Artykuł metodologiczny

Test 5-mC Dot Blot określający ilościowo poziom metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro

DOI:

10.3791/55565

⸱

17 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy metodę ilościowego oznaczania metylacji DNA na podstawie plamy punktowej 5-metylocytozyny (5-mC). Określiliśmy poziomy 5-mC podczas dedyferencjacji chondrocytów. Ta prosta technika może być wykorzystana do szybkiego określenia fenotypu chondrocytów w leczeniu ACI.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dedyferencjacja chondrocytów szklistych na chondrocyty fibroblastyczne często towarzyszy jednowarstwowej ekspansji chondrocytów in vitro. Globalny poziom metylacji DNA chondrocytów jest uważany za odpowiedni biomarker utraty fenotypu chondrocytów. Jednak wyniki oparte na różnych metodach eksperymentalnych mogą być niespójne. Dlatego ważne jest, aby ustalić precyzyjną, prostą i szybką metodę ilościowego określania globalnych poziomów metylacji DNA podczas dedyferencjacji chondrocytów.

Obecne techniki analizy metylacji całego genomu w dużej mierze opierają się na sekwencjonowaniu genomu wodorosiarczynowego. Ze względu na degradację DNA podczas konwersji wodorosiarczynu, metody te zazwyczaj wymagają dużej objętości próbki. Inne metody stosowane do ilościowego określania globalnych poziomów metylacji DNA obejmują wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Jednak HPLC wymaga całkowitego trawienia genomowego DNA. Ponadto zbyt wysoki koszt urządzeń HPLC ogranicza szersze zastosowanie HPLC.

W tym badaniu, genomowe DNA (gDNA) zostało wyekstrahowane z ludzkich chondrocytów hodowanych z różną liczbą pasaży. Poziom metylacji gDNA wykryto za pomocą testu dot blot specyficznego dla metylacji. W tym podejściu dot blot mieszanina gDNA zawierająca metylowane DNA, które miało zostać wykryte, została zauważona bezpośrednio na błonie N+ jako kropka wewnątrz wcześniej narysowanego okrągłego wzoru matrycy. W porównaniu z innymi metodami blottingu opartymi na elektroforezie żelowej i innymi złożonymi procedurami blottingu, metoda dot blot pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu. Ponadto dot blot może wykrywać ogólny poziom metylacji DNA za pomocą dostępnego na rynku przeciwciała 5-mC. Odkryliśmy, że poziom metylacji DNA różnił się między subkulturami jednowarstwowymi, a zatem może odgrywać kluczową rolę w dedyferencjacji chondrocytów. Plama punktowa 5 mC jest niezawodną, prostą i szybką metodą wykrywania ogólnego poziomu metylacji DNA w celu oceny fenotypu chondrocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologiczna implantacja chondrocytów (ACI) jest stosunkowo nową, najnowocześniejszą procedurą leczenia wad chrząstki stawowej1,2. Jednym z kluczowych etapów ACI jest amplifikacja chondrocytów za pomocą monowarstwowej hodowli in vitro. Podczas amplifikacji chondrocyty szkliste łatwo tracą swój fenotyp i ulegają odróżnicowaniu, co jest niepożądane w leczeniu ACI3,4. Aby zoptymalizować wyniki leczenia ACI, przed replantacją należy określić stopień odróżnicowania chondrocytów. Konieczne jest ustanowienie ekonomicznego i szybkiego sposobu określania statusu chondrocytów. Ostatnio wiele uwagi przyciągnął związek między metylacją DNA a dedyferencjacją chondrocytów4,5,6. Metylacja DNA to proces, w którym grupy metylowe są dodawane do DNA, w wyniku czego dochodzi do konwersji reszt cytozyny do 5-metylocytozyny (5-mC).

Aby wyjaśnić biologię metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów, pierwszym krokiem jest ocena poziomu metylacji DNA chondrocytów, co do tej pory okazało się wyzwaniem. Sekwencjonowanie genomu wodorosiarczynu jest najczęściej stosowaną techniką analizy metylacji DNA7,8. W tym teście konwersja wodorosiarczynu powoduje degradację DNA, a zatem do testu należy dostarczyć znaczną ilość próbki. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) została również wykorzystana do ilościowego określenia globalnych poziomów metylacji DNA9,10. Jednak analiza HPLC wymaga trawienia genomowego DNA. Ponadto potrzebne są zaawansowane i drogie instrumenty eksperymentalne. Dlatego oprócz wysokich kosztów te procedury eksperymentalne są czasochłonne. Przeciwciała anty-5-mC stały się obecnie dostępne na rynku, co stworzyło możliwość immunologicznego oczyszczenia genomowego DNA zawierającego 5-mC ze złożonych genomów.

W tym raporcie wyodrębniliśmy genomowe DNA z chondrocytów hodowanych w serii kultur jednowarstwowych. Zastosowaliśmy test dot blot do oceny zawartości 5-mC w ludzkich chondrocytach o różnej liczbie pasaży. Odkryliśmy, że zawartość 5-mC była zwiększona w wysoce odróżnicowanych chondrocytach w porównaniu z chondrocytami z dedyferencjacją o niskim stopniu nasilenia. Dodatkowo zidentyfikowaliśmy związek między stanem odróżnicowania a poziomami 5-mC. Na koniec poinformowaliśmy, że zmiany w zawartości 5-mC były związane z fenotypem chondrocytów. Dlatego test 5-mC dot blot jest niezawodną, prostą i szybką metodą wykrywania poziomu metylacji DNA w chondrocytach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Człowieka Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen.

1. Pobieranie tkanki chrząstki stawowej człowieka i hodowla chondrocytów

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną. Przygotuj 1 mg/ml kolagenazy II, 0,25% trypsyny-EDTA, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i sitko do komórek (nylon 40 μm).
  2. Pobieranie tkanki chrząstki stawowej człowieka
    1. Izolować chrząstkę stawową ze stawów kolanowych pacjentów dawców po urazie. Uzyskaj świadomą zgodę od wszystkich uczestników.
    2. Chrząstkę pokroić w kostkę na1-2 mm 3 kawałki za pomocą sterylnego skalpela i trawić chondrocyty z mielonej chrząstki za pomocą 1 mg/ml kolagenazy II w DMEM w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.
    3. Przefiltrować powstałą zawiesinę komórek przez sitko do komórek (40 μm) i przemyć dwukrotnie PBS.
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i nasion o gęstości 20 000-30 000 komórek/cm2 w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną.
    5. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  3. Jednowarstwowa ekspansja chondrocytów
    1. Zbierz sub-konfluentne komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i ponownie płytkuj z gęstością 6,600 komórek/cm2. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.
    2. Hoduj chondrocyty w monowarstwach przez maksymalnie sześć pasaży i oceniaj w pasażach 1, 2, 3, 4 i 5.

2. Ekstrakcja genomowego DNA (gDNA)

  1. Zebrać komórki i ponownie zawiesić w 500 μl buforu do lizy (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg/ml RNazy A) na 10 milionów komórek. Zawiesić komórki przez pipetowanie i szybkie odwrócenie, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Dodać proteinazę K o stężeniu 160 μg/ml lizatu komórkowego i energicznie odwrócić mieszaninę. Inkubować 6 godzin w temperaturze 55 °C.
  3. Dodać jedną objętość Tris pH 7,9 nasyconego fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) do próbki. Dokładnie wstrząsnąć lub wstrząsnąć próbkę ręcznie przez około 20 sekund.
  4. Odwirować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy stężeniu 13 000 × g. Usunąć górną fazę wodną i przenieść warstwę do świeżej probówki.
  5. Ekstrahować z równą objętością chloroformu w celu usunięcia fenolu i przeniesienia górnej fazy wodnej do świeżej probówki.
  6. Wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości próbki 3 M octanu sodu o pH 8,0 i 2 objętości 100% etanolu.
  7. Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C przez noc w celu wytrącenia gDNA.
  8. Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 16 000 x g w celu osadzenia gDNA.
  9. Przemyć próbkę trzykrotnie 70% etanolem i odwirować w temperaturze 4 °C przez 2 minuty przy 13 000 x g.
  10. Ostrożnie usunąć supernatant, a następnie wysuszyć na powietrzu. Ponownie zawiesić DNA w 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. Profilowanie metylacji DNA

  1. Użyj zestawu do metylacji DNA, aby przeprowadzić reakcję konwersji wodorosiarczynu, używając łącznie 500 ng genomowego DNA, zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 10 μl buforu elucyjnego (50 ng/μl).
  2. Wykonaj profilowanie metylacji DNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.

4. Analiza plam punktowych

  1. Denaturować wyizolowany DNA (1 mg na próbkę) w 0,1 M NaOH przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Zneutralizować DNA za pomocą 1 M NH4OAc na lodzie, a następnie rozcieńczyć dwukrotnie. Umieścić 2 μl seryjnie rozcieńczonego genomowego DNA na błonie N+.
  2. Osuszyć membranę w temperaturze 80 °C przez 30 minut.
  3. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał poprzez namoczenie błony N+ w 5% BSA w TBS-T przez 1 godzinę. Użyj 10 cm szalki Petriego jako komory reakcyjnej w temperaturze pokojowej.
  4. Po trzykrotnym przemyciu 5 minut w TBST, inkubować błonę z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-5-metylocytozyny (5-mC) (1:1,000) w TBS-T w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Przemyć błonę przez 5 minut trzykrotnie w TBS-T, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym, sprzężoną z HRP owczą immunoglobuliną przeciw-mysią G (IgG) (1:5 000) w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj membranę przez 5 minut trzykrotnie w TBS-T.
  7. Dodaj substrat enzymatyczny do błony i inkubuj przez 5-10 minut. Zwizualizuj sygnał przeciwciał drugorzędowych za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chondrocyty hodowano w monowarstwie aż do przejścia 6 (P6). Chondrocyty wykazywały postępujące zmiany fenotypowe wraz z kolejnymi pasażami kultury jednowarstwowej. Morfologia chondrocytów P0 była okrągła, podczas gdy komórki stały się mocno ściśnięte i spłaszczone z kolejnymi przejściami aż do P6 (ryc. 1). Ta zmiana morfologii jest typowa dla procesu dedyferencjacji chondrocytów. Tymczasem wyniki mapy cieplnej wskazały, że ogólny poziom metylacji miejsc CpG wzrastał wraz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dedyferencjacja chondrocytów in vitro poważnie pogarsza wynik ACI w leczeniu naprawy ubytków chrząstki11,12. Aby zoptymalizować wyniki ACI, ważne jest, aby unikać stosowania niezróżnicowanych chondrocytów13. Badania sugerują, że ogólny poziom metylacji DNA jest związany z zakresem dedyferencjacji chondrocytów 4,6. Dlatego konieczne jest opracowanie niezawodnej i szybkiej m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez następujące granty: Chińska Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81572198; Nr 81260161; Nr 81000460); Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong, Chiny (nr 2015A030313772); Projekt finansowany przez Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (nr 2013M530385); Fundacja Badań Medycznych Prowincji Guangdong, Chiny (nr A2016314); Projekty naukowo-technologiczne w Shenzhen (nr JCYJ20160301111338144; Nie. JSGG20151030140325149; Nie. JSGG20140519105550503; Nr GJHZ20130412153906739; Nie. JCYJ20140414170821160; Nr JCYJ20140414170821200).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reagents
DMEMGibco Inc.11965– 092Ciepły w 37 & deg; C kąpiel wodna przed użyciem
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BD-PBS, wolne od Ca2+/Mg2+
FBSGibco Inc.10099-141
0,25% Trypsyna/EDTAGibco Inc.25200-056
1% Penicylina-StreptomycynaGibco Inc.15140-122
ChloroformMallinckrodt4440
Alkohol izoamylowySigmaI-3643
FenolGibco BRL15513-039
Proteinaza KGibco BRL24568-2
Bufor TAE Bio Whittaker16-011V
Woda destylowanaGibco BRL15230-170
1 M Tris-HClBiosharp Inc.BL514A
Tween20Biotoppped Inc.
BSAProliant Inc.68700
Kolagenaza, typ IISigma-AldrichC6885
[nagłówek]
Equipment
HemocytometrISOLAB Inc.075.03.001
Talerz Falcon 100 mmCorning353003
Probówki wirówkoweTPP AG91050sterylizowana promieniami gamma
Eppendorf5804R
ThermoMixerMIULABMTH-100
Inkubator komórek dwutlenku węglaThermo scientific3111
System analizy chemicznejUVITEC CambridgeALLIANCE
C58H114O26 Wirówka szybkoobrotowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
  2. Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
  3. Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
  4. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
  5. Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
  6. Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
  7. Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
  8. Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
  9. Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
  10. Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
  11. Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
  12. Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
  13. Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
  14. Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
  15. Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
  16. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dot blot 5 metylocytozynytest metylacji DNAekstrakcja genomowego DNAprocedura dot blotdetekcja przeciwcia przeciwko 5 mCanaliza fenotypu chondrocyt wautologiczna implantacja chondrocyt wmetoda denaturacji DNAdetekcja chemiluminescencyjna

Powiązane artykuły