie.
    18. Ponownie rozpuścić peptydy w 32 μL 0,5% kwasem mrówkowym przy energicznym wstrząsaniu przez 15 min. Dodać 8 μL z 400 mM wodorowęglanu amonu i inkubować przy intensywnym wstrząsaniu przez 15 min. Wirować płytkę przy 200 x g przez 1 min. Przykryć pokrywką silikonową i przechowywać płytkę w temperaturze -20 °C do czasu analizy spektrometrią mas.
  3. Spektrometria masowa
    UWAGA: Analizę peptydów należy przeprowadzić na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości, stosując metody zgodne z proteomiką typu shotgun. Akwizycja zależna od danych (DDA) jest najczęściej stosowaną konfiguracją układu LC-tandem MS dla tego rodzaju analizy i powinna zostać zoptymalizowana pod kątem efektywnej identyfikacji peptydów, minimalizując redundantne sekwencjonowanie oraz selekcję kandydatów powyżej poziomu szumu tła. Widma mas w skanie analizy masy pierwszego stopnia (MS1) powinny być rejestrowane w trybie profilowym. Zaleca się preferencyjny wybór jonów dwu- i trzykrotnie naładowanych do analizy masy drugiego stopnia (MS2). Zakres mas m/z 400–1600 jest odpowiedni do identyfikacji większości peptydów o długości od 8 do 30 aminokwasów. Poniżej przedstawiono protokół analizy z wykorzystaniem spektrometru mas Orbitrap.
    1. Wstrzyknąć 20 μL próbki na analizę z wykorzystaniem automatycznego próbnikowania systemu nanoLC-MS/MS. Odsolić i zagęścić peptydy na kolumnie C18 w fazie odwróconej (100 μm śr. 2 cm).
    2. Rozdzielanie peptydów na analitycznej kolumnie C18 (75 μm (śr. wewn. 15 cm), stosując 30-minutowy gradient liniowy acetonitrylu/0,1% kwasu mrówkowego w zakresie 4–28% przy przepływie 300 nL/min.
    3. Analizę peptydów w spektrometrze mas należy przeprowadzić przy użyciu metody akwizycji zależnej od danych (DDA) typu top 10 z następującymi parametrami: zakres m/z 380–1600, rozdzielczość 30 000 przy m/z 400, szerokość izolacji 2 Th, wykluczanie dynamiczne w zakresie ± 10 ppm przez 45 s oraz wartość docelowa automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1 x 10^6.6 dla MS i 5 000 dla MS/MS, maksymalny czas wtrysku 150 ms dla MS i 100 ms dla MS/MS.

4. Analiza danych

  1. Identyfikacja i kwantyfikacja białek przy użyciu programu MaxQuant
    1. Użyj bezpłatnego oprogramowania MaxQuant, aby zidentyfikować i skwantyfikować białka w każdej frakcji żelu na podstawie surowych danych z spektrometrii mas.
      UWAGA: MaxQuant obsługuje dane generowane przez proteomikę shotgun z wykorzystaniem akwizycji zależnej od danych (data-dependent acquisition). Dane MS z frakcji żelu Blue Native powinny być analizowane partiami jako oddzielne eksperymenty, a nie jako frakcje jednego eksperymentu łączącego wszystkie wycinki żelu. Zaznacz pole iBAQ, aby przeprowadzić obliczenia stechiometryczne. Szczegółowe protokoły przeszukiwania baz danych i kwantyfikacji białek przy użyciu programu MaxQuant opisano w 21,22.
  2. Analiza profilu białek przy użyciu programu Perseus
    1. Użyj bezpłatnego oprogramowania Perseus, aby wyświetlić profile migracji zidentyfikowanych białek i porównać je za pomocą analizy statystycznej.
      UWAGA: Ogólna dokumentacja dotycząca obsługi programu Perseus jest dostępna pod adresem http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Przykładowy zestaw danych jest dostępny jako dane uzupełniające.
    2. Prześlij plik proteingroups.txt wygenerowany przez analizę w programie MaxQuant, zawierający identyfikacje białek i wartości kwantyfikacji dla wszystkich frakcji żelu. Przenieś wartości Intensity do pola Main (Rycina 1). Pojawi się macierz zawierająca wszystkie identyfikacje białek w wierszach oraz frakcje żelu w kolumnach.
    3. Usuń wpisy odpowiadające dopasowaniom odwróconym (reverse hits), białkom zidentyfikowanym wyłącznie po miejsce modyfikacji oraz potencjalnym zanieczyszczeniom, wybierając opcję Filter rows based on categorical column z rozwijanego menu Filter rows (Rycina 2).
    4. Znormalizuj intensywności frakcji każdego białka w całym profilu względem całkowitej intensywności białka, wybierając opcję Divide z rozwijanego menu Normalize, a następnie Sum (Rycina 3). Pojawi się nowa macierz.
    5. Wyświetl wykresy profili migracji wszystkich białek, wybierając Profile Plot z rozwijanego menu Visualization (Rycina 4).
    6. Wybierz opcję Filter rows based on valid values z rozwijanego menu Filter rows. W polu liczby wymaganych wartości poprawnych (number of valid values required) wprowadź 1.
    7. Przeprowadź hierarchiczną analizę skupień zidentyfikowanych białek we wszystkich frakcjach żelu Blue Native, wybierając Hierarchical clustering z rozwijanego menu Clustering/PCA. Odznacz pole Columns tree (Rycina 5). Skupienia są wizualizowane na mapie ciepła (heat-map) w zakładce Clustering obok macierzy (Rycina 6).
    8. Zlokalizuj w dendrogramie skupienie zawierające białko przynętę (bait protein). Pozostałe składniki skupienia reprezentują białka migrujące wspólnie z przynętą, a zatem są potencjalnymi białkami oddziałującymi lub podjednostkami tego samego kompleksu.

Proces przesyłania danych w interfejsie oprogramowania; wybór macierzy i wprowadzanie danych o intensywności; przewodnik proceduralny.
Rysunek 1. Zrzut ekranu okna przesyłania danych w programie Perseus. Na rysunku przedstawiono kroki ładowania danych dotyczących identyfikacji i kwantyfikacji białek do programu Perseus. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Proces filtrowania danych w interfejsie oprogramowania; wybór filtra, zastosowanie kryteriów kategorycznych.
Rycina 2. Zrzut ekranu okna programu Perseus służącego do filtrowania wpisów odpowiadających zanieczyszczeniom, odwrotnym trafieniom (reverse hits) oraz białkom zidentyfikowanym według miejsca. Wybranie opcji Filter rows by categorical column otwiera nowe okno służące do wyboru typów wpisów białkowych, które mają zostać usunięte ze zbioru danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Proces normalizacji danych w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego, przedstawiający równanie Σ z wyborem sumy, analiza.
Rycina 3. Zrzut ekranu okna normalizacji w programie Perseus. Wybranie opcji Divide w menu Normalization otwiera nowe okno z różnymi opcjami. Wybranie Sum dzieli wartość intensywności białka w każdej frakcji przez całkowitą intensywność tego białka we wszystkich frakcjach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza danych proteomicznych, schemat z wykresami profili i ustawieniem macierzy dla ilościowych profili migracji.
Rysunek 4. Zrzut ekranu programu Perseus przedstawiający wykresy profili migracji. W macierzy poniżej profili można zaznaczyć białka, aby wyróżnić odpowiadający im profil. Pasek narzędzi służy do edycji i eksportu profili. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat konfiguracji klastrowania hierarchicznego; wyświetlone kroki generowania dystansu L1, dendrogramu i mapy ciepła.
Rycina 5. Zrzut ekranu okna klastrowania hierarchicznego w programie Perseus. Na rycinie przedstawiono ustawienia klastrowania hierarchicznego białek z wykorzystaniem metryki dystansu Manhattan (L1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Interfejs oprogramowania do analizy skupień z dendrogramem i mapą ciepła do wizualizacji i eksportu danych.
Rycina 6. Zrzut ekranu programu Perseus przedstawiający dendrogram i mapę ciepła intensywności białek. Przebieg pracy po prawej stronie głównego panelu pokazuje każdy wykonany krok oraz wynikową macierz i może służyć do cofania dowolnego etapu. Przebieg pracy może być również rozgałęziony od dowolnej macierzy pośredniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Obliczanie stechiometrii względnej
    1. Wybierz podjednostki kompleksu białkowego na podstawie ich współklasteryzacji z białkiem przynętą i wyznacz szczyt(y) profilu, w których występują.
    2. Użyj wartości iBAQ uzyskanych z analizy MaxQuant dla każdej podjednostki w każdej frakcji osobno i znormalizuj je przez odpowiadającą im wartość iBAQ przynęty w tej frakcji.
    3. Przedstaw znormalizowane wartości iBAQ dla przynęty i podjednostek kompleksu białkowego na wykresie w obrębie frakcji wybranego szczytu i zastosuj regresję liniową. Oblicz względną ilość podjednostki kompleksu w stosunku do przynęty, porównując trendy ich znormalizowanych wartości iBAQ.
  2. Szacowanie wielkości kompleksu białkowego
    1. Użyj standardów białkowych do obliczenia przewidywanych mas cząsteczkowych dla odpowiadających im fragmentów żelu Blue Native z toru z próbką. Na ich podstawie stwórz model regresji liniowej, nanosząc fragmenty żelu na oś x, a masy cząsteczkowe na oś y.
    2. Wykorzystaj model do oszacowania zaobserwowanego zakresu masy cząsteczkowej kompleksu(ów) białkowych na podstawie fragmentów żelu Blue Native, w których zostały one zidentyfikowane.

Wyniki

Przebieg strategii powinowactwa do oczyszczania białek w natywnych warunkach z wykorzystaniem barwnika Blue i profilowania korelacyjnego białek metodą spektrometrii mas (ABC-MS) przedstawiono na Ryc. 7. Natywne kompleksy białkowe wokół białka docelowego są izolowane poprzez oczyszczanie powinowactwa z użyciem przeciwciał przeciwko znacznikowi epitopowemu (w tym przypadku FLAG) oraz elucji konkurencyjnej. Kompleksy są rozdzielane za pomocą BN-PAGE, a cała ścieżka żelu jest wycinana na 48 sekcji i przygotowywana do analizy shotgun LC-MS/MS. Ilościowe dane MS są wykorzystywane do wygenerowania profilu migracji dla każdego zidentyfikowanego białka w trakcie rozdzielania w natywnych warunkach z użyciem barwnika Blue. Białka oddziałujące ze sobą w celu utworzenia wyraźnego kompleksu wykazują podobne profile migracji z nakładającymi się piktami. Gdy białko docelowe uczestniczy w więcej niż jednym zgrupowaniu, w jego profilu migracji obserwuje się wiele piktów, pod warunkiem że subkompleksy mieszczą się w granicach rozdzielczości żelu BN-PAGE. Systematyczne porównanie profili migracji można przeprowadzić za pomocą profilowania korelacyjnego białek z wykorzystaniem grupowania hierarchicznego. Dendrogram oraz intensywności piktów dla wszystkich frakcji są wizualizowane na mapie ciepła, co ułatwia identyfikację oddziałujących białek należących do odrębnych kompleksów białkowych (Ryc. 8).

Strategię tę zastosowaliśmy do analizy partnerów oddziałujących z Mta2, główną podjednostką kompleksu przebudowy chromatyny NuRD 20. Jak pokazano na Rysunku 9, profil migracji Mta2 wykazał dwa piki o różnej intensywności w zakresie od 700 kDa do 1,2 MDa, przy czym pik o niższej masie charakteryzował się większą obfitością. Inne główne podjednostki NuRD, w tym Mta1/3, Hdac1/2 i Mbd3, wykazały identyczny wzór rozdzielenia, choć piki dla niektórych podjednostek, a mianowicie Chd4, Gatad2a/b i Rbbp4/7, miały odwrotny rozkład obfitości (Rysunek 9A, B). W przeciwieństwie do nich, profil Cdk2ap1, czynnika regulacyjnego rekrutującego kompleks NuRD do promotorów genów Wnt 23, wykazał jedynie pik o wyższej masie (Rysunek 9C), podobnie jak Sall4, represor transkrypcyjny, o którym wykazano, że również wiąże się z NuRD 20,24,25. Zatem frakcjonowanie białek związanych z Mta2, oczyszczonych metodą powinowactwa, za pomocą BN-PAGE pozwoliło na rozdzielenie dwóch różnych form kompleksu NuRD.

Metoda ABC-MS pozwala również na identyfikację nowych interaktorów przy jednoczesnym przypisaniu ich do konkretnych jednostek białkowych. Poprzez analizę klastrów białek i intensywności frakcji przedstawionych na mapie ciepła wykryliśmy silną korelację między podjednostkami NuRD a Wdr5, podjednostką regulacyjną kompleksu metylotransferazy MLL 26, przy czym Wdr5 wykazywał dwa piki migracji pokrywające się z dwoma pikami NuRD (Rysunek 8), co sugeruje nową interakcję między Wdr5 a NuRD. Potwierdziliśmy tę interakcję za pomocą koimmunoprecypitacji oraz ko-migracji w chromatografii wykluczania cząsteczkowego 20.

Wybór metody obliczania miary odległości w klastrowaniu hierarchicznym wpłynie na kształt klastrów, a tym samym na korelacje. Zalecamy eksperymentowanie z różnymi miarami w celu uzyskania najlepszego dopasowania do istniejącej wiedzy o oddziaływaniach badanego białka lub kompleksu. Zazwyczaj najlepsze wyniki uzyskiwaliśmy przy zastosowaniu miary odległości Manhattan (L1) 20. W publikacjach dotyczących identyfikacji kompleksów w oparciu o alternatywne techniki frakcjonowania zgłaszano również wykorzystanie korelacji Pearsona lub miary odległości euklidesowej 10,11,12.

Ilościowe dane MS uzyskane z frakcji nieodnaturalniających (blue native) mogą być również wykorzystane do określenia stechiometrii kompleksów białkowych. Wartość iBAQ (ilościowe określanie zawartości na podstawie intensywności) zapewnia miarę względnej obfitości zidentyfikowanych białek 27,28. Wartości iBAQ dla członków kompleksu białkowego we wszystkich frakcjach w obrębie piku profilu migracji są normalizowane do wartości białka przynęci (bait protein) w celu uzyskania ilości względnych. Znormalizowane wartości iBAQ w obrębie piku profilu dla danego członka kompleksu białkowego powinny wykazywać trend poziomy, a wartości tego trendu odzwierciedlają stechiometrię oddziałujących białek w stosunku do białka przynęci. Bardziej szczególną reprezentację obliczeń stechiometrii przedstawiono w 20.

Schemat procesu BN-PAGE i LC-MS/MS; analiza separacji i identyfikacji białek.
Rysunek 7: Schematyczny przebieg postępowania podsumowujący strategię ABC-MS. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie 20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapa ciepła oddziaływań białkowych przedstawiająca gradient intensywności; znaczniki kDa; analiza danych frakcji BN.
Rysunek 8. Grupowanie hierarchiczne profili migracji w BN-PAGE interaktorów Mta2. Białka powiązane z Mta2 zostały zgrupowane na podstawie podobieństwa ich profili migracji. Przedstawiono jedynie podzbiór mapy ciepła zawierający kompleks NuRD (obramowany niebieską ramką). Żółta ramka wyróżnia silną korelację Wdr5 z kompleksem NuRD. Adnotowane masy cząsteczkowe oszacowano na podstawie dystansów migracji standardów białkowych przeprowadzonych w tym samym żelu. Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w czasopiśmie Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy intensywności białek pokazujące oddziaływania Mta2 w frakcjach BN; schematy A, B, C porównują dane.
Rysunek 9. Profil migracji BN-PAGE podjednostek NuRD i białek powiązanych. A) Mta2 i podjednostki NuRD wykazują podobny wzór intensywności. B) Mta2 i podjednostki NuRD o odwrotnym wzorcu intensywności. C) Mta2 i Cdk2ap1, który występuje tylko w kompleksie NuRD o wyższej masie cząsteczkowej. Adnotowane masy cząsteczkowe zostały oszacowane na podstawie profilu migracji standardów białkowych. Badania te zostały pierwotnie opublikowane w Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dopasowanie sekwencji białek, tabelaryczna analiza danych, porównanie bioinformatyczne, konserwacja sekwencji.
Dane uzupełniające: Przykładowy zestaw danych. Plik proteingroups.txt wygenerowany przez program MaxQuant, zawierający identyfikacje białek i wartości ilościowe z eksperymentu ABC-MS. Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy zastosowanie oczyszczania powinowactwa, po którym następuje elektroforeza w postaci niebieskiego natywnego żelu w połączeniu z ilościową spektrometrią mas w celu rozdzielenia kompleksów białkowych. Podejście to oferuje metodę rozplątywania jednowymiarowych list interakcji białek w funkcjonalne zespoły białek.

Przedstawiamy metodę opartą na wykorzystaniu białek znakowanych epitopami. Jeśli jednak linia komórkowa wykazująca ekspresję znakowanego białka nie jest dostępna, alternatywą może być użycie przeciwciał przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, pod warunkiem, że dostępny jest peptyd umożliwiający osiągnięcie natywnej elucji konkurencyjnej. Ilość materiału wyjściowego i ilość kulek może wymagać modyfikacji w zależności od poziomu ekspresji białka docelowego. Zazwyczaj wykonujemy ten protokół z materiałem wyjściowym 2-5 x10 8 komórek, co jest wystarczające nawet w przypadku białek o niskim poziomie ekspresji. Skład buforu do lizy należy dobrać empirycznie, aby osiągnąć prawie całkowitą rozpuszczalność przynęty. Może to być trudne dla niektórych typów białek, w szczególności białek wiążących chromatynę lub błonowych. Alternatywne opcje obejmują zwiększenie ilości soli, pod warunkiem, że badany kompleks białkowy jest stabilny w wysokiej zawartości soli, lub zastosowanie sonikacji i/lub leczenia nukleazą w celu wiązania białek chromatyny 20,29. W przypadku białek błonowych wskazana może być zmiana detergentu na DDM lub digitoninę 30. W przypadku białek wiążących DNA przydatne jest włączenie nukleazy, takiej jak benzonaza, podczas etapu oczyszczania 20. Całkowite usunięcie kwasów nukleinowych zapewnia, że wykryte interakcje zachodzą między białkami i nie są pośredniczone przez DNA.

Kluczowym elementem, który należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tego podejścia, jest stabilność badanego kompleksu. Procedura jest długa i może polegać na zachowaniu kompleksu białkowego przez noc. Osiągnęliśmy duży sukces z dwoma kompleksami przebudowującymi chromatynę (D. Bode i M. Pardo, dane nie pokazane), ale to powinno zostać ocenione. W razie potrzeby etap oczyszczania powinowactwa może zostać skrócony.

Alternatywne techniki, które umożliwiają natywne frakcjonowanie, takie jak chromatografia wykluczania wielkości, są szeroko stosowane od ponad 50 lat do charakteryzowania kompleksów białkowych. My i inni wykazaliśmy, że rozdzielczość niebieskiej natywnej PAGE jest lepsza niż ta osiągnięta przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości 20,31,32,33. Kolejną zaletą niebieskiej natywnej PAGE jest to, że nie wymaga systemów chromatograficznych, które są drogie, ale raczej wykorzystuje sprzęt elektroforetyczny do białek, który jest szeroko rozpowszechniony w laboratoriach. Jeśli chodzi o czas pracy, metoda ta nie wymaga więcej pracy niż tradycyjne podejście geLC-MS/MS lub frakcjonowanie chromatograficzne offline. Jednak, podobnie jak w przypadku większości technik frakcjonowania, ma ona ograniczenie co do ich rozdzielczości. Kompleksy, które są bardzo jednorodne lub zbliżone pod względem masy i kształtu, mogą wykraczać poza rozdzielczość oferowaną przez niebieską natywną PAGE, a zatem opisany tutaj protokół może nie być uniwersalnie skuteczny w rozdzielaniu odrębnych kompleksów ze współdzielonymi podjednostkami. Zachęcające jest to, że udało nam się wydzielić dwa bardzo podobne kompleksy tetrameryczne dzielące trzy podjednostki (M. Pardo, rękopis w przygotowaniu).

Ponieważ spektrometria mas staje się coraz bardziej czuła, w próbkach AP-MS można wykryć nawet niewielkie ilości niespecyficznych interakcji i zanieczyszczeń. Zaprezentowane tutaj podejście może pomóc w rozróżnieniu rzeczywistych interaktorów od zanieczyszczenia tła w oczyszczaniu powinowactwa poprzez skupienie uwagi na białkach z pikami migracji, które zbiegają się ze szczytami migracji przynęty o wyższej masie cząsteczkowej niż białka monomeryczne.

Kilka grup wykorzystało techniki frakcjonowania, a następnie profilowanie korelacji białek w celu wyznaczenia kompleksów białkowych w skali komórkowej bez konieczności wcześniejszej izolacji 10,11,12,34. Może to jednak spowodować niepowodzenie w wykrywaniu oddziaływań substechiometrycznych. Włączenie etapu wzbogacania poprzez oczyszczanie powinowactwa może pomóc w przezwyciężeniu tego problemu. Opisane tutaj podejście powinno być ogólnie przydatne do badania topologii kompleksów białkowych i odkrywania wielu kompleksów, w których dane białko bierze udział w tym samym kontekście komórkowym. Strategia jest prosta i łatwa do wykorzystania w laboratoriach, które mogą nie mieć drogiego sprzętu do frakcjonowania chromatograficznego do rozdzielania kompleksów białkowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust (WT098051).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białko G DynabeadsLife Technologies10003D
FLAG przeciwciało M2Sigma-AldrichF1804
Tween-20, klasa białkowa, 10% roztwórMillipore655206
dimetylopimelimidanSigma-Aldrich80490
0,2 M Bufor trietanoloaminy, pH 8,2Sigma-AldrichT0449
3x peptyd FLAGSigma-AldrichF4799
Vivaspin 5K NMWCO, PESSartoriusVS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gelLife TechnologiesBN1001
20x NativePAGE Running BufferLife TechnologiesBN2001
20x NativePAGE Technologie dodawania katodowegoBN2002
4x Bufor ładowania próbki NativePAGELife TechnologiesBN2003
NativeMARKLife TechnologiesLC0725
Dodatek do próbki NativePAGE 5% G-250 Life TechnologiesBN2004
Nunc stożkowa płyta 96-dołkowa z dnem, polipropylenThermo249944
Multiscreen HTS 96-dołkowy system filtracjiThermoMSDVN6550
Nunc 96-well cap naturalnyThermo276002
TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny)Sigma-Aldrich646547
JodoacetamidSigma-AldrichI1149
Acetonitryl, klasa HPLCFisher ScientificA/0627/17
Trypsyna, klasa sekwencjonowaniaRoche11418475001
MaxQuant (oprogramowanie)nie dotyczyNiehttp://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (oprogramowanie)N.A.Niehttp://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus
dotyczy dotyczy

Bibliografia

  1. Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
  2. Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
  3. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
  6. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  7. Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
  8. Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
  9. Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
  10. Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
  11. Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
  12. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
  13. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  14. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  15. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
  16. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340(2013).
  17. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  18. Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
  19. Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
  20. Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
  21. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  22. Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
  23. Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
  24. Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
  25. Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
  26. Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).
  29. Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
  30. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  31. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  32. Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  33. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
  34. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozdzielanie kompleks w bia kowychoczyszczanie powinowactwemanaliza spektrometri masnatywna elektroforeza w eluelucja konkurencyjnaprofilowanie migracji bia ekgrupowanie hierarchiczneidentyfikacja podkompleks w
Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.