Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55520

⸱

7 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Duke University, 2Department of Bioengineering, Rice University, 3Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 4Solid Tumor Program and the Duke Prostate Center, Duke University Medical Center, 5Duke University Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj metodę hodowli komórkowej do indukowania przemian mezenchymalno-nabłonkowych (MET) w komórkach mięsaka opartą na połączonej ektopowej ekspresji członków rodziny mikroRNA-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). Metoda ta jest odpowiednia do lepszego zrozumienia biologicznego wpływu plastyczności fenotypowej na agresywność raka i leczenie.

Streszczenie

Plastyczność fenotypowa odnosi się do zjawiska, w którym komórki przejściowo nabywają cechy innej linii. Podczas progresji raka plastyczność fenotypowa napędza inwazję, rozsiew i przerzuty. Rzeczywiście, podczas gdy większość badań plastyczności fenotypowej dotyczyła raków pochodzenia nabłonkowego, okazuje się, że mięsaki, które są pochodzenia mezenchymalnego, wykazują również plastyczność fenotypową, a podzbiór mięsaków ulega zjawisku przypominającemu przejście mezenchymalno-nabłonkowe (MET). W tym miejscu opracowaliśmy metodę obejmującą rodzinę miR-200 i ziarnistą głowę 2 (GRHL2), aby naśladować to podobne do MET zjawisko obserwowane w próbkach pacjentów z mięsakami. Sekwencyjnie wyrażamy GRHL2 i rodzinę miR-200 za pomocą odpowiednio transdukcji i transfekcji komórek, aby lepiej zrozumieć molekularne podstawy tych fenotypowych przejść w komórkach mięsaka. Komórki mięsaka wykazujące ekspresję miR-200 i GRHL2 wykazały wzmocnione cechy nabłonka w morfologii komórek i zmianie biomarkerów nabłonkowych i mezenchymalnych. Przyszłe badania z wykorzystaniem tych metod mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia fenotypowych konsekwencji procesów podobnych do MET dla komórek mięsaka, takich jak migracja, inwazja, skłonność do przerzutów i oporność na terapię.

Wprowadzenie

Plastyczność fenotypowa odnosi się do odwracalnego przejścia między fenotypami komórkowymi i jest powszechnie dzielona na dwa typy, przejścia z nabłonka do mezenchymalnego (EMT) i przejścia mezenchymalne do nabłonka (MET). Ta plastyczność fenotypowa odgrywa ważną rolę w prawidłowych procesach organizmów wielokomórkowych, takich jak rozwój i gojenie się ran1; Jednak te same szlaki i programy ekspresji genów mogą również prowadzić do chorób, takich jak zwłóknienie (recenzja w2,3,4) i przerzuty raka (recenzowane w References5,6,7,8). Na przykład podczas przerzutów EMT zaburza polaryzację komórek, interakcje komórka-komórka i sprzyja inwazji9,10. Razem EMT przyczynia się do stanu fenotypowego, który ułatwia rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych. Ponadto EMT prowadzi również do wielu innych zmian fenotypowych, które napędzają agresywny fenotyp, w tym deregulacji metabolizmu komórek rakowych6, rozwój oporności na leki11,12, zwiększona zdolność do inicjacji nowotworu13,14 i unikanie odporności gospodarza15.

Plastyczność fenotypowa została dobrze zbadana w progresji raka; jednak mięsaki wykazują również plastyczność fenotypową. Co ciekawe, wydaje się, że niektóre z tych samych czynników wpływających na plastyczność fenotypową w rakach przyczyniają się również do plastyczności i agresywności mięsaka. Na przykład wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) od pacjentów z mięsakiem wykazują ekspresję EpCAM, białka powierzchniowego komórki, które zwykle znajduje się na komórkach nabłonka16. Dodatkowo 250 próbek mięsaka tkanek miękkich sklasyfikowano jako nabłonkowe lub mezenchymalne na podstawie ekspresji genów. Pacjenci z sygnaturą biomarkera podobnego do nabłonka mieli lepsze rokowanie niż pacjenci z sygnaturą biomarkera podobnego do mezenchymalnego17. Jest to zgodne z wieloma nowotworami, w których pacjenci z rakami podobnymi do nabłonka mają lepsze wyniki w porównaniu z pacjentami z większą liczbą guzów mezenchymalnych18.

Podczas gdy niektóre mięsaki wykazują biomarkery i szlaki ekspresji genów zgodne z MET, molekularne podstawy tej plastyczności fenotypowej pozostają słabo poznane. Aby zbadać mechanizmy i czynniki powodujące MET w mięsaku, opracowaliśmy model indukcji MET przy użyciu dwóch czynników specyficznych dla nabłonka, rodziny mikroRNA (miR)-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). miR-200 to rodzina małych niekodujących RNA, które regulują ekspresję genów poprzez wiązanie się z 3' UTR informacyjnego RNA i zapobieganie translacji do białka. Rodzina miR-200 składa się z dwóch podgrup - jednej zawierającej miR-141 i miR-200a, a drugiej zawierającej miR-200b, miR-200c i miR-429. Członkowie rodziny miR-200 są wzbogaceni w tkanki nabłonkowe, a utrata miR-200 wiąże się z przerzutami w rakach19. Rodzina miR-200 jest również obniżona w mięsakach tkanek miękkich w porównaniu z normalnymi tkankami20. Podobnie jak miR-200s, GRHL2 jest kluczowym regulatorem, który jest ważny dla rozwoju nabłonka21. Czynnik transkrypcyjny GRHL2 działa na dwa sposoby, aby zwiększyć poziom genów nabłonkowych, takich jak E-kadheryna: 1) W komórkach nabłonkowych GRHL2 bezpośrednio tłumi główny regulator EMT, ZEB122; oraz 2) GRHL2 bezpośrednio aktywuje transkrypcję genów nabłonkowych23. Nasze poprzednie badania wykazały, że połączona ekspresja miR-200 i GRHL2 w komórkach mięsaka indukuje fenotyp podobny do MET24. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół tworzenia modelu in vitro indukcji MET w komórkach mięsaka przy użyciu ektopowej ekspresji miR-200 i GRHL2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotuj DMEM do hodowli komórkowej, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny-streptomycyny (5 000 U / ml) do 500 ml DMEM. Pożywka ta może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
  2. Zawiesić liofilizowane startery w wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 10 μM. Ponownie zawieszone startery przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować bufor do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (150 mM NaCl, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Przed użyciem uzupełnij koktajlem inhibitorów proteazy i utrzymuj bufor na lodzie podczas użytkowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 10 mg/ml polibrenu (bromku heksadimetryny) w wodzie i filtrze strzykawkowym do sterylizacji za pomocą filtra polieterosulfonowego 0,45 μm. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
  5. Przygotować roztwór roboczy błękitnego chlorku tetrazolowego o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając 10 mg w 10 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Transdukcja lotiwirusowa GRHL2

Dzień 1

  1. Płytka 3 x 105 HEK293T komórek na studzienkę płytki 6-dołkowej w 2 ml uzupełnionego DMEM. Określ ilościowo komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Komórki powinny zlewać się w 40 - 60% po całonocnej hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

Dzień 2

  1. Rozcieńczyć 2 μg pustego wektora (pCMV-UBC-EGFP) lub 2 μg pCMV-GRHL2-UBC-EGFP24,25 w 200 μl pożywki bez surowicy wraz z 1,8 μg pΔ8,9 i 0,2 μg plazmidów pomocniczych pCMV-VSV-G. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 4 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w 200 μl pożywki wolnej od surowicy na transfekcję (8 μl na 400 μl dla dwóch próbek). Dodać 200 μl mieszaniny odczynników do transfekcji do każdego roztworu plazmidu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Podczas inkubacji przemyć HEK293T komórki, usuwając pożywkę przez aspirację próżniową i przepłukując komórki 1 ml PBS. Zastąp PBS 800 μl pożywki bez surowicy. Po 20 minutach dodać kroplami 200 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji i plazmidu z etapu 2.2 do każdej studzienki i inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  3. Ostrożnie usunąć pożywkę transfekcyjną przez aspirację próżniową i zastąpić 2 ml uzupełnionego DMEM. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze w celu przeprowadzenia hodowli przez noc.
    UWAGA: HEK293T komórki są luźno przylegające. Wymianę pożywki należy przeprowadzać ostrożnie, aby ograniczyć usuwanie komórek z dna naczynia lub kolby.

Dzień 3

  1. Odświeżyć pożywkę na transfekowanych komórkach HEK293T i płytce 3 x 10 komórek5 RD na dołek płytki 6-dołkowej w 2 ml uzupełnionego DMEM. Hodowla komórek przez noc. Komórki RD to dostępna na rynku ludzka linia komórkowa mięsaka prążkowanokomórkowego.

Dzień 4

  1. Zbierz pożywkę wirusową z komórek HEK293T. Odpipetować pożywkę DMEM z komórek HEK293T i umieścić w nowej stożkowej pożywce o pojemności 15 ml. Ostrożnie wymień na nową pożywkę DMEM i umieść HEK293T komórki z powrotem w inkubatorze na następny dzień.
  2. Dodać 2 μl 10 mg/ml polibrenu na ml pożywki wirusowej do dwóch nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml (jednej do transfekcji pustego wektora, a drugiej do transfekcji GRHL2). Strzykawkę przefiltruj pożywkę wirusową, wyjmując tłok ze strzykawki o pojemności 3 ml i przymocuj filtr polieterosulfonowy 0,45 μm do końcówki.
    1. Dodaj pożywkę wirusową zebraną w kroku 2.6 do cylindra strzykawki i zanurz pożywkę w nowych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających polibren. Usuń pożywkę z komórek RD przez aspirację próżniową i dodaj przefiltrowane pożywki wirusowe do komórek RD.

Dzień 5

  1. Powtórz dzień 4. HEK293T komórki można wyrzucić po pobraniu pożywki wirusowej.

Dzień 7

  1. Umyj komórki RD 1 ml PBS i dodaj 200 μl 0,05% trypsyny do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, dodać 2 ml uzupełnionej pożywki i przenieść zawiesinę komórkową do nowej pożywki stożkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zassać pożywkę. Zawiesić w 1 ml DMEM (uzupełnionym 5% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny).
    UWAGA: Użycie wyższego procentu FBS może spowodować zatkanie podczas cytometrii przepływowej
    1. Komórki filtracyjne do cytometrii przepływowej. Za pomocą pipety nanieść zawiesinę komórek RD o pojemności 1 ml przez filtr 30 μm do probówek do cytometrii przepływowej i umieścić probówki na lodzie.
    2. Posortuj komórki EGFP+26 do 1,5 ml probówek mikrowirówkowych zawierających 0,5 ml DMEM uzupełnionych 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i umieść na lodzie. Płytki posortowane komórkami EGFP+ w sumie 1 ml uzupełnionego DMEM do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce i umieścić w inkubatorze w celu hodowli.
      UWAGA: Wydajność komórek EGFP+ z cytometrii przepływowej po tej transdukcji jest zwykle niska (50 000-100 000 komórek). Komórki mogą wymagać hodowli przez 10-14 dni przed przejściem do kroku 3.

3. Odwrotna transfekcja miR-200s

  1. Przygotować 50 μM zapasów miR-200 naśladowców przy użyciu wolnych od nukleaz zapasów H2O. Podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
  2. Dodaj 3 μl każdego 50 μM miR-200 mimika (miR-200a, miR-200b i miR-200c) do 300 μl pożywki bez surowicy lub 9 μl 50 μM miRNA kontroli ujemnej do 300 μl pożywki bez surowicy.
  3. Dodać 6 μl odczynnika do transfekcji swoistego dla siRNA do 600 μl pożywki bez surowicy i podzielić 300 μl tej mieszaniny na dwie probówki, po jednej dla każdej z dwóch mieszanin miR z kroku 3.2. Połączyć 300 μl każdej mieszaniny miR z kroku 3.2 z mieszaniną 300 μl odczynnika do transfekcji. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Podczas inkubacji przygotuj zawiesinę komórkową 600 000 komórek EGFP+ RD eksprymujących EV lub GRHL2 utworzonych w sekcji 2 w 2,4 ml (250 komórek/μl) pożywki bez surowicy na zabieg.
  5. Na płytce 24-dołkowej dodać 100 μl na studzienkę mieszaniny miR-200 lub mieszaniny kontroli ujemnej z kroku 3.3 do sześciu dołków, a następnie dodać 400 μl każdej zawiesiny komórkowej do trzech dołków każdej mieszaniny miR.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc i następnego dnia zmienić pożywkę na w pełni uzupełnioną DMEM. Zebrać komórki 2 dni później do analizy przy użyciu odpowiedniego buforu (patrz poniżej). Obrazowanie poklatkowe komórek mięsaka RD poddawanych MET jest dostępne jako materiał uzupełniający. Obrazuj każdą studzienkę co 2 godziny za pomocą obiektywu 10X za pomocą automatycznego imagera live-cell27.

4. Ekstrakcja RNA, odwrotna transkrypcja i qPCR

  1. Ekstrahuj RNA zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji RNA24. Wyekstrahowany RNA może być przechowywany w temperaturze -80 °C.
  2. Określ ilościowo stężenie RNA. Rozmrozić i pracować z RNA na lodzie. Aby określić ilościowo stężenia RNA, należy zmierzyć absorbancję UV przy 260 nm za pomocą spektrofotometru z czytnikiem płytek zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczyć wszystkie próbki do najniższego stężenia wodą wolną od nukleaz.
  3. Wykonaj odwrotną transkrypcję całkowitego RNA do komplementarnego DNA (cDNA). Połącz nie mniej niż 100 ng całkowitego RNA z buforem PCR, mieszanką dNTP (100 mM), losowymi starterami heksameru, odwrotną transkryptazą i wodą wolną od nukleaz w objętości reakcyjnej 20 μl24. Uruchom cykle RT zgodnie z protokołem producenta. cDNA może być przechowywane przez długi czas w temperaturze -20 °C.
  4. Rozcieńczyć 20 μl reakcji do 100 μl 80 μl H2O, wolnego od nukleaz.
  5. Zmieszać 5 μl barwnika interkalacyjnego na bazie fluorescencji 2x qPCR master mix, 0,06 μl każdego 10 μM startera i 2 μl rozcieńczonej reakcji RT na próbkę.
  6. Uruchom qPCR zgodnie z protokołem producenta dla mieszanki głównej opartej na fluorescencji.
  7. Określ ilościowo względne ilości mRNA metodą delta CT i znormalizuj do GAPDH. Wykreślić średnią ekspresję mRNA kontrprób biologicznych ± odchyleniem standardowym dla każdej grupy poddanej działaniu substancji.
    UWAGA: Podczas pracy z RNA należy podjąć specjalne środki ostrożności, aby uniknąć kontaktu z RNazami, np. przy użyciu tworzyw sztucznych i odczynników wolnych od RNaz. Sprzęt jednorazowego użytku należy poddać zabiegowi przed użyciem w celu usunięcia RNaz.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Postępując zgodnie z krokiem 3.6, odessać pożywkę przez aspirację próżniową z komórek RD w formacie 24-dołkowym.
  2. Utrwal komórki, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) na studzienkę i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Po utrwaleniu umieścić komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i w razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Przepuszczalność komórek przez dodanie 500 μl PBS+0,2% Triton-X100 i inkubacja przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przez aspirację próżniową usunąć bufor permeabilacyjny i przemyć trzykrotnie PBS.
  4. Umieścić 500 μl 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Przygotować pierwotne rozcieńczenie przeciwciała. Odpipetować 200 μl 5% BSA/PBS na studzienkę do stożkowego 15 ml (12 dołków = 2,4 ml) i dodać 1 μl przeciwciała pierwszorzędowego na ml 5% BSA/PBS potrzeba. Usunąć bufor blokujący przez aspirację próżniową i dozować 200 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdego dołka.
    1. Inkubować komórki w rozcieńczonych w stosunku 1:1 000 rozcieńczonych przeciwciałach pierwszorzędowych w 5% BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji umyj komórki dwa razy PBS.
  6. Przygotować drugorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w tej samej objętości 5% BSA/PBS, jak powyżej. Dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem dalekiej czerwieni w rozcieńczeniu 1:2 000. Dodatkowo dodać do mieszanki 1 μg/ml barwnika Hoechst. Usuń PBS i dodaj 200 μl mieszanki do każdego dołka.
    1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Umyj 3 razy PBS, pozostaw komórki w PBS i chroń komórki przed światłem za pomocą folii. W razie potrzeby komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Komórki obrazowe przy 400-krotnym powiększeniu całkowitym na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym o długości fali wzbudzenia 594 - 650 nm.

6. Western Blotting

  1. Przemyć komórki z 3,6 dwukrotnie lodowatym PBS. Na lodzie lizuj komórki z 50 μL 1x buforu RIPA uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy.
  2. Lizaty skalne w temperaturze 4 °C przez 15 minut, lizaty zebrać do probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować z dużą prędkością (20 000 x g) przez 5 minut w celu sklarowania próbek. W razie potrzeby lizaty komórkowe mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C.
  3. Określić ilościowo białko całkowite za pomocą testu Bradforda i podzielić równą ilość białka na nowe probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Doprowadzić próbki do równej objętości za pomocą buforu RIPA i 3x buforu ładującego Laemmli uzupełnionego 2-merkaptoetanolem.
  4. Próbki należy inkubować w 1x buforze ładującym próbki Laemmli przez 5 minut w temperaturze 95 °C i uruchomić SDS-PAGE przy użyciu 4-12% żelu Tris-glicyny przy napięciu 200 V przez 45 minut. Ilość załadowanego białka waha się w zależności od linii komórkowej. W niektórych przypadkach do wykrycia E-kadheryny w mezenchymalnych liniach komórkowych potrzeba 50-100 μg białka całkowitego.
  5. Przenieś białka na membranę nitrocelulozową przez 2 godziny przy 50 V w 1x buforze transferowym tris-glicyny.
  6. Blokować membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym opartym na BSA.
  7. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w stężeniu 1:1 000 w 5 ml buforu blokującego, dodać rozcieńczenie do błony i inkubować z delikatnym kołysaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć membranę 3 razy w PBS z 0,05% Tween-20.
  8. Inkubować błony przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją w podczerwieni w rozcieńczeniu 1:20 000 w buforze blokującym, jak powyżej.
  9. Umyj membranę dwa razy w PBS z 0,05% Tween-20, a następnie jeden raz w PBS.
  10. Membrana obrazu wykorzystująca standardową detekcję fluorescencji w podczerwieni.

7. Testy wzrostu niezależne od zakotwiczenia

UWAGA: Szczegółowy protokół testu miękkiego agaru znajduje się w 28.

  1. Ciepłe sterylne 2x DMEM do 42 °C w gorącej kąpieli wodnej. W tym czasie podgrzej wstępnie autoklawowaną 1% agarozę w kuchence mikrofalowej przez 3 minuty. W razie potrzeby podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez dodatkowe 30 sekund lub do całkowitego stopienia. Przenieść agarozę do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.
  2. Umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml w zlewce z wodą o temperaturze 42 °C w sterylnym kapturze i wymieszać 1% agarozy i 2x pożywkę DMEM w stosunku 1:1, co odpowiada 1,5 ml mieszaniny na studzienkę na płytce 6-dołkowej. Zawsze należy przygotować dodatkową ilość DMEM/agarozy, aby uwzględnić błąd pipetowania i uniknąć pęcherzyków powietrza.
  3. Dodaj mieszaninę na boki studzienki, upewniając się, że nie tworzą się bąbelki i odstaw na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Podczas gdy dolna warstwa krzepnie, przygotuj każdą grupę komórek RD transfekowanych w kroku 3, zasysając pożywkę i przemłukując raz 1 ml PBS. Odessać PBS i dodać 0,2 ml 0,05% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  5. Zneutralizuj trypsynę w 0,8 ml pożywki i rozdziel komórki, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  6. Policz komórki i oblicz objętość zawiesiny komórek wymaganą dla 10 000 komórek na studzienkę.
  7. Podgrzej 0,6% agarozy w kuchence mikrofalowej przez 3 minuty, a następnie 30 s na raz, aż całkowicie się rozpuści. Przenieść agarozę do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.
  8. Umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml w zlewce z wodą o temperaturze 42 °C i sterylnym kapturze. Wymieszaj 0,6% agarozy i rozcieńczoną zawiesinę komórek w stosunku 1:1, aby przygotować 1,5 ml mieszaniny na dołek na płytce 6-dołkowej. Zawsze należy przygotować dodatkową zawiesinę komórkową i mieszankę agarozy, aby uwzględnić błąd pipetowania i uniknąć pęcherzyków.
    UWAGA: Ważne jest, aby pracować w tym miejscu w temperaturze 42 °C. Jeśli temperatura jest zbyt niska, mieszanina zestala się przed posiewem, a temperatury powyżej 42 °C wpłyną na żywotność komórek.
  9. Dobrze wymieszać, kilkakrotnie rozcierając komórki i dodać mieszaninę komórek do studzienek, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki, i pozostawić do zestalenia się na 20 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Dodać 2 ml uzupełnionej pożywki do każdej studzienki i przenieść płytki do inkubatora.
    1. Zmieniaj pożywkę raz w tygodniu przez 3-4 tygodnie lub do momentu powstania wielokomórkowych kolonii. Należy uważać, aby nie dotykać agaru podczas wyjmowania podłoża przez zasysanie próżniowe. Alternatywnie użyj P1000, aby usunąć górną warstwę płynnego podłoża.
    2. Wybarwić miękkie płytki agarowe, dodając 200 μl roztworu chlorku tetrazolowego Nitro Blue (1 mg/ml w PBS) i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia zastąpić pożywkę PBS do obrazowania.
    3. Obraz uzyskuje się przy 40-krotnym powiększeniu całkowitym pod mikroskopem odwróconym.
    4. Wykonaj analizę na ImageJ pod kątem powierzchni i liczby kolonii. Wykreślić średnią liczbę powtórzeń biologicznych kolonii ± odchyleniu standardowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat indukcji MET w komórkach mięsaka

Ogólny harmonogram indukcji zmian typu MET w komórkach mięsaka przedstawiono na Rysunku 1. Protokół rozpoczyna się od transdukcji GRHL2 (Rysunek 1A), a następnie od transfekcji rodziny miR-200 (Rysunek 1B). GRHL2 ani członkowie rodziny miR-200 nie były w stanie wpłynąć na wygląd komórek RD podczas samodzielnej ekspresji, jednak ektopowa eksp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mięsaki są rzadkimi, ale bardzo agresywnymi nowotworami o linii mezenchymalnej. Pomimo ich mezenchymalnej linii, podzbiór mięsaków wydaje się przechodzić fenotypowe przejście do stanu bardziej przypominającego nabłonek. Ten przełącznik podobny do MET ma znaczenie prognostyczne ponieważ pacjenci z guzami podobnymi do nabłonka są mniej agresywni24. Pomimo ich znaczenia klinicznego, istnieje niewiele badań dotyczących mechanizmów molekularnych napędzających te przejścia fenotypowe w mięsakach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

JAS dziękuje za wsparcie ze strony Duke Cancer Institute, The Duke University Genitourinary Oncology Laboratory oraz Duke University Department of Orthopaedics. HL był wspierany przez Centrum Teoretycznej Fizyki Biologicznej Narodowej Fundacji Nauki (NSF) (NSF PHY-1427654) i NSF DMS-1361411, a także jako stypendysta CPRIT (Cancer Prevention and Research Institute of Texas) w dziedzinie badań nad rakiem stanu Teksas na Uniwersytecie Rice. KEW był wspierany przez NIH F32 CA192630 MKJ i HL skorzystał z użytecznych dyskusji z Mary C. Farach-Carson, J. N. Onuchic, Samirem M. Hanashem, Kennethem J. Pientą i Donaldem S. Coffeyem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Automatyczny licznik CountessTechnologie życiaAMQAX1000
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283
Termocykler SimpliAmpThermo FisherA24811
Odyssey FcLI-COR Inc
ViiA7 System PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher4453536
PCR mikropłytkaCorning321-29-051
KAPA SYBR Szybki uniwersalny zestaw qPCRKAPA BiosystemsKK4602
Bufor blokujący blok startowy (PBS)Thermo Fisher37538Bufor blokujący na bazie BSA
Agaroza Ogólnego Przeznaczenia LEGenesee Scientific20-102
10x Bufor Tris/Glycine/SDSBio-Rad Laboratories Inc161-0732Bufor biegowy
10x Bufor Tris/GlycineBio-Rad Laboratories Inc161-0734Bufor transferowy
RIPA BufferSigma Life SciencesSLBG8489
Amersham Protran 0.45 μ m nitrocelulozaGE Healthcare Nauki przyrodnicze10600012
Zestaw Quick-RNA MiniPrep GeneseeScientific11-358
Laemmli Bufor do próbek (4X)Bio-Rad Laboratories Inc1610747
Mini-Protean Tetra CellBio-Rad Laboratories Inc1658005EDU
DPBSTechnologie życia14190-144
0,05% Trypsyna-EDTATechnologie życia11995-065
DMEMTechnologie życia11995-065
Lipofectamina RNAi MaxThermo Fisher13778150
Lipofectamina 2000 RagentsThermo Fisher11668019
Penicylina StreptomycynaTechnologie życiowe15140-122
miRNA miRNA naśladuje kontrolę negatywną #1Thermo Fisher4464058neg miRNA
has-miR-200 miRNA mirVana naśladujeThermo Fisher4464066miR200A
has-miR-200 miRNA mirVana naśladujeThermo Fisher4404066miR200B
has-miR-200 miRNA mirVana naśladujeThermo Fisher4404066miR200C
Opti-MEMLife technologies11088-021pożywka bez surowicy
anty-EcadherinBD Bioscience610182
anty-beta aktynaSanta Cruz Biotechnologysc-69879
anty-EpCamAb SerotecMCA18706
anty-ZO1Invitrogen402200
IRDye 800WLI-COR Inc925-32210
IRDye 680LI-COR Inc926-32223
przeciw myszom AlexaFluor 647Thermo FisherA211241
przeciw królikom AlexaFluor 647Thermo Fisherab150075
Inhibitor proteazy i fosforanów HaltThermo Fisher1861281
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad Laboratories Inc161-0374
Partec CellTricsSysmex04-004-232630 μ m filtr przepływu
GAPDH-FIDTAGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-RIDTGCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-FIDTTGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-RIDTCGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-FIDTGCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-RIDTCGATTACACCCAGACTGACTGC powiedział:
NOTCH-FIDTGGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-RIDTCTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro niebieski tetrazolium SigmaN5514
bromek heksadimetrynySigmaH9268z polibrenu
3 mlBD Bioscience309657
Sterylny filtr strzykawkowyVWR28145-505
ml polipropylenowa rurka okrągłodenna352063probówkach do cytometrii przepływowej
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Fisher4368814zestaw do odwrotnej transkrypcji
4% paraformaldyhydSanta Cruz Biotechnologysc-281612
Triton-X100Sigma93443
albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
Mini komórka trans-blot Bio-Rad Laboratories Inc 1703930 przeciwciało strzykawka 5

Bibliografia

  1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
  2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
  3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
  4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
  5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
  6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
  7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
  8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
  9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
  10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
  11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39(2013).
  12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
  13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).
  14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241(2014).
  16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).
  17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
  18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
  20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
  21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
  22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
  23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
  24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
  25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
  26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
  27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
  28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998(2014).
  29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
  30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
  31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Shenghan Xu

to:

Shengnan Xu

Tagi

Przejście mezenchymalno-nabłonkowenadekspresja GRHL2rodzina miR-200transdukcja komórkowacytometria przepływowaekspresja E-kadherynybiomarkery nabłonkowebiomarkery mezenchymalnetest w miękkim agarze
Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.