Artykuł metodologiczny

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55558

⸱

28 marca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji metabolitów ze Staphylococcus aureus i ich późniejszej analizy za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Streszczenie

Aby udaremnić patogeny bakteryjne, gospodarze często ograniczają dostępność składników odżywczych w miejscu infekcji. To ograniczenie może zmienić obfitość kluczowych metabolitów, na które reagują czynniki regulacyjne, dostosowując metabolizm komórkowy. W ostatnich latach wiele białek i RNA stało się ważnymi regulatorami ekspresji genów wirulencji. Na przykład białko CodY reaguje na poziomy aminokwasów rozgałęzionych i GTP i jest szeroko konserwowane w bakteriach Gram-dodatnich o niskiej zawartości G + C. Jako globalny regulator Staphylococcus aureus, CodY kontroluje ekspresję dziesiątek genów wirulencji i metabolicznych. Stawiamy hipotezę, że S. aureus wykorzystuje CodY częściowo do zmiany swojego stanu metabolicznego w celu przystosowania się do warunków ograniczających składniki odżywcze, które mogą wystąpić w środowisku gospodarza. Manuskrypt ten opisuje metodę ekstrakcji i analizy metabolitów z S. aureus przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas, protokołu, który został opracowany w celu sprawdzenia tej hipotezy. Metoda podkreśla również najlepsze praktyki, które zapewnią rygor i odtwarzalność, takie jak utrzymanie biologicznego stanu równowagi i stałe napowietrzanie bez stosowania ciągłych kultur chemostatów. W porównaniu ze szczepem rodzicielskim USA200 wrażliwym na metycylinę izolatu S. aureus UAMS-1, izogeniczny mutant dorsza wykazywał znaczny wzrost aminokwasów pochodzących z asparaginianu (np. treoniny i izoleucyny) oraz spadek ich prekursorów (np. asparaginianu i O-acetylohomoseryny). Odkrycia te dobrze korelują z danymi transkrypcyjnymi uzyskanymi za pomocą analizy sekwencyjnej RNA: geny w tych szlakach były regulowane w górę od 10 do 800 razy w mutancie zerowym dorsza. Sprzężenie globalnych analiz transkryptomu i metabolomu może ujawnić, w jaki sposób bakterie zmieniają swój metabolizm w obliczu stresu środowiskowego lub żywieniowego, dostarczając potencjalnego wglądu w zmiany fizjologiczne związane z niedoborem składników odżywczych występującym podczas infekcji. Takie odkrycia mogą utorować drogę do opracowania nowych leków przeciwinfekcyjnych i terapeutycznych.

Wprowadzenie

Patogeny bakteryjne muszą zmagać się z wieloma wyzwaniami w środowisku gospodarza. Oprócz bezpośredniego ataku komórek odpornościowych, gospodarz sekwestruje również składniki odżywcze niezbędne do przetrwania i replikacji bakterii, generując odporność odżywczą1,2. Aby przetrwać w tych nieprzyjaznych środowiskach, patogeny bakteryjne wykorzystują czynniki wirulencji. Niektóre z tych czynników pozwalają bakteriom uniknąć odpowiedzi immunologicznej; Inne czynniki obejmują wydzielane enzymy trawienne, takie jak hialuronidaza, termonukleaza i lipaza, które mogą umożliwić bakteriom uzupełnienie brakujących składników odżywczych poprzez spożywanie składników pochodzenia tkankowego3,4,5. Rzeczywiście, bakterie wykształciły systemy regulacyjne, które wiążą fizjologiczny stan komórki z produkcją czynników wirulencji6,7,8,9,10.

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że CodY jest krytycznym regulatorem łączącym metabolizm i zjadliwość. Chociaż po raz pierwszy odkryto go u Bacillus subtilis jako represor genu permeazy dipeptydowej (dpp)11, obecnie wiadomo, że CodY jest wytwarzany przez prawie wszystkie bakterie Gram-dodatnie o niskim G+C12,13 i reguluje dziesiątki genów biorących udział w metabolizmie węgla i azotu14,15,16,17,18,19. U gatunków chorobotwórczych CodY kontroluje również ekspresję niektórych z najważniejszych genów wirulencji20,21,22,23,24,25,26,27. Dorsz jest aktywowany jako białko wiążące DNA przez dwie klasy ligandów: aminokwasy rozgałęzione (BCAA; izoleucyna, leucyna i walina [ILV]) i GTP. Kiedy te składniki odżywcze są obfite, CodY hamuje (lub w niektórych przypadkach stymuluje) transkrypcję. W miarę jak te składniki odżywcze stają się ograniczone, aktywność CodY jest stopniowo zmniejszana, co skutkuje stopniowaną odpowiedzią transkrypcyjną, która przekierowuje prekursory przez różne szlaki metaboliczne połączone z metabolizmem centralnym28,29,30.
Tandemowa chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) to potężna technika, która może dokładnie identyfikować i określać ilościowo małocząsteczkowe metabolity wewnątrzkomórkowe31. W połączeniu z analizą transkryptomu (np. RNA-Seq), ten analityczny przepływ pracy może zapewnić wgląd w zmiany fizjologiczne, które zachodzą w odpowiedzi na stres środowiskowy lub żywieniowy. W tym miejscu przedstawiamy metodę ekstrakcji metabolitów z komórek Staphylococcus aureus i późniejszą analizę za pomocą LC-MS. Podejście to zostało wykorzystane do wykazania plejotropowego wpływu CodY na fizjologię S. aureus.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów buforowych

  1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; pH 7,4) rozcieńczając roztwór podstawowy 10x PBS do końcowego stężenia 1x ultraczystą (destylowaną i dejonizowaną) wodą.
  2. Przygotować roztwór hartowniczy, łącząc 2 ml acetonitrylu, 2 ml metanolu, 1 ml ultraczystegoH2Oi 19 μl (0,1 mM stężenia końcowego) kwasu mrówkowego.
  3. Przygotować rozpuszczalnik LC-MS A, dodając kwas mrówkowy (0,2% [v/v] stężenie końcowe) do wody ultraczystej.
  4. Przygotować rozpuszczalnik LC-MS B, dodając kwas mrówkowy (0,2% [v/v] stężenie końcowe) do acetonitrylu.
    UWAGA: Wszystkie roztwory powinny być przygotowywane przy użyciu odczynników o najwyższej dostępnej czystości (zazwyczaj klasy wysokosprawnej chromatografii cieczowej). Roztwory powinny być przygotowywane świeże przed każdym eksperymentem i przechowywane na lodzie przed użyciem.

2. Ustanowienie S. aureus w stanie ustalonym Wzrost

  1. Szczepy Streak S. aureus będące przedmiotem zainteresowania do izolacji na agarze sojowym tryptycznym (TSA) z zamrożonego glicerolu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-24 godziny.
  2. Zaszczepić 4 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) lub innego odpowiedniego podłoża w sterylnych szklanych probówkach inkubacyjnych pojedynczymi koloniami każdego szczepu. Inkubacja nachylona (kąt ~70°) z obrotem z prędkością 60 obrotów na minutę (rpm) w temperaturze 37 °C przez 16-20 h.
    UWAGA: Hodowle nocne są podatne na gradienty tlenu przy użyciu standardowych metod, w tym tych opisanych w kroku 2.2, które wpływają na fizjologię komórkową. W związku z tym stosujemy strategię wielokrotnego rozcieńczania wstecznego, aby zapewnić biologiczny stan stabilny (patrz kroki 2.4-3.2 poniżej).
  3. Użyć spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną kultur z kroku 2.2 przy długości fali 600 nm (średnica zewnętrzna600). Użyj sterylnego podłoża jako odniesienia optycznego (ślepego namiaru). Rozcieńczyć te komórki do OD600 0,05 w 50 ml sterylnego podłoża TSB (wstępnie podgrzanego do 37 °C) w oddzielnych kolbach DeLonga o pojemności 250 ml.
  4. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z wytrząsaniem przy 280 obr./min.
  5. Co 30 minut należy wykonać pomiary OD600; wraz ze wzrostem gęstości optycznej może okazać się konieczne rozcieńczenie kultur za pomocą TSB, tak aby pozostały w liniowym zakresie absorbancji spektrofotometru.
  6. Gdy kultury z kroku 2.5 osiągną OD600 ~0,8-1,0, zahoduj je do 50 ml 37 °C TSB do OD600 0,01-0,05 i powtórz kroki 2.4 i 2.5.

3. Konfiguracja pobierania próbek

  1. Przygotuj warstwę pokruszonego suchego lodu w odpowiednim naczyniu (np. szklanym naczyniu, wiaderku na lód lub chłodziarce).
  2. Gdy gęstości optyczne kultur zbliżają się do pożądanego punktu zbioru, dodać 1 ml roztworu hartowniczego do nieobrobionej szalki Petriego o średnicy 35 mm i wstępnie schłodzić na suchym lodzie przez ≥5 min.
    UWAGA: "Pożądany punkt zbioru" będzie się różnić w zależności od celów eksperymentalnych. Na przykład, jeśli ktoś miałby badać metabolity podczas wzrostu tlenowego, kluczowymi wskaźnikami tego stanu są wydalanie octanu i ponowna asymilacja octanu podczas fazy wzrostu po wykładniczym wzroście32,33. Ogólnie rzecz biorąc, punkt ten powinien znajdować się w określonej fazie wzrostu (np. fazie wykładniczej). Specyficzne wartości OD600 związane z tym etapem mogą się różnić w zależności od różnych szczepów bakterii i pożywek wzrostowych.
  3. Umieścić frytę filtracyjną ze stali nierdzewnej (wstępnie schłodzoną do temperatury -20 °C) w gumowym korku i umieścić ją na kolbie próżniowej podłączonej do domowej pompy próżniowej lub pompy próżniowej.
  4. Zastosuj próżnię i umieść na wierzchu membranę z mieszanego estru celulozy (wielkość porów 0,22 μm).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć filtra o średnicy równej średnicy frytki i odpowiednio wyśrodkować ten filtr, aby zapewnić, że próbka jest wciągana przez filtr, a nie przez krawędź. Zwilżenie membrany lodowatym, sterylnymH2Omoże pomóc w ustawieniu membrany.

4. Pobieranie próbek

  1. Przy średnicy zewnętrznej600 ~0,4-0,5 użyj pipety serologicznej, aby usunąć 13 ml kultury z kolby i nałożyć próbkę na filtr.
  2. Po przefiltrowaniu całej próbki należy natychmiast przemyć filtr ≥5 ml lodowatego PBS w celu wypłukania metabolitów związanych z pożywką.
  3. Odłącz odkurzacz i użyj sterylnej pęsety, aby wyjąć filtr z fryty. Odwróć filtr (komórką do dołu) do wstępnie schłodzonego roztworu hartującego.
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać powyższe kroki szybko (tj. w ciągu kilku sekund) i zaraz po usunięciu płynu, aby zapewnić szybkie wygaszenie komórek, zatrzymując aktywność metaboliczną.
  4. Inkubować filtr w roztworze hartowniczym na suchym lodzie przez ≥20 min.
  5. Za pomocą sterylnej pęsety odwróć filtr (komórką do góry) na szalce Petriego i za pomocą mikropipety spłucz komórki z membrany do roztworu hartującego.
  6. Ponownie zawiesić komórki w roztworze hartującym, a następnie przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki odpornej na uderzenia o pojemności 2 ml zawierającej ~100 μl kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm. Przechowywać na suchym lodzie lub w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja metabolitów

  1. Rozmrażaj próbki na mokrym lodzie i rozbijaj komórki w homogenizatorze z czterema 30-sekundowymi seriami przy 6 000 obr./min, z 2-minutowymi okresami chłodzenia na suchym lodzie między cyklami.
  2. Klarować lizaty przez 15 minut w wstępnie schłodzonej, schłodzonej mikrowirówce z maksymalną prędkością (tj. 18,213 x g w temperaturze ≤4 °C).
  3. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki.
  4. Za pomocą mikropipety przenieść niewielką porcję próbki do probówki mikrowirówkowej w celu ilościowego określenia pozostałej zawartości peptydów w kroku 6; pozostałą część przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Objętość zarezerwowanej próbki różni się w zależności od testu BCA użytego w kroku 6.1. Próbka ta powinna być przechowywana na mokrym lodzie do natychmiastowej analizy lub zamrożona w temperaturze -80 °C.

6. Test kwasu bicunchoninowego (BCA)

  1. Wykonaj test BCA zgodnie z zaleceniami producenta zestawu, używając próbek z kroku 5.4 w celu określenia resztkowego stężenia peptydów dla każdej próbki.

7. LC-MS

  1. Zmieszać 75 μl ekstraktu z S. aureus z 75 μl rozpuszczalnika LC-MS B, przygotowanego w kroku 1.4.
  2. Wiruj, aby wymieszać i wirować z prędkością 13 000 x g przez 5 minut.
  3. Umieścić 100 μl supernatantu w fiolce z chromatografią cieczową (LC) i zamknąć ją. Upewnij się, że w próbce nie są uwięzione żadne pęcherzyki powietrza.
  4. Załaduj fiolki LC do automatycznego podajnika próbek LC-MS i edytuj listę uruchomioną w oprogramowaniu "Offline Worklist Editor".
    1. Wypełnij kolumny "Nazwa próbki" (np. typ dziki-1), "Pozycja próbki" (np. P1-A1), "Metoda" (np. metoda ujemna w kwasie mrówkowym) i "Plik danych" (np. typ dziki 1). Kliknij przycisk "Zapisz listę roboczą". Otwórz oprogramowanie "Stacja robocza akwizycji danych spektrometrii mas" i wprowadź wcześniej zapisaną listę roboczą. Kliknij przycisk "Rozpocznij uruchamianie listy roboczej", aby rozpocząć ciągły pomiar LC-MS.
  5. Oddziel próbki na kolumnie, połącz kolumnę ze spektrometrem czasu przelotu (TOF) i sprzęgnij spektrometr TOF z systemem LC. Użyj gradientu fazy ruchomej w następujący sposób: 0-2 min, 85% rozpuszczalnik B; 3-5 min, 80% rozpuszczalnik B; 6-7 min, 75% rozpuszczalnik B; 8-9 min, 70% rozpuszczalnik B; 10-11,1 min, 50% rozpuszczalnik B; 11,1-14 min, 20% rozpuszczalnik B; i 14,1-24 min, 5% rozpuszczalnik B; zakończyć 10-minutowym okresem rebalansowania przy 85% rozpuszczalniku B i natężeniu przepływu 0,4 ml min-1.
  6. Za pomocą pompy izokratycznej wlej roztwór masy referencyjnej z przebiegiem, aby umożliwić jednoczesną kalibrację osi masy.
    UWAGA: Ten krok jest oparty na standardowej instrukcji spektrometru TOF.
    1. Do przeprowadzenia kalibracji w czasie rzeczywistym należy użyć mieszaniny kwasu octowego D4 i fosfazyny heksakisu (1H,1H,3H-tetrafluoropropoksy) jako roztworu masy odniesienia. Do infuzji należy użyć pompy izokratycznej o natężeniu przepływu 2,5 ml min-1.

8. Korekta wsadowa liczby jonów

  1. Oznaczyć dowolną próbkę, która ma służyć jako próbka referencyjna do korekty partii (np. typu dzikiego, powtórzenie 1).
  2. Obliczyć sumę liczby jonów dla wszystkich metabolitów w próbce odniesienia. Powtórzyć to obliczenie dla wszystkich próbek.
  3. Podzielić całkowitą liczbę jonów w każdej próbce przez całkowitą liczbę jonów w próbce referencyjnej, aby uzyskać stosunek.
  4. Podzielić liczbę jonów dla każdego metabolitu w próbce przez stosunek próbka/odniesienie, aby uzyskać skorygowaną o partię liczbę jonów dla każdego metabolitu.

9. Normalizacja peptydów

  1. Podzielić skorygowane o partię wartości liczby jonów dla każdej próbki otrzymanej w kroku 8 przez stężenie peptydu oznaczone testem BCA w kroku 6, aby uzyskać znormalizowaną wartość dla każdego metabolitu.
    UWAGA: Znormalizowana, skorygowana o partię liczba jonów dla każdego metabolitu uzyskana w kroku 9.1 może być bezpośrednio porównana między szczepami i poddana analizie statystycznej (np. Test U Manna-Whitneya). Alternatywnie, metabolit, o którym wiadomo, że nie zmienił się ani w wyniku poddania działaniu substancji, ani w wyniku działania genów, może być stosowany jako normalizator do wykrywania zmian spowodowanych rozkładem metabolitów. Włączenie znanej ilości L-norwaliny lub kwasu glurarowego do buforu ekstrakcyjnego może być wykorzystane do skorygowania strat podczas przetwarzania próbki34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeanalizowaliśmy wewnątrzkomórkowe pule metabolitów w S. aureus podczas wzrostu in vitro w bogatym, złożonym medium. W ramach dowodu koncepcji porównaliśmy profile metabolitów między izolatem zapalenia szpiku S. aureus UAMS-1 wrażliwym na metycylinę (typ dziki [WT]) a izogenicznym szczepem pozbawionym globalnego regulatora transkrypcyjnego CodY (ΔcodY)26. Kultury WT i szczepów codY w stanie stacjonarnym w fazie wykładn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wszystkie metabolity małocząsteczkowe są ze sobą połączone poprzez wspólne pochodzenie z centralnych szlaków metabolicznych. Podczas wykładniczego wzrostu komórki bakteryjne znajdują się w biologicznym i metabolicznym stanie równowagi, zapewniając migawkę stanu fizjologicznego w określonych warunkach. CodY monitoruje wystarczalność składników odżywczych, reagując na ILV i GTP. Wraz ze spadkiem puli ILV i GTP, aktywność CodY jest prawdopodobnie stopniowo zmniejszana, dostosowując ekspresję docelowych genów do przystosowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH Pathway to Independence Award (grant GM 099893) oraz fundusze na rozpoczęcie nauki przez wydział SRB, a także grant na projekt badawczy (grant GM 042219). Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał/Sprzęta
DeLong Kolba hodowlana (250 ml)Belco2510-00250
Kolba boczna, 500 mlPyrex5340
3-otworowy gumowy korek, #7Fisher14-131E
Uchwyt filtra ze stali nierdzewnej/frytaVWR89428-936
Szalka Petriego, 35 mmCorning430588Nie poddana działaniu kultur tkankowych
Błona z mieszanego estru celulozy, 0,22 μ m wielkość porówMilliporeGSWP02500
Probówki odporne na uderzenia, 2 mlUSA Scientific1420-9600
Kulki krzemionkowe, 0,1 mmBiospec Products Inc11079101Z
Homogenizator Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAPierce (Thermo Scientific)23235
Kolumna Cogent Diamond Hydride typu CAgilent70000-15P-2
Dokładny czas przelotu (TOF) LC-MS, pompa Quat AgilentG6230B
, seria 1290AgilentG4204A 
Pompa pojemnika, seria 1290AgilentG4220A 
Napęd zaworu, seria 1290AgilentG1107A 
Pompa izokratyczna Agilent serii 1290G1310B 
TCC, Seria 1290AgilentG1316C 
AgilentG4226A serii 1290
Termostat, seria 1290AgilentG1330B 
Chemical
Tryptic Soy BulionBecton Dickinson211825
Difco Agar, GranulowanyBecton Dickinson214530Stałe podłoże zawiera 1,5% [w/v] agar
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (pH 7,4) 10xAmbionAM9624Rozcieńczyć na świeżo do 1x ultra czystą wodą
AcetonitrylFisher ScientificA955-500Optima LC-MS
MetanolFisher ScientificA456-500Optima LC-MS; toksyczny
Kwas mrówkowySigma Aldrich94318Do spektrometrii mas, 98%
Software
MassHunterAgilentG3337AA
Szczep bakteryjnyGatunekSzczepGenotyp
SRB 337Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1typ dziki
SRB 372Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1Δ codY::erm
aWymienione chemikalia i materiały są specyficzne dla opisanej metody i nie obejmują standardowych chemikaliów laboratoryjnych ani materiałów eksploatacyjnych.
serii 6200Próbnik

Bibliografia

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767(2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja metabolit wmutant CodYrodzina aspartianuoznaczanie ilo ci aminokwas wmetabolizm bakteryjnywyczerpanie sk adnik w od ywczych

Powiązane artykuły