Artykuł metodologiczny

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

DOI:

10.3791/55498

⸱

1 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość białek działa w połączeniu z innymi; dlatego kluczowe jest scharakteryzowanie tych jednostek funkcjonalnych, aby w pełni zrozumieć procesy biologiczne. Oczyszczanie powinowactwa sprzężone ze spektrometrią mas (AP-MS) stało się metodą z wyboru do identyfikacji interakcji białko-białko. Jednak konwencjonalne badania AP-MS dostarczają informacji na temat interakcji białek, ale informacje organizacyjne są tracone. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy strategię odkrywania odrębnych zespołów funkcjonalnych, w które może być zaangażowane białko, poprzez rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa przed ich scharakteryzowaniem za pomocą spektrometrii mas. Kompleksy białkowe wyizolowane przez oczyszczanie powinowactwa białka przynęty za pomocą znacznika epitopowego i elucji konkurencyjnej są rozdzielane za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy. Porównanie profili migracji białek poprzez profilowanie korelacji przy użyciu ilościowej spektrometrii mas pozwala na przypisanie oddziałujących białek do odrębnych jednostek molekularnych. Metoda ta jest w stanie rozwiązać kompleksy białkowe o bliskiej masie cząsteczkowej, które mogą nie zostać rozwiązane za pomocą tradycyjnych technik chromatograficznych, takich jak filtracja żelowa. Mając niewiele więcej pracy niż konwencjonalny AP-geLC-MS/MS, wykazaliśmy, że strategia ta może w wielu przypadkach być wystarczająca do uzyskania informacji topologicznych kompleksu białkowego jednocześnie do identyfikacji interakcji białkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W komórkach większość białek spełnia swoje funkcje poprzez przejściowe interakcje białko-białko lub poprzez tworzenie stabilnych zespołów białkowych. Scharakteryzowanie interakcji białkowych ma kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia procesów komórkowych. Oczyszczanie powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas (AP-MS) jest jedną z najczęściej stosowanych strategii identyfikacji interakcji z białkami natywnymi. Znacząca poprawa możliwości instrumentów osiągnięta w ciągu ostatniej dekady sprawiła, że podejście to stało się niezwykle skuteczne. Ważne jest, aby zauważyć, że interakcje zidentyfikowane w eksperymentach AP-MS obejmują mieszankę bezpośrednich i pośrednich powiązań między przynętą a zdobyczą. Ponadto często białka biorą udział w kilku różnych kompleksach w tym samym kontekście komórkowym, które mogą pełnić różne role biologiczne, a zatem interakcje zidentyfikowane przez AP-MS mogą reprezentować mieszankę różnych zespołów białek lub jednostek funkcjonalnych. Nie jest możliwe uzyskanie takich informacji topologicznych a priori z jednowymiarowych list białek wygenerowanych przez proste eksperymenty AP-MS. Technika ta może być jednak dalej wykorzystywana do definiowania architektury kompleksów białkowych poprzez połączenie jej z jedną lub kilkoma metodami rozwiązywania tych zespołów.

W celu rozwiązania topologii interakcji białkowych zidentyfikowanych przez AP-MS, zastosowano kilka strategii. Jednym ze sposobów jest przeprowadzenie iteracyjnych eksperymentów AP-MS przy użyciu zdobyczy zidentyfikowanych w poprzedniej rundzie eksperymentów jako przynęty 1. Chociaż jest to bardzo pouczające, jest to dość pracochłonne zadanie zarówno eksperymentalnie, jak i analitycznie. Sieciowanie białek w połączeniu ze spektrometrią mas jest coraz częściej wykorzystywane do uzyskiwania informacji topologicznych o kompleksach białkowych 2,3,4,5. Jednak analiza obliczeniowa usieciowanych peptydów nadal pozostaje trudnym zadaniem, a zatem stanowi wąskie gardło w przepływie pracy. Pojawienie się odczynników sieciujących MS powinno ułatwić mapowanie reszt aminokwasowych, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie w oddziałujących białkach 6,7. Inną alternatywą jest połączenie oczyszczania powinowactwa z wcześniejszymi technikami separacji ortogonalnej 8,9. Frakcjonowanie chromatograficzne za pomocą filtracji żelowej lub wymiany jonowej lub frakcjonowanie gradientowe sacharozy są ostatnio stosowane w połączeniu z ilościową spektrometrią mas do opisywania kompleksów wielobiałkowych na poziomie całego systemu, z pominięciem etapu izolacji złożonej 10,11,12,13. Elektroforeza w monoforze w monochromii poliakrylamidowej (BN-PAGE) jest szeroko stosowana do badania interakcji z białkami natywnymi, zazwyczaj z udziałem kompleksów białek błony mitochondrialnej 14. Ta technika separacji została również niedawno wykorzystana w połączeniu z bezznacznikową kwantyfikacją białek i profilowaniem korelacji, nie tylko na kompleksach mitochondrialnych 15,16,17, ale także do odkrywania innych kompleksów białkowych z całych komórek 18,19. Postawiliśmy hipotezę, że połączenie oczyszczania powinowactwa z późniejszymi natywnymi podejściami do frakcjonowania i ilościowym MS powinno zapewnić użyteczną strategię rozwiązywania wielu zespołów białkowych zawierających określone białko.

Tutaj opisujemy metodę, która łączy ogólne oczyszczanie powinowactwa oparte na epitopach z niebieską natywną elektroforezą w żelu poliakrylamidowym izolowanych kompleksów, a następnie ilościową spektrometrią mas i profilowaniem korelacji białek, w celu rozwiązania wielu zespołów, w które białko może być zaangażowane. Wykorzystujemy mysie embrionalne komórki macierzyste, w których białko będące przedmiotem zainteresowania połączone ze znacznikiem epitopu ulega ekspresji z endogennego locus, aby osiągnąć liczebność bliską fizjologicznej i zapewnić wydajną natywną izolację kompleksu. Takie podejście odkrywa wiele interakcji, w które angażuje się białko, rozkładając je na odrębne zespoły w oparciu o ich profile korelacji, nie wymagając przy tym więcej pracy niż konwencjonalny geLC-MS 20.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja natywnych kompleksów białkowych za pomocą FLAG Oczyszczanie powinowactwa

  1. Preparaty
    1. Ustawić łaźnię wodną o temperaturze 37 °C do rozmrażania osadu komórkowego.
    2. Schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C.
    3. Umieść kilka probówek do mikrowirówek o różnych rozmiarach (1,5 ml, 15 ml) i homogenizator w lodzie.
    4. Przygotować 10 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) i przechowywać w lodzie. Tuż przed użyciem buforu dodaj 10 μL 1 M DTT i pokruszoną tabletkę inhibitorów proteazy wolnych od EDTA.
  2. Przygotowanie kulek sprzężonych z przeciwciałami
    UWAGA: Koraliki pokryte przeciwciałami można przygotować z tygodniowym wyprzedzeniem i przechowywać w lodówce do czasu, aż będą potrzebne. Białko G ma większe powinowactwo niż białko A do większości podtypów immunoglobulin gatunków, z wyjątkiem IgG królika, do którego białko A ma większe powinowactwo.
    1. Umyj 50 μl kulek magnetycznych pokrytych białkiem G: Przenieś 50 μl zawiesiny kulek do probówki mikrowirówkowej, umieść probówkę w magnesie, aby zebrać kulki z boku probówki i usunąć płyn. Ponownie zawiesić kulki w 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
    2. Umieść rurkę w magnesie, aby zebrać koraliki z boku rurki i usunąć płyn. Ponownie zawiesić kulki w 40 μl PBS-0,01% Tween-20. Dodać 10 μg (10 μl 1 mg/ml roztworu podstawowego) przeciwciała M2 anty-FLAG. Inkubować na przemian przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść rurkę w magnesie, aby zebrać koraliki z boku rurki i usunąć płyn. Umyj koraliki 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
    4. W celu usieciowania przeciwciała z kulkami, należy przemyć kulki dwukrotnie 1 ml 0,2 M trietanoloaminy o pH 8,2. Następnie ponownie zawiesić kulki w 1 ml 20 mM DMP (dimetylopimelimidate) w 0,2 M trietanoloaminy o pH 8,2 (roztwór DMP należy przygotować na świeżo bezpośrednio przed użyciem). Inkubować z rotacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    5. Umieść rurkę w magnesie. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 0,5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5. Inkubować z rotacją w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    6. Umyj koraliki 3 razy 0,5 ml PBS-0,1% Tween-20. Pozostaw koraliki w ostatnim praniu, aż będą potrzebne.
  3. Oczyszczanie powinowactwa oparte na flagach
    UWAGA: Uważaj, aby nie pozostawiać koralików bez bufora przez dłuższy czas. Wszystkie i probówki powinny być przez cały czas przechowywane w lodzie. Poniższy protokół jest zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów białkowych z komórek 2-5 x 108 (10-20 mg lizatu białkowego) wyrażających endogenne poziomy białka oznaczonego flagą 20.
    1. Rozmrozić osad komórkowy w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aż zacznie się topić. Wyjmij probówkę z kąpieli, delikatnie nią obracaj, aż granulka całkowicie się rozmrozi i natychmiast umieść probówkę zawierającą zawiesinę komórek na lodzie.
    2. Dodaj 5 ml lodowatego buforu do lizy (zawierającego DTT i inhibitory proteazy) do zawiesiny komórek i zamieszaj, aby wymieszać. Inkubować w lodzie przez 10 minut.
    3. Przenieś lizat do zimnego homogenizatora Dounce. Lizerować 20-30 pociągnięciami za pomocą ciasnego tłuczka (aż do uzyskania wyczuwalnej lepkości). Przenieść homogenat do zimnych probówek wirówek.
    4. Wirować przy 18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieś oczyszczony lizat do czystej zimnej probówki. Zostaw 50 μl lizatu. Pobrać 35 μl podwielokrotności lizatu, aby zmierzyć stężenie białka i monitorować oczyszczanie.
    6. Usuń PBS-0.1% Tween-20 z koralików. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml lizatu i wymieszać z resztą lizatu. Inkubować mieszaninę w obracającym się kole w temperaturze 4 °C przez 1-2 godziny.
    7. Zbierz koraliki z boku rurki za pomocą magnesu. Zebrać 30 μl porcji supernatantu i odrzucić resztę supernatantu. Ponownie zawiesić kulki w 0,5 ml buforu IPP150 (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 0,1% NP-40), pipetując 4-6 razy. Przenieś do zimnej probówki o pojemności 1,5 ml.
    8. Powtórz płukanie z 0,5 ml buforu IPP150 jeszcze dwa razy.
    9. Przemyć kulki trzykrotnie 0,5 ml natywnego buforu elucyjnego FLAG (20 mM Bis-Tris pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM kwasu ε-aminokapronowego). Przy ostatnim praniu przenieś koraliki do nowej zimnej rurki. Dokładnie usuń bufor.
    10. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl 200 μg/ml 3x peptyd FLAG w natywnym buforze elucyjnym. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut, delikatnie obracając.
    11. Zbierz kulki za pomocą magnesu i przenieś supernatant do zimnej nowej probówki.
    12. Powtórz kroki 1.3.10-1.3.11 dwukrotnie. Zbierz wszystkie eluaty.
    13. Zagęścić eluat do 25 μl w odśrodkowym zespole filtrującym (graniczna nominalna masa cząsteczkowa 10 kDa, PES) przez odwirowanie przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść skoncentrowany eluat do nowej zimnej probówki i dodać 50% glicerolu do końcowego stężenia 5%. W razie potrzeby skoncentrowany eluat można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.

2. Niebieska strona natywna

  1. Preparaty
    1. Przygotuj 1 l 1x natywnego bufora anodowego PAGE, 1x natywnego ciemnoniebieskiego bufora katodowego PAGE i 1x natywnego jasnoniebieskiego bufora katodowego PAGE.
    2. Usuń grzebień z prefabrykowanego 3-12% natywnego żelu PAGE i umyj studzienki dwukrotnie 1x natywnym ciemnoniebieskim buforem katodowym PAGE. Napełnij studzienki 1x natywnym ciemnoniebieskim buforem katodowym PAGE. Ustaw żel w działającym zbiorniku, ale nie dodawaj ciemnoniebieskiego bufora katodowego do komory katodowej (wewnątrz).
  2. Przebieg elektroforetyczny
    1. Przygotować próbkę: Do 25 μl stężonego eluatu dodać odpowiednią objętość 4x natywnego buforu ładującego próbkę i 0,5% dodatku do próbki G-250 dla końcowych stężeń odpowiednio 1x i 0,005%.
    2. Załaduj próbkę i natywne markery masy cząsteczkowej, pozostawiając między nimi pustą studzienkę. Załaduj 10-20 μl 1x natywnego bufora ładującego próbkę do wszystkich pustych studzienek.
    3. Napełnij komorę katodową (wewnętrzną) 200 ml 1x natywnego ciemnoniebieskiego bufora katodowego PAGE ostrożnie, aby nie naruszyć próbek. Napełnij komorę anodową (zewnętrzną) 550 ml 1x natywnego bufora anodowego PAGE.
    4. Uruchom żel pod napięciem 150 V przez 30 minut. Przerwij bieg, usuń ciemnoniebieski bufor katodowy za pomocą pipety serologicznej i zastąp go 1x jasnoniebieskim buforem katodowym. Kontynuuj bieg przez 60 minut. Żel można uruchamiać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C; Temperatura może mieć wpływ na strukturę kompleksu białkowego.
  3. Barwienie żelem
    1. Otwórz kasetę z żelem i wyrzuć jedną z płytek kasety. Żel pozostaje przymocowany do drugiej płytki kasety. Przenieść żel do tacki lub pojemnika zawierającego wystarczającą ilość roztworu utrwalającego (40% metanolu, 2% kwasu octowego) w celu przykrycia żelu i inkubować przez 30 minut, delikatnie wstrząsając.
    2. Usuń roztwór utrwalający i dodaj tyle wody, aby pokryć żel. Żel można zeskanować w celu wykorzystania w przyszłości.

3. Analiza spektrometrii mas

Uwaga: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym, jeśli to możliwe, aby zapewnić czystość próbek. Wszystkie roztwory należy przygotować z wodą klasy HPLC. Omów ten protokół z laboratorium spektrometrii mas, które przeprowadzi analizę.

  1. Preparaty
    1. Umieść stożkową dolną 96-dołkową płytkę na innej 96-dołkowej płytce, aby zebrać odpady. Przebić dno dołków stożkowej płytki 96-dołkowej za pomocą igły 21 G.
    2. Umyj dołki przebitej 96-dołkowej płytki.
      1. Dodać 200 μl 50% acetonitrylu-0,25% kwasu mrówkowego do dołków przebitej płytki. Inkubować stos płytek w wytrząsarce przez 10 minut.
      2. Wirować przy 500 x g przez 1 minutę, tak aby ciecz przepływała przez otwory do płytki zbiorczej odpadów. Wyrzuć odpad płynny.
      3. Powtórz kroki 3.1.2.1-3.1.2.2 jeszcze dwa razy.
      4. Napełnij studzienki przebitej płytki 96-dołkowej 150 μl 50 mM wodorowęglanu amonu (świeżo przygotowanego).
    3. Umyj studzienki 96-dołkowej płytki do filtracji odśrodkowej.
      1. Umieść normalną 96-dołkową płytkę pod odśrodkową płytą filtracyjną, aby zebrać odpady. Dodaj 200 μl 50% acetonitrylu i 0,25% kwasu mrówkowego do każdej studzienki odśrodkowej płytki filtracyjnej.
      2. Odwirować stos płytek o masie 200 x g przez 1 minutę. Wyrzucić odpady.
      3. Powtórz kroki 3.1.3.1-3.1.3.2 jeszcze dwa razy.
  2. Wycinanie żelu i trawienie w żelu
    UWAGA: Podczas wycinania żelu zidentyfikuj i zanotuj plasterek żelu dopasowany do każdego ze wzorców białka. Wzorce białkowe można wykorzystać do oszacowania przybliżonej masy cząsteczkowej dla wszystkich plastrów żelu.
    1. Umieść żel ze szklaną płytką na czystej powierzchni. Pas zawierający próbkę należy podzielić na 48 identycznych plasterków (1,5 mm x 5 mm). Pokrój każdy plasterek na 2-3 mniejsze kawałki (z wyjątkiem ostatnich pięciu plasterków na górze żelu) i umieść każdy plasterek kolejno w jednym dołku przekłutej i umytej 96-dołkowej płytki.
    2. Dodaj 50 μl acetonitrylu do każdego dołka. Inkubować płytkę, wstrząsając przez 30-60 minut. Usunąć ciecz przez odwirowanie, jak w kroku 3.1.2.2.
    3. Dodać 200 μl 2 mM TCEP w 50 mM wodorowęglanu amonu do każdej studzienki. Inkubować płytkę, wstrząsając przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć ciecz przez odwirowanie, jak w kroku 3.1.2.2.
    4. Do każdej studzienki dodać 200 μl 4 mM jodoacetamidu w 50 mM wodorowęglanu amonu. Inkubować płytkę, wstrząsając przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Usunąć ciecz przez odwirowanie, jak w kroku 3.1.2.2.
    5. Dodać 150 μl 50 mM wodorowęglanu amonu plus 50 μl acetonitrylu i inkubować płytkę, wstrząsając przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten etap prania tyle razy, ile jest to wymagane, aż cały niebieski kolor zostanie usunięty z kawałków żelu.
    6. Odwodnić kawałki żelu, dodając 200 μl czystego acetonitrylu i inkubować, wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aż kawałki żelu staną się białe i nieprzezroczyste. Usuń acetonitryl.
    7. Dodać 150 μl 0,001 mg/ml trypsyny (stopień sekwencjonowania) w zimnym 50 mM wodorowęglanie amonu do każdego dołka. Inkubować płytkę, wytrząsając w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Po 1 godzinie sprawdź, czy kawałki żelu są pokryte płynem; jeśli tak nie jest, dodaj kolejne 50-100 μl 50 mM wodorowęglanu amonu. Po 2 godzinach w temperaturze 37 °C kontynuować trawienie w temperaturze 25 °C przez noc.
    8. Umieść czystą stożkową płytkę dolną pod płytką zawierającą żel, zapewniając prawidłową orientację płytek. Zebrać płyn zawierający peptydy przez odwirowanie przy 200 x g przez 1 min.
    9. Umieść płytkę zawierającą peptydy w parowniku odśrodkowym i odparuj ciecz podczas wykonywania następnego kroku.
    10. Do kawałków żelu dodać 150 μl 50% acetonitrylu i 0,25% kwasu mrówkowego. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    11. Zebrać ciecz do częściowo wysuszonej płytki z kroku 3.2.9 przez odwirowanie przy 200 x g przez 1 minutę. Kontynuować odparowywanie płytki zawierającej peptydy, wykonując następny krok.
    12. Powtórz kroki 3.2.10-3.2.11.
    13. Dodać 200 μl czystego acetonitrylu do każdego dołka płytki zawierającej kawałki żelu. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    14. Zebrać płyn na płytce zawierającej peptydy przez odwirowanie przy 200 x g przez 1 min.
    15. Upewnij się, że końcowe stężenie acetonitrylu we wszystkich studzienkach przekracza 55%. W razie potrzeby dodaj dodatkowo czysty acetonitryl.
    16. Przenieść roztwory peptydów na umytą odśrodkową płytkę filtracyjną. Umieść pod nim czystą stożkową płytę dolną, aby zebrać peptydy. Odwirować stos płytek o masie 200 x g przez 1 min.
    17. Odparuj ciecz w stożkowej płycie dolnej, aż studzienki całkowicie wyschną. Na tym etapie płytkę można przykryć silikonową pokrywką i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    18. Ponownie rozpuścić peptydy w 32 μl 0,5% kwasu mrówkowego, energicznie wstrząsając przez 15 min. Dodać 8 μl 400 mM wodorowęglanu amonu i inkubować energicznie wstrząsając przez 15 min. Odwirować płytkę przy 200 x g przez 1 min. Przykryć silikonową pokrywką i przechowywać płytkę w temperaturze -20 °C do czasu analizy spektrometrii mas.
  3. Spektrometria mas
    UWAGA: Analizuj peptydy na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości przy użyciu metod zgodnych z proteomiką typu shotgun. Akwizycja zależna od danych jest najczęściej używaną konfiguracją LC-tandem MS do tego typu analiz i powinna być zoptymalizowana pod kątem wydajnej identyfikacji peptydów, minimalizacji nadmiarowego sekwencjonowania i wyboru kandydatów na podstawie szumu tła. Widma masowe w pierwszym etapie skanowania analizy masowej (MS1) powinny być rejestrowane w trybie profilowym. Zaleca się preferencyjny wybór jonów podwójnie i potrójnie naładowanych do drugiego etapu analizy masy (MS2). Zakres mas m/z 400-1,600 jest odpowiedni do identyfikacji większości peptydów w zakresie 8-30 aminokwasów. W tym miejscu dostępny jest protokół analizy przy użyciu spektrometru mas Orbitrap.
    1. Wstrzyknąć 20 μl próbki na analizę za pomocą automatycznego próbnika systemu nanoLC-MS/MS. Odsalić i zagęścić peptydy w kolumnie C18 z odwróconą fazą (100 μm id, 2 cm).
    2. Oddziel peptydy na analitycznej kolumnie C18 (75 μm id, 15 cm) przy 30-minutowym gradinie liniowym 4-28% acetonitrylu/0,1% kwasu mrówkowego przy 300 nL/min.
    3. Analizuj peptydy w spektrometrze mas metodą akwizycji 10 najbardziej zależnej od danych o następujących parametrach: zakres m/z 380-1 600, rozdzielczość 30 000 przy m/z 400, szerokość izolacji 2 Th, wykluczenie dynamiczne na ± 10 ppm przez 45 s, cel automatycznej kontroli wzmocnienia przy 1 x 106 dla MS i 5 000 dla MS/MS, maksymalny czas wtrysku 150 ms dla MS i 100 ms dla MS/MS.

4. Analiza danych

  1. Identyfikacja i oznaczanie ilościowe białek za pomocą MaxQuant
    1. Skorzystaj z bezpłatnego oprogramowania MaxQuant, aby zidentyfikować i określić ilościowo białka w każdej frakcji żelu na podstawie surowych danych spektrometrii mas.
      UWAGA: MaxQuant działa na danych generowanych przez podejścia proteomiczne oparte na akwizycji zależnej od danych. Dane MS z niebieskich natywnych frakcji żelu powinny być analizowane w partiach jako oddzielne eksperymenty, a nie jako frakcje eksperymentu łączącego wszystkie plastry żelu. Zaznacz pole wartości iBAQ, aby wykonać obliczenia stechiometryczne. Szczegółowe protokoły przeszukiwania baz danych i kwantyfikacji białek za pomocą MaxQuant są opisane w 21,22.
  2. Analiza profilu białkowego za pomocą Perseusa
    1. Skorzystaj z ogólnodostępnego oprogramowania Perseus, aby wyświetlić profile migracji zidentyfikowanych białek i porównać je za pomocą analizy statystycznej.
      UWAGA: Ogólna dokumentacja dotycząca korzystania z Perseusa jest dostępna na stronie http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Przykładowy zestaw danych jest dostępny jako dane uzupełniające.
    2. Prześlij plik proteingroups.txt zwrócony przez analizę MaxQuant, zawierający identyfikację białek i wartości ilościowe dla wszystkich frakcji żelu. Wypełnij wartości intensywności w polu głównym (Rysunek 1). Pojawi się matryca zawierająca wszystkie identyfikacje białek w wierszach, z frakcjami żelu jako kolumnami.
    3. Usuń wpisy odpowiadające odwrotnym trafieniom, białkom identyfikowanym tylko przez miejsce i potencjalne zanieczyszczenia, wybierając opcję Filtruj wiersze na podstawie kolumny kategorii w menu rozwijanym Filtruj wiersze (Rysunek 2).
    4. Znormalizuj intensywność frakcji każdego białka w całym profilu w stosunku do całkowitej intensywności białka, wybierając pozycję Podziel w menu rozwijanym Normalizuj, a następnie pozycję Sumuj (Rysunek 3). Pojawi się nowa matryca.
    5. Wyświetl wykresy profilu migracji wszystkich białek, wybierając opcję Wykres profilu w menu rozwijanym Wizualizacja (Rysunek 4).
    6. Wybierz opcję Filtruj wiersze na podstawie prawidłowych wartości w menu rozwijanym Filtruj wiersze. Wprowadź 1 w wymaganej liczbie prawidłowych wartości.
    7. Wykonaj hierarchiczne grupowanie zidentyfikowanych białek we wszystkich niebieskich natywnych frakcjach żelu, wybierając opcję Grupowanie hierarchiczne w menu rozwijanym Grupowanie/PCA. Usuń zaznaczenie pola Drzewo kolumn (Rysunek 5). Klastry są wizualizowane na mapie cieplnej na karcie Grupowanie obok macierzy (Rysunek 6).
    8. Zlokalizuj klaster zawierający białko przynęty w dendrogramie. Inne składniki klastra reprezentują białka komigrujące z przynętą, a zatem są potencjalnymi oddziałującymi białkami/podjednostkami tego samego kompleksu.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Zrzut ekranu okna przesyłania danych Perseus. Rysunek przedstawia etapy ładowania danych identyfikacyjnych i ilościowych dotyczących identyfikacji białek do odbiornika Perseus. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Zrzut ekranu okna Perseusa do filtrowania wpisów odpowiadających zanieczyszczeniom, odwrotnym trafieniom i białkom identyfikowanym przez witrynę. Wybranie opcji Filtruj wiersze według kolumny kategorii powoduje otwarcie nowego okna służącego do wybierania typów wpisów dotyczących białek, które mają zostać wyeliminowane z zestawu danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Zrzut ekranu przedstawiający okno normalizacji Perseusza. Wybranie opcji Podziel w menu Normalizacja powoduje otwarcie nowego okna z różnymi opcjami. Wybranie opcji Suma powoduje podzielenie wartości intensywności białka w każdej frakcji przez całkowitą intensywność tego białka we wszystkich frakcjach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Zrzut ekranu przedstawiający Perseusa przedstawiający wykresy profilu migracji. Białka można wybrać w macierzy poniżej profili, aby podkreślić odpowiadający im profil. Pasek narzędzi może być używany do edycji i eksportu profili. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 5. Zrzut ekranu okna hierarchicznego klastrowania w programie Perseus. Rysunek przedstawia ustawienia hierarchicznego grupowania białek przy użyciu metryki odległości Manhattan (L1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-6
Rysunek 6. Zrzut ekranu Perseusa przedstawiający dendrogram i mapę termiczną intensywności białka. Przepływ pracy po prawej stronie panelu głównego pokazuje każdy wykonany krok i wynikową macierz i może być użyty do cofnięcia dowolnego kroku. Przepływ pracy może również rozgałęziać się z dowolnej macierzy pośredniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Obliczanie względnej stechiometrii
    1. Wybierz podjednostki kompleksu białkowego na podstawie ich współgrupowania z białkiem przynęty i określ pik (piki) profilu, w którym się pojawiają.
    2. Użyj wartości iBAQ zwróconych przez analizę MaxQuant dla każdej podjednostki w każdej frakcji osobno i znormalizuj przez odpowiednią wartość iBAQ przynęty w tej frakcji.
    3. Wykreślić znormalizowane iBAQ dla podjednostek kompleksu przynęty i białka we frakcjach wybranego piku i zastosować regresję liniową. Oblicz względną ilość złożonej podjednostki do przynęty, porównując trendy ich znormalizowanych wartości iBAQ.
  2. Oszacowanie wielkości kompleksu białkowego
    1. Użyj wzorców białkowych, aby obliczyć przewidywane masy cząsteczkowe dla wyrównania niebieskich natywnych plastrów żelu z toru próbki. Na ich podstawie wygeneruj model regresji liniowej, wykreślając plastry żelu na osi x i masy cząsteczkowe na osi y.
    2. Użyj modelu, aby oszacować obserwowany zakres masy cząsteczkowej kompleksu białkowego (kompleksów białkowych) na podstawie niebieskich natywnych wycinków, z których zostały zidentyfikowane.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebieg procesu profilowania korelacji białek natywnych Affinity Blue metodą spektrometrii mas (ABC-MS) jest przedstawiony na rysunku 7. Natywne kompleksy białkowe wokół białka będącego przedmiotem zainteresowania są izolowane przez oczyszczanie powinowactwa przy użyciu przeciwciał przeciwko znacznikowi epitopu (w tym przypadku FLAG) i elucję konkurencyjną. Kompleksy są rozwiązywane przez BN-PAGE, a cały pas żelu jest wycinany na 48 sekcji i przygotowywany do shotgun LC-MS/MS. Ilościowe informacje o MS są wykorzystywane do generowania profilu migracji dla każdego zidentyfikowanego białka w poprzek niebieskiej natywnej separacji. Białka, które oddziałują na siebie, tworząc odrębny kompleks, wykazują podobne profile migracji z nakładającymi się pikami. Gdy białko będące przedmiotem zainteresowania bierze udział w więcej niż jednym złożeniu, obserwuje się wiele pików w jego profilu migracji, biorąc pod uwagę, że podkompleksy mieszczą się w zakresie zdolności rozdzielczej niebieskiego natywnego żelu. Systematyczne porównanie profili migracji można osiągnąć poprzez profilowanie korelacji białek przy użyciu grupowania hierarchicznego. Dendrogram i szczytowe intensywności dla wszystkich frakcji są wizualizowane na mapie cieplnej, co ułatwia identyfikację oddziałujących białek, które należą do odrębnych kompleksów białkowych (ryc. 8).

Użyliśmy tej strategii do analizy współdziałających partnerów Mta2, podstawowej podjednostki kompleksu przebudowującego chromatynę NuRD 20. Jak pokazano na rysunku 9, profil migracji Mta2 wykazywał dwa piki o różnym natężeniu od 700 kDa do 1,2 MDa, przy czym pik o niższej masie wykazywał wyższą liczebność. Inne podjednostki rdzeniowe NuRD, w tym Mta1/3, Hdac1/2 i Mbd3, wykazywały identyczny wzór separacji, chociaż piki dla niektórych podjednostek, a mianowicie Chd4, Gatad2a/b i Rbbp4/7, miały odwrotny rozkład obfitości (Figura 9A, B). W przeciwieństwie do tego, profil Cdk2ap1, czynnika regulacyjnego, który rekrutuje kompleks NuRD do promotorów genu Wnt 23, wykazywał tylko wyższy pik masy (Figura 9C), podobnie jak Sall4, represor transkrypcji, który również wykazał, że wiąże NuRD 20,24,25. W ten sposób frakcjonowanie oczyszczonych z powinowactwa białek związanych z Mta2 przez niebieski natywny PAGE było w stanie rozwiązać dwie różne formy kompleksu NuRD.

ABC-MS pozwala również na identyfikację nowych interaktorów, jednocześnie przypisując je do poszczególnych jednostek białkowych. Poprzez badanie klastrów białek i intensywności frakcji reprezentowanych na mapie cieplnej wykryliśmy silną korelację między podjednostkami NuRD a Wdr5, podjednostką regulatorową kompleksu metylotransferazy MLL 26, przy czym Wdr5 wykazuje dwa piki migracji zbiegające się z dwoma pikami NuRD (Figura 8), co sugeruje nową interakcję między Wdr5 i NuRD. Potwierdziliśmy tę interakcję za pomocą koimmunoprecypitacji i komigracji w chromatografii wykluczania wielkości 20.

Wybór sposobu obliczania metryki odległości w hierarchicznej grupowaniu będzie miał wpływ na kształt klastrów, a tym samym na korelacje. Zalecamy eksperymentowanie z różnymi wskaźnikami, aby osiągnąć najlepsze dopasowanie do istniejącej wiedzy na temat interakcji białka lub kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania. Ogólnie rzecz biorąc, najlepsze wyniki osiągnęliśmy z metryką odległości Manhattan (L1) 20. Korelacja Pearsona lub metryki odległości euklidesowej zostały również zgłoszone do identyfikacji kompleksów na podstawie alternatywnych technik frakcjonowania 10,11,12.

Ilościowe dane MS uzyskane z niebieskich frakcji natywnych mogą być również wykorzystane do określenia stechiometrii kompleksów białkowych. Wartość iBAQ (kwantyfikacja bezwzględna oparta na intensywności) stanowi miarę względnej obfitości zidentyfikowanych białek 27,28. Wartości iBAQ dla członków kompleksu białkowego we wszystkich frakcjach w obrębie piku profilu migracji są znormalizowane do wartości białka przynęty w celu uzyskania względnych ilości. Znormalizowane iBAQ w poprzek piku profilu dla danego członka kompleksu białkowego powinny podążać za trendem horyzontalnym, a wartości trendu odzwierciedlają stechiometrię oddziałujących białek w stosunku do białka przynęty. Aby uzyskać bardziej szczegółową reprezentację obliczeń stechiometrycznych, zobacz 20.

figure-results-1
Rysunek 7: Schematyczny przebieg pracy podsumowujący strategię ABC-MS. Ten rysunek jest zmodyfikowany z 20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 8. Hierarchiczne grupowanie profili migracji BN-PAGE interaktorów Mta2. Białka związane z Mta2 zostały zgrupowane na podstawie podobieństwa ich profili migracji. Pokazany jest tylko podzbiór mapy cieplnej zawierający kompleks NuRD (zamknięty w niebieskim polu). Żółte pole podkreśla silną korelację Wdr5 z kompleksem NuRD. Opisane masy cząsteczkowe oszacowano na podstawie odległości migracji wzorców białkowych przebiegu w tym samym żelu. Badania te zostały pierwotnie opublikowane w Molecular and Cellular Proteomics 20 Amerykańskiego Towarzystwa Biochemii i Biologii Molekularnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 9. Profil migracji BN-PAGE podjednostek NuRD i związanych z nimi białek. A) Podjednostki Mta2 i NuRD występują przy podobnym wzorcu intensywności. B) Podjednostki Mta2 i NuRD o odwrotnym wzorcu intensywności. C) Mta2 i Cdk2ap1, który jest obecny tylko w jednostce NuRD o większej masie cząsteczkowej. Opisane masy cząsteczkowe oszacowano na podstawie profilu migracji wzorców białek. Badania te zostały pierwotnie opublikowane w Molecular and Cellular Proteomics 20 Amerykańskiego Towarzystwa Biochemii i Biologii Molekularnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Dane uzupełniające: Przykładowy zestaw danych. Plik proteingroups.txt pochodzący z MaxQuant zawierający identyfikacje białek i wartości ilościowe z eksperymentu ABC-MS. Badania te zostały pierwotnie opublikowane w Molecular and Cellular Proteomics 20 Amerykańskiego Towarzystwa Biochemii i Biologii Molekularnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy zastosowanie oczyszczania powinowactwa, po którym następuje elektroforeza w postaci niebieskiego natywnego żelu w połączeniu z ilościową spektrometrią mas w celu rozdzielenia kompleksów białkowych. Podejście to oferuje metodę rozplątywania jednowymiarowych list interakcji białek w funkcjonalne zespoły białek.

Przedstawiamy metodę opartą na wykorzystaniu białek znakowanych epitopami. Jeśli jednak linia komórkowa wykazująca ekspresję znakowanego białka nie jest dostępna, alternatywą może być użycie przeciwciał przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, pod warunkiem, że dostępny jest peptyd umożliwiający osiągnięcie natywnej elucji konkurencyjnej. Ilość materiału wyjściowego i ilość kulek może wymagać modyfikacji w zależności od poziomu ekspresji białka docelowego. Zazwyczaj wykonujemy ten protokół z materiałem wyjściowym 2-5 x10 8 komórek, co jest wystarczające nawet w przypadku białek o niskim poziomie ekspresji. Skład buforu do lizy należy dobrać empirycznie, aby osiągnąć prawie całkowitą rozpuszczalność przynęty. Może to być trudne dla niektórych typów białek, w szczególności białek wiążących chromatynę lub błonowych. Alternatywne opcje obejmują zwiększenie ilości soli, pod warunkiem, że badany kompleks białkowy jest stabilny w wysokiej zawartości soli, lub zastosowanie sonikacji i/lub leczenia nukleazą w celu wiązania białek chromatyny 20,29. W przypadku białek błonowych wskazana może być zmiana detergentu na DDM lub digitoninę 30. W przypadku białek wiążących DNA przydatne jest włączenie nukleazy, takiej jak benzonaza, podczas etapu oczyszczania 20. Całkowite usunięcie kwasów nukleinowych zapewnia, że wykryte interakcje zachodzą między białkami i nie są pośredniczone przez DNA.

Kluczowym elementem, który należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tego podejścia, jest stabilność badanego kompleksu. Procedura jest długa i może polegać na zachowaniu kompleksu białkowego przez noc. Osiągnęliśmy duży sukces z dwoma kompleksami przebudowującymi chromatynę (D. Bode i M. Pardo, dane nie pokazane), ale to powinno zostać ocenione. W razie potrzeby etap oczyszczania powinowactwa może zostać skrócony.

Alternatywne techniki, które umożliwiają natywne frakcjonowanie, takie jak chromatografia wykluczania wielkości, są szeroko stosowane od ponad 50 lat do charakteryzowania kompleksów białkowych. My i inni wykazaliśmy, że rozdzielczość niebieskiej natywnej PAGE jest lepsza niż ta osiągnięta przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości 20,31,32,33. Kolejną zaletą niebieskiej natywnej PAGE jest to, że nie wymaga systemów chromatograficznych, które są drogie, ale raczej wykorzystuje sprzęt elektroforetyczny do białek, który jest szeroko rozpowszechniony w laboratoriach. Jeśli chodzi o czas pracy, metoda ta nie wymaga więcej pracy niż tradycyjne podejście geLC-MS/MS lub frakcjonowanie chromatograficzne offline. Jednak, podobnie jak w przypadku większości technik frakcjonowania, ma ona ograniczenie co do ich rozdzielczości. Kompleksy, które są bardzo jednorodne lub zbliżone pod względem masy i kształtu, mogą wykraczać poza rozdzielczość oferowaną przez niebieską natywną PAGE, a zatem opisany tutaj protokół może nie być uniwersalnie skuteczny w rozdzielaniu odrębnych kompleksów ze współdzielonymi podjednostkami. Zachęcające jest to, że udało nam się wydzielić dwa bardzo podobne kompleksy tetrameryczne dzielące trzy podjednostki (M. Pardo, rękopis w przygotowaniu).

Ponieważ spektrometria mas staje się coraz bardziej czuła, w próbkach AP-MS można wykryć nawet niewielkie ilości niespecyficznych interakcji i zanieczyszczeń. Zaprezentowane tutaj podejście może pomóc w rozróżnieniu rzeczywistych interaktorów od zanieczyszczenia tła w oczyszczaniu powinowactwa poprzez skupienie uwagi na białkach z pikami migracji, które zbiegają się ze szczytami migracji przynęty o wyższej masie cząsteczkowej niż białka monomeryczne.

Kilka grup wykorzystało techniki frakcjonowania, a następnie profilowanie korelacji białek w celu wyznaczenia kompleksów białkowych w skali komórkowej bez konieczności wcześniejszej izolacji 10,11,12,34. Może to jednak spowodować niepowodzenie w wykrywaniu oddziaływań substechiometrycznych. Włączenie etapu wzbogacania poprzez oczyszczanie powinowactwa może pomóc w przezwyciężeniu tego problemu. Opisane tutaj podejście powinno być ogólnie przydatne do badania topologii kompleksów białkowych i odkrywania wielu kompleksów, w których dane białko bierze udział w tym samym kontekście komórkowym. Strategia jest prosta i łatwa do wykorzystania w laboratoriach, które mogą nie mieć drogiego sprzętu do frakcjonowania chromatograficznego do rozdzielania kompleksów białkowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust (WT098051).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białko G DynabeadsLife Technologies10003D
FLAG przeciwciało M2Sigma-AldrichF1804
Tween-20, klasa białkowa, 10% roztwórMillipore655206
dimetylopimelimidanSigma-Aldrich80490
0,2 M Bufor trietanoloaminy, pH 8,2Sigma-AldrichT0449
3x peptyd FLAGSigma-AldrichF4799
Vivaspin 5K NMWCO, PESSartoriusVS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gelLife TechnologiesBN1001
20x NativePAGE Running BufferLife TechnologiesBN2001
20x NativePAGE Technologie dodawania katodowegoBN2002
4x Bufor ładowania próbki NativePAGELife TechnologiesBN2003
NativeMARKLife TechnologiesLC0725
Dodatek do próbki NativePAGE 5% G-250 Life TechnologiesBN2004
Nunc stożkowa płyta 96-dołkowa z dnem, polipropylenThermo249944
Multiscreen HTS 96-dołkowy system filtracjiThermoMSDVN6550
Nunc 96-well cap naturalnyThermo276002
TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny)Sigma-Aldrich646547
JodoacetamidSigma-AldrichI1149
Acetonitryl, klasa HPLCFisher ScientificA/0627/17
Trypsyna, klasa sekwencjonowaniaRoche11418475001
MaxQuant (oprogramowanie)nie dotyczyNiehttp://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (oprogramowanie)N.A.Niehttp://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus
dotyczy dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
  2. Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
  3. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
  6. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  7. Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
  8. Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
  9. Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
  10. Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
  11. Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
  12. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
  13. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  14. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  15. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
  16. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340(2013).
  17. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  18. Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
  19. Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
  20. Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
  21. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  22. Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
  23. Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
  24. Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
  25. Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
  26. Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).
  29. Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
  30. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  31. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  32. Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  33. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
  34. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Blue Native PAGEProtein Complex ResolutionAffinity PurificationProtein Correlation ProfilingMass Spectrometry AnalysisNative Gel ElectrophoresisCompetitive ElutionProtein Migration ProfilingHierarchical ClusteringSubcomplex Identification

Powiązane artykuły