Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Podsumowanie

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Streszczenie

Demonstrujemy użycie Bio3D-web do interaktywnej analizy danych o strukturze biomolekularnej. Aplikacja internetowa Bio3D-web zapewnia funkcjonalność online dla: (1) Identyfikacja powiązanej struktury białka ustawia się na określone przez użytkownika progi podobieństwa; (2) Ich wielokrotne wyrównanie i superpozycja struktury; (3) Analiza zachowania sekwencji i struktury; (4) Mapowanie relacji między konformerami z analizą głównych składowych oraz (5) porównanie przewidywanej dynamiki wewnętrznej za pomocą zespołowej analizy w trybie normalnym. Ta zintegrowana funkcja zapewnia kompletny przepływ pracy online do badania zależności sekwencja-struktura-dynamika w rodzinach białek i nadrodzinach.

Wprowadzenie

Bank danych o białkach (PDB) zawiera teraz ponad 120 000 struktur białkowych - wiele z nich należy do tej samej rodziny białek, ale zostały rozwiązane w różnych warunkach eksperymentalnych. Te wielorakie struktury stanowią nieocenione źródło informacji o zawiłościach formy i funkcji białek. Na przykład, rygorystyczne porównanie tych zespołów strukturalnych może ujawnić ważne mechanizmy molekularne ^1,2,3 i informować o dynamice konformacyjnej związanej z procesami, w tym wiązaniem ligandów, katalizą enzymatyczną i rozpoznawaniem dwucząsteczkowym ^4,5,6,7. Nowe informacje można często uzyskać dzięki szczegółowej analizie na dużą skalę sekwencji, struktury i dynamiki rodzin białek. Wymaga to jednak zazwyczaj znacznej wiedzy z zakresu bioinformatyki i programowania komputerowego oraz znajomości badanych układów białkowych. Na przykład pakiety oprogramowania, takie jak Bio3D, ProDy i Maven, wymagają programowania odpowiednio w R, Pythonie i Matlabie ^8,9,10. Z drugiej strony, narzędzia online do analizy elastyczności strukturalnej są na ogół ograniczone do badania poszczególnych struktur ^11,12. Wyjątkiem pod tym względem jest niedawno opracowany serwer WebNM@, który pozwala na porównanie wzorców elastyczności uzyskanych z analizy w trybie normalnym (NMA) kilku wstępnie wyrównanych struktur określonych przez użytkownika¹³. Serwer ten nie posiada jednak zautomatyzowanej procedury identyfikacji struktur do porównania, ich wyrównania lub dalszej analizy poza NMA. Innym najnowszym wkładem jest internetowa baza danych PDBFlex, która przedstawia wstępnie obliczoną analizę struktur PDB o łącznej tożsamości sekwencji 95% lub wyższej¹⁴. Jednak analiza bardziej zróżnicowanych zestawów konstrukcji nie jest obecnie dostępna.

Wcześniej prezentowaliśmy Bio3D-web - łatwą w użyciu aplikację internetową do analizy zależności sekwencja-struktura białka-dynamika¹⁵. Wyjątkowość Bio3D-web polega na dostarczaniu łatwej w użyciu, zintegrowanej funkcjonalności do identyfikacji, porównywania i szczegółowej analizy dużych zestawów struktur homologicznych online. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web. Bio3D-web zapewnia różnorodne funkcje wspierające pięć głównych etapów analizy danych pokazanych na rysunku 1 i szczegółowo omówionych poniżej. Te kroki składają się na przepływ pracy, który rozciąga się od sekwencji zapytań lub danych wejściowych struktury, przez wiele poziomów analizy sekwencyjno-strukturalnej, aż po generowanie raportu podsumowującego. Wyniki są dostępne natychmiast za pośrednictwem rozbudowanych urządzeń do wizualizacji i wykresów w przeglądarce, a także poprzez pobieranie plików wyników w powszechnie używanych formatach. Oprócz wygodnego, łatwego w użyciu dynamicznego interfejsu do badania wpływu wyboru parametrów i metod, Bio3D-web rejestruje również pełne dane wejściowe użytkownika i późniejsze wyniki graficzne sesji użytkownika w postaci możliwego do udostępnienia powtarzalnego raportu w formatach PDF, DOC i HTML. Sesje użytkownika mogą być zapisywane i ponownie ładowane w przyszłości, a pełne wyniki mogą być pobierane i dalej interpretowane przez pakiet Bio3D R na komputerze lokalnym użytkownika.

Bio3D-web jest zasilany przez pakiet Bio3D R do analizy struktury biomolekularnej, sekwencji i danych symulacji molekularnej ^8,16. W szczególności podstawą aplikacji są algorytmy Bio3D do identyfikacji rdzenia sztywnego ⁸, superpozycja, analiza głównych składowych (PCA) ⁸ oraz zespołowa analiza w trybie normalnym (eNMA) ¹⁶. Korzystamy również z protokołów Bio3D, które zależą od pHMMER ¹⁷ do identyfikacji powiązanych struktur białkowych, oraz MUSCLE ¹⁸ do wyrównania wielu sekwencji. Adnotacje dotyczące struktury i sekwencji są uzyskiwane za pomocą narzędzi Bio3D z baz danych RCSB PDB ¹⁹ i PFAM ²⁰. Bio3D-web może być uruchomiony z naszego serwera online lub zainstalowany lokalnie na dowolnym komputerze z uruchomionym R. Bio3D-web jest otwarty dla wszystkich użytkowników i jest udostępniany bezpłatnie na licencji open source GPL-3 od: http://thegrantlab.org/bio3d/webapps

Protokół

UWAGA: Typowa sesja internetowa Bio3D przechodzi przez pięć następujących po sobie i zależnych od siebie kroków (patrz Rysunek 1 dla schematycznej reprezentacji). Każdy krok jest zaimplementowany jako kolejna zakładka nawigacyjna aplikacji internetowej, a mianowicie SEARCH, ALIGN, FIT, PCA i eNMA.

1. Wyszukiwanie i wybór struktury (SEARCH)

1. Struktura wejściowa
   1. Uzyskaj identyfikator PDB kinazy adenylanowej (Adk), np. przeszukując PDB [http://www.rcsb.org/pdb]. Alternatywnie należy uzyskać interesującą sekwencję aminokwasów białkowych, np. z UniProt [http://uniprot.org].
   2. Wprowadź czteroznakowy identyfikator PDB dla Adk (np. 1AKE) lub wklej sekwencję białka w polu tekstowym w panelu "Struktura wejściowa lub sekwencja".
2. Wybór trafienia
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (wybór trafienia) w pierwszym panelu lub po prostu przewiń w dół do panelu B) "Wybór trafienia" w celu dalszej analizy.
   2. Upewnij się, że suwak "Ogranicz łączną liczbę uwzględnionych struktur" jest ustawiony na maksymalną wartość, aby uwzględnić wszystkie struktury powyżej punktu odcięcia.
   3. Zmniejsz wartość "Dostosuj odcięcie BitScore włączenia", aby uwzględnić bardziej odległe trafienia, lub zwiększ ją, aby wykluczyć.
3. Opcjonalne filtrowanie działań
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (naciśnij wybór) w pierwszym panelu lub po prostu przewiń w dół do panelu C) "Opcjonalne filtrowanie powiązanych struktur do dalszej analizy".
   2. Upewnij się, że wybrane trafienia reprezentują odpowiednie struktury, sprawdzając szczegóły tabeli, np. nazwę PDB, gatunki i związane ligandy.
   3. W razie potrzeby ręcznie doprecyzuj wybrany podzbiór struktur, klikając wiersze tabeli.
      UWAGA: Wiersze wyróżnione kolorem niebieskim przedstawiają identyfikatory PDB wybrane do dalszej analizy w kolejnych zakładkach.

2. Analiza wyrównania wielu sekwencji (ALIGN)

1. Kliknij zakładkę WYRÓWNAJ, aby wykonać sekwencyjne wyrównanie wybranych struktur z zakładki SZUKAJ.
2. Podsumowanie wyrównania
   1. Przejrzyj podsumowanie wyrównania w panelu A) "Podsumowanie wyrównania". Upewnij się, że obszary zainteresowania są wyrównane i nie są maskowane przez przerwy w jednej lub kilku strukturach.
   2. W razie potrzeby przełącz opcję "Wyświetl opcje edycji wyrównania" i usuń niechciane identyfikatory PDB, np. PDB z brakującymi pozostałościami.
3. Analiza dopasowania sekwencji
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (Analiza), aby przeprowadzić analizę klastrów opartą na sekwencjach zebranych struktur.
   2. Wybierz opcję działki Dendrogram. Dostosuj suwak Klaster w K grupach, aby podzielić struktury na k grup.
   3. Opcjonalnie zmień metodę klastrowania w razie potrzeby, przełączając pole wyboru Więcej opcji klastrowania i danych wyjściowych.
4. Analiza konserwacji pozostałości
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (Konserwacja), aby obliczyć ochronę pozostałości w kolumnach.
   2. Wybierz zestawy Wyrównana struktura, aby wygenerować wykres zachowania pozostałości w każdej pozycji wyrównania.
   3. Wybierz opcję Struktury wyrównane z wyrównaniem nasion PFAM, aby wyświetlić konserwację obliczoną w odniesieniu do skojarzonego wyrównania nasion PFAM zawierających reprezentatywnych członków rodziny.
5. Wyświetlanie wyrównania sekwencji
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (Wyrównanie), aby wyświetlić pełne wyrównanie sekwencji za pomocą narzędzia do wizualizacji wyrównania w przeglądarce.

3. Dopasowanie i analiza konstrukcji (FIT)

1. Wykonaj nakładanie konstrukcji, wchodząc w zakładkę DOPASUJ.
2. Superpozycja struktury
   1. Przełącz pole wyboru "Pokaż PDB", aby wyświetlić wyrównane struktury białkowe w przeglądarce.
   2. Upewnij się, że struktury białkowe są nałożone na odpowiednie i odpowiednie regiony za pomocą oględzin. Kliknij i przeciągnij myszą nad strukturami, aby je obrócić, i przewiń, aby powiększyć.
   3. Dostosuj kolorystykę struktur, klikając "Opcje kolorów". Opcje kolorowania obejmują pozycję wyrównania, zmienność strukturalną dla każdej pozycji, grupy klastrów RMSD, grupy klastrów sekwencji, wyrównane regiony i strukturę drugorzędną.
   4. Pobierz nałożone struktury jako konwencjonalne pliki PDB lub jako pojedynczy plik sesji PyMOL w celu wizualizacji w specjalistycznym programie do przeglądania molekularnego.
3. Analiza konstrukcji
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (Analiza), aby przeprowadzić grupowanie zebrane struktury PDB w oparciu o strukturę.
   2. Przełącz mapę cieplną RMSD w menu rozwijanym Opcje wykresu.
   3. Dostosuj opcje grupowania, w tym samą metodę grupowania, przełączając pole wyboru "Więcej opcji grupowania i wyjścia".
      UWAGA: Parami dane RMSD mogą być również wizualizowane jako dendrogram, histogram lub mapa cieplna.
4. Wahania pozostałości
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (RMSF), aby wyświetlić zmienność strukturalną każdej pozostałości (pokazanej jako wykres RMSF) z głównymi elementami struktury drugorzędowej pokazanymi w obszarach brzeżnych osi x.
   2. Zaznacz pole wyboru Pokaż współczynniki B, aby nałożyć krystalograficzne współczynniki B struktury odniesienia na wykres RMSF.

4. Analiza głównych składowych (PCA)

1. Analizę składowych głównych należy przeprowadzić, wchodząc w zakładkę "PCA".
2. Wizualizacja głównych komponentów
   1. Przełącz pole wyboru "Pokaż trajektorię komputera", aby wizualizować ruchy opisane przez komputery za pomocą narzędzia do wizualizacji w przeglądarce.
   2. Upewnij się, że z pierwszego menu rozwijanego wybrano opcję "Główny składnik 1".
   3. Aby zobrazować ruchy opisane przez inne komputery, wybierz żądany komputer z menu rozwijanego "Wybierz główny komponent".
   4. Zmień kolorowanie trajektorii z menu rozwijanego "Opcje kolorów".
   5. Wybierz "Zmienność na pozycję" z "Opcji kolorów", aby pokolorować według wielkości przemieszczenia.
   6. Kliknij przycisk "Pobierz trajektorię PDB" w panelu "Wizualizacja głównych komponentów", aby uzyskać widok trajektorii ruchu opisanego przez komputery.
   7. Kliknij przycisk "Pobierz plik sesji PyMOL", aby wygenerować plik sesji PyMOL podający ruchy jako pole wektorowe.
3. Analiza konformatora
   1. Rzutuj poszczególne struktury na dwa wybrane komputery, klikając niebieski przycisk "Dalej" (Fabuła).
   2. Upewnij się, że opcja "PC na osi X" jest ustawiona na 1, a "PC na osi Y" na 2. Aby rzutować struktury na inne komputery, dostosuj odpowiednio numerację komputerów.
   3. Wybierz "Cluster by PC Subspace", aby pokolorować struktury na wykresie za pomocą grupowania opartego na PC; "RMSD" aby pokolorować za pomocą grupowania "opartego na RMSD" i "Sequence", aby pokolorować według grupowania opartego na sekwencji.
   4. Kliknij dowolne punkty na wykresie, aby oznaczyć struktury. Możesz też zaznaczyć jedną lub więcej struktur w tabeli "Adnotacja wykresu konformatora PCA" poniżej wykresu.
   5. Przesuń suwak Komputery w podprzestrzeni, aby uwzględnić więcej/mniej komputerów dla algorytmu klastrowania.
4. Wkład pozostałości
   1. Oblicz udział pozostałości w poszczególnych komputerach, klikając niebieski przycisk "Dalej" (Wkład pozostałości).
   2. Narysuj składki dla dodatkowych komputerów, podając numer komputera w polu tekstowym "Wybierz główny komponent".
   3. Przełącz pole wyboru "Linie rozprowadzania", unikając wykreślania wkładów pozostałości jedna na drugiej.
   4. Wyłącz pole wyboru "Wykres wieloliniowy", aby wykreślić udział pozostałości na oddzielnych wykresach.
   5. Przełącz opcję "Pokaż RMSF", aby uwzględnić wartości RMSF (z zakładki DOPASOWANIE).

5. Zespołowa analiza w trybie normalnym (eNMA)

1. Kliknij kartę eNMA, aby rozpocząć obliczanie trybów normalnych (NM).
2. Struktura filtra
   1. Dostosuj liczbę struktur, zmniejszając lub zwiększając "Punkt odcięcia" dla włączania/wykluczania struktur.
   2. Kliknij zielony przycisk "Uruchom Ensemble NMA", aby rozpocząć obliczanie NMA.
3. Wizualizacja trybów normalnych
   1. Przewiń w dół do drugiego panelu zakładki eNMA (Wizualizacja trybów normalnych), aby wyświetlić NMs.
      UWAGA: Domyślnie w oknie wizualizacji wyświetlany jest NM o największym nałożeniu (podobieństwie) do PC-1.
   2. Aby zobrazować ruchy opisane przez inne NM lub inne struktury PDB, wybierz żądany NM i strukturę odpowiednio z menu rozwijanych "Wybierz tryb" i "Pokaż NM dla struktury".
4. Wahania pozostałości
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (Fluktuacje), aby obliczyć fluktuacje reszt struktur wybranych dla eNMA.
   2. Przełącz opcję "Klaster według RMSD", aby pokolorować profile fluktuacji według klastrowania opartego na RMSD.
   3. Przełącz opcję "Klaster według RMSIP", aby pokolorować profile fluktuacji według klastrowania opartego na RMSIP.
   4. Przełącz pole wyboru "Linie rozrzutu", aby wykreślić pogrupowane profile fluktuacji oddzielnie od siebie.
5. Porównanie NMA i PCA
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (PCA-vs-NMA), aby obliczyć podobieństwo między poszczególnymi NM i PC.
   2. Wybierz identyfikator PDB z menu rozwijanego "Porównaj NM struktury", aby obliczyć podobieństwo NM tej struktury do PC obliczonych w zakładce PCA.
6. Analiza nakładania się
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (Analiza nakładania się), aby obliczyć nakładanie się obliczonych NM i wektora różnicy konstrukcji między dwiema wybranymi konstrukcjami.
   2. Wybierz "referencyjny" identyfikator PDB z menu rozwijanego "Porównaj NM struktury" i/lub jeden lub więcej identyfikatorów PDB w tabeli struktury, aby porównać parami z referencyjnym PDB.
7. Analiza klastrowa
   1. Kliknij niebieski przycisk "Dalej" (Grupowanie), aby wykonać grupowanie struktury w oparciu o podobieństwo NM parami (RMSIP).

Wyniki

Kinaza adenylanowa (Adk) jest wszechobecnym enzymem, który działa w celu utrzymania równowagi między nukleotydami cytoplazmatycznymi, niezbędnymi dla wielu procesów komórkowych. Adk działa poprzez katalizowanie odwracalnego transferu grupy fosforylowej z ATP do AMP. Tej reakcji towarzyszą dobrze zbadane przejścia konformacyjne ograniczające szybkość ^3,21. Tutaj analizujemy wszystkie obecnie dostępne struktury Adk za pomocą Bio3D-web, aby ujawnić szczegółowe cechy i mechanistyczne zasady tych niezbędnych przejść.

Możemy rozpocząć naszą analizę Bio3D-web Adk, wprowadzając kod RCSB PDB dowolnej znanej struktury Adk. Na przykład wpisanie identyfikatora PDB ID 1AKE w panelu A zakładki SZUKAJ zwraca 167 sekwencji podobnych struktur, z których automatycznie wybieranych jest 26 pierwszych do dalszej analizy (patrz panel B). Adnotacja przedstawiona w panelu C wskazuje, że wszystkie te wybrane struktury pochodzą z E. coli, zostały rozwiązane przez dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego w różnych grupach przestrzennych; mają zakres rozdzielczości od 1,63 do 2,8 A i były współkrystalizowane z szeregiem różnych ligandów (w tym bez ligandów, AMP, ADP, MG i inhibitora AP5). Zwróć uwagę, że dodatkowe szczegóły adnotacji można wyświetlić, klikając opcję "Pokaż/Ukryj kolumny" w panelu C.

Wielokrotne wyrównanie sekwencji jest wykonywane po wejściu w zakładkę WYRÓWNAJ. W pierwszym panelu karty WYRÓWNAJ wyświetlane jest podsumowanie wyrównania, zawierające szczegółowe informacje na temat liczby wierszy sekwencji (odpowiadającej liczbie struktur PDB), a także liczby pozycji (tj. kolumn wyrównania). Obejmuje to określenie liczby kolumn zawierających przerwy i bez przerw. Rysunek po prawej stronie pierwszego rzędu przedstawia schematyczne przedstawienie wyrównania sekwencji. W tym przypadku szare obszary reprezentują pozycje bez odstępów, podczas gdy białe obszary w wyrównaniu odpowiadają odstępom. Reprezentacja zachowania sekwencji jest pokazana powyżej wyrównania z czerwonymi obszarami wskazującymi dobrze zachowane pozycje, a białym oznaczającymi mniej zachowane. Zauważ, że sekwencje na tym rysunku są uporządkowane na podstawie ich podobieństwa zapewnionego przez grupowany dendrogram po lewej stronie. Drugi panel tej zakładki dodatkowo ułatwia grupowanie wybranych PDB w oparciu o ich podobieństwo sekwencji parami, które można wizualizować jako dendrogram lub mapę cieplną. Domyślnie wyświetlany jest dendrogram (lub diagram drzewa) reprezentujący układ klastrów. Oś y dendrogramu reprezentuje odległość (pod względem identyczności sekwencji) między klastrami.

Nakładanie konstrukcji jest wykonywane automatycznie po wejściu w zakładkę DOPASOWANIE. Nałożone na siebie struktury, wyświetlane interaktywnie w panelu A, wskazują na obecność stosunkowo sztywnego obszaru jądra (obejmującego pozostałości 1-29, 68-117 i 161-214; szczegóły w panelu "opcjonalne szczegóły rdzenia i RMSD" na dole zakładki FIT). Dwa bardziej zmienne regiony wiążące nukleotydy (reszty 30-67 i 118-167) są również wyraźnie widoczne (ryc. 2). Grupowanie oparte na RMSD grupuje te struktury w dwie odrębne konformacje.

Kliknięcie na zakładkę PCA wyraźniej pokazuje związek między strukturami pod względem przemieszczeń tych regionów, które efektywnie zamykają się nad związanymi gatunkami nukleotydów w powiązanych strukturach (Rysunek 2B i 2C). Większość struktur jest w formie "zamkniętej" (kolor niebieski na rysunku 2C) i jest związana ze związanym ligandem lub inhibitorem. W przeciwieństwie do tego, bardziej "otwarte" konformacje są wolne od nukleotydów i inhibitorów. Jest to zgodne z obszernym materiałem badań nad strukturą i dynamiką Adk, wskazującym, że otwarta konfiguracja tych regionów jest wymagana do wiązania nukleotydów i zamknięta konformacja do efektywnego transferu fosforylu i tłumienia szkodliwych zdarzeń hydrolizy. Warto zauważyć, że pojedynczy komputer przechwytuje 97% całkowitego średniego przemieszczenia kwadratowego w tym zestawie struktur Adk i zapewnia jasny i przekonujący opis przejścia otwartego do zamkniętego wraz z indywidualnymi wkładami reszty w to przemieszczenie funkcjonalne (panel C aplikacji i rysunek 2).

Odwiedzenie zakładki NMA i zwiększenie liczby struktur branych pod uwagę do obliczeń (poprzez zmniejszenie wartości granicznej dla filtrowania podobnych struktur) wskazuje, że struktury stanu otwartego wykazują zwiększoną dynamikę lokalną i globalną w porównaniu do struktur w formie zamkniętej (Rysunek 2D i panel C aplikacji). Porównanie wyników PCA i NMA dla poszczególnych struktur (panel D) wskazuje, że pierwszy tryb wszystkich struktur o formie otwartej wykazuje stosunkowo duże nakładanie się na PC1 (ze średnią wartością 0,37 ± 0,04). Z kolei struktury formularzy zamkniętych mają niższe wartości (ze średnią 0,30 ± 0,01). Wartości RMSIP dla otwartych struktur formularzowych (0,62 ± 0,003) są również wyższe niż dla struktur zamkniętych (0,56 ± 0,008). Ponadto analiza nakładania się pokazuje, że pierwsze mody stanu otwartego są dobrze zgodne ze zmianą konformacyjną, która opisuje różnicę stanów otwartych i zamkniętych (panel E). Klastrowanie na podstawie wartości RMSIP ponownie wyświetla spójne partycjonowanie struktur stanu otwartego i zamkniętego (panel F).

Łącznie te wyniki wskazują na istnienie dwóch głównych odrębnych stanów konformacyjnych dla Adk. Różnią się one zbiorowym przemieszczeniem o niskiej częstotliwości dwóch regionów miejsca wiązania nukleotydów, które wykazują wyraźną elastyczność po związaniu nukleotydu.

Rysunek 1: Przegląd Bio3D-web ze zrzutami ekranu zakładek PCA i NMA. Bio3D-web pobiera strukturę lub sekwencję białka podaną przez użytkownika jako dane wejściowe w zakładce SZUKAJ (1). Serwer udostępnia listę powiązanych struktur, które można wybrać do dalszej analizy. (2) Zakładka WYRÓWNAJ umożliwia sekwencyjne wyrównanie i analizę konstrukcji wybranych w zakładce SZUKAJ. (3) W zakładce DOPASOWANIE wszystkie konstrukcje są nakładane i wizualizowane w 3D wraz z wynikami konwencjonalnej analizy konstrukcji parami. (4) Analiza głównych składowych zestawu konstrukcji jest przeprowadzana w zakładce PCA w celu scharakteryzowania relacji między konwersatorami. (5) Analizę w trybie normalnym dla każdej konstrukcji można przeprowadzić w zakładce eNMA w celu zbadania dynamicznych trendów dla dostępnych stanów konstrukcyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: Wyniki analizy bio3D-web kinazy adenylanowej. (A) Dostępne struktury PDB kinazy adenylanowej nałożone na zidentyfikowany rdzeń niezmienniczy. Struktury są kolorowane zgodnie z klastrowaniem opartym na RMSD dostępnym w zakładce FIT. (B) Wizualizacja głównych komponentów jest dostępna w zakładce PCA w celu scharakteryzowania głównych zmian konformacyjnych w zbiorze danych. W tym przypadku trajektoria odpowiadająca pierwszemu głównemu składnikowi jest pokazana w reprezentacji rurki pokazującej ruch zamykający białko na dużą skalę. (C) Struktury są rzutowane na ich dwie pierwsze główne składowe na wykresie konformacyjnym przedstawiającym niskowymiarową reprezentację zmienności konformacyjnej. Każda kropka (lub struktura) jest kolorowana zgodnie z kryteriami określonymi przez użytkownika, w tym przypadku wynikami grupowania opartymi na PCA. (D) Analiza w trybie normalnym w zakładce eNMA sugeruje zwiększoną dynamikę lokalną i globalną dla struktur w stanie otwartym (kolor czerwony) w porównaniu ze strukturami w formie zamkniętej (kolor niebieski). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Bio3D-web może być używany do interaktywnego badania i mapowania stanów strukturalnych, dynamicznych i funkcjonalnych białek na podstawie dostępnych struktur krystalograficznych. Co więcej, wyniki grupowania oparte na NMA i PCA, wraz z adnotacjami i analizą opartą na sekwencjach, mogą być szczególnie przydatne do wyboru reprezentatywnych struktur do bardziej czasochłonnych analiz, takich jak dokowanie małych cząsteczek lub symulacje dynamiki molekularnej. W ten sposób Bio3D-web ułatwia zaawansowaną analizę bioinformatyczną strukturalną szerszemu gronu badaczy, zmniejszając wymagany poziom wiedzy technicznej. Obecny projekt Bio3D-web kładzie nacisk na prostotę, a nie na wyczerpujące włączenie wielu metod analizy dostępnych w pełnym, samodzielnym pakiecie Bio3D. W wielu przypadkach przewiduje się, że naukowcy będą korzystać z Bio3D-web w celu zrozumienia ogólnych trendów w ich rodzinie białek lub nadrodzinie białek, które mogą następnie dostarczyć informacji na temat bardziej specjalistycznych analiz. Bio3D-web został zatem zaprojektowany do szybkiego eksplorowania zestawów danych dotyczących struktury biomolekularnej i działania jako narzędzie do generowania hipotez. Zachęcamy użytkowników do dalszego eksplorowania swoich danych poprzez podanie przykładowego kodu Bio3D w powtarzalnym raporcie, który przechowuje również wszystkie szczegóły zapytania i wyniki analizy.

W powyższym reprezentatywnym przykładowym protokole pokazujemy zdolność Bio3D-web do ujawniania cech strukturalnych funkcjonalnych przejść konformacyjnych Adk. Dodatkowe zastosowania Bio3D-web obejmują analizę strukturalną i dynamiczną struktur PDB przesłanych przez użytkownika. Na przykład użytkownik może przesłać nowe struktury lub sekwencje białek do analizy. Wspomniane wcześniej etapy analizy, zwłaszcza etap eNMA, mogą ujawnić zarówno lokalne, jak i globalne trendy w ruchach białek, przy czym ruchy zbiorowe mają znaczenie funkcjonalne. Porównanie ze strukturami apo może również ujawnić cechy niezwiązanych z wiązanymi przejściami konformacyjnymi. Dodatkowe przykłady zastosowania do wielu różnych rodzin białek są dostępne w Internecie.

Chociaż wszystkie białka są elastycznymi i dynamicznymi jednostkami, nie wszystkie białka mają struktury o rozdzielczości atomowej dostępne w wielu różnych stanach (np. stanach aktywnych i nieaktywnych). Nasz pogląd na przestrzeń struktury białek jest zatem ograniczony, a zatem wgląd uzyskany za pomocą narzędzi takich jak Bio3D-web jest z konieczności ograniczony również w przypadku niektórych białek. Jednak przy obecnym postępie technologicznym i nowych inicjatywach w zakresie genomiki strukturalnej, przedstawiony tutaj protokół będzie coraz częściej stawał się ważną drogą do uzyskania wglądu w ważne relacje struktura-funkcja. Krytycznym krokiem, który jest szczególnie ważny przy analizie bardziej odległych spokrewnionych białek, jest potencjalne pojawienie się błędów dopasowania w zakładce ALIGN. Błędy wyrównania nieuchronnie wystąpią, gdy podobieństwo sekwencji spadnie poniżej 30% i w takich przypadkach użytkownik musi dokładnie sprawdzić i skorygować wyrównanie sekwencji w zakładce WYRÓWNAJ. Błędy wyrównania mogą skutkować nieprawidłowymi nałożonymi strukturami na karcie DOPASOWANIE i zamaskować najistotniejsze zmiany konformacyjne dla kolejnego PCA. Ponadto użytkownik powinien być świadomy brakujących reszt w wybranych strukturach PDB, ponieważ w obecnej implementacji PCA można wykonać tylko na resztach białkowych, w których wszystkie struktury mają odpowiadający im atom węgla alfa. W rezultacie, jeśli wybrany PDB ma nierozwiązane reszty dla określonego regionu białka, region ten zostanie pominięty w PCA.

Bio3D-web jest obecnie ograniczony do analizy jednołańcuchowych struktur PDB. W związku z tym ruchy funkcjonalne zachodzące na poziomie czwartorzędu nie mogą być badane przy użyciu obecnego protokołu. Chociaż obecnie opracowujemy nowe algorytmy, aby uwzględnić taką analizę w Bio3D-web, jedyną obecną opcją jest konwencjonalne wykorzystanie Bio3D.

Bio3D-web to jedyna aplikacja online, która umożliwia wyszukiwanie i identyfikowanie zbiorów struktur, interpretowanie ich wzorców sekwencji i zmienności strukturalnej oraz wydobywanie informacji mechanistycznych zarówno z analizy, jak i przewidywania ich plastyczności strukturalnej. Szeroka gama narzędzi do wizualizacji molekularnej i serwerów online umożliwia naukowcom badanie i analizowanie poszczególnych struktur biomolekularnych. Jednak istniejące narzędzia do analizy sekwencji, struktury i dynamiki dużych heterogenicznych rodzin białek często wymagają znacznej wiedzy obliczeniowej i zazwyczaj pozostają dostępne tylko dla użytkowników posiadających odpowiednie umiejętności programistyczne. Na przykład pakiet Bio3D wymaga R ⁸, ProDy wymaga Pythona, a Maven wymaga wiedzy o Matlabie ^9,10. Z kolei Bio3D-web nie wymaga wiedzy programistycznej, a tym samym zwiększa dostępność i zmniejsza barierę wejścia do wykonywania zaawansowanych analiz porównawczych sekwencji, struktury i dynamiki. Ponadto przygotowanie, selekcja, adnotacja i czyszczenie struktur molekularnych, które są często niezbędne do efektywnej analizy, są zawarte w usłudze internetowej Bio3D. Dodatkowo, ograniczenie do wykonywania takiej analizy na zasobach obliczeniowych jest złagodzone przez naszą instancję serwerową, która umożliwia analizę wielu struktur na dużą skalę, które mogą być inicjowane i kontrolowane z dowolnej nowoczesnej przeglądarki internetowej.

Otwarty rozwój Bio3D-web jest w toku (patrz https://bitbucket.org/Grantlab/bio3d). Stale dodajemy nowe funkcje analizy i ulepszamy istniejące metody. Przyszły rozwój będzie koncentrował się na dodaniu PCA opartego na macierzy odległości i PCA skrętnego, bardziej rozległych podejściach do zachowania sekwencji, które obejmują komponent filogenetyczny, identyfikację miejsca wiązania zespołu oraz nowych podejściach do dynamicznej analizy sieci w różnych rodzinach białek. Pod tym względem obecna aplikacja internetowa stanowi punkt wyjścia dla wielu innych procesów pracy związanych ze współpracą w zakresie bioinformatycznej analizy strukturalnej, umożliwiając powtarzalne i możliwe do udostępnienia kroki na zdefiniowanych przez użytkownika zestawach struktur eksperymentalnych. Planujemy również w przyszłości wsparcie dla zrekonstruowanych zbiorów współrzędnych jednostek biologicznych oraz pojedynczych i wielokrotnych łańcuchów z jednostki asymetrycznej struktur PDB. Dodatkowe funkcje będą obejmować ulepszone zapisywanie i wczytywanie wspólnych przestrzeni roboczych wraz z możliwością cofania.

Bio3D-web to aplikacja online do interaktywnej analizy danych o strukturze biomolekularnej. Bio3D-web działa w każdej nowoczesnej przeglądarce internetowej i zapewnia funkcjonalność dla: (1) Identyfikacja powiązanych struktur białkowych ustawia się na określone przez użytkownika progi podobieństwa; (2) Ich wielokrotne wyrównanie i superpozycja struktury; (3) Analiza zachowania sekwencji i struktury; (4) Mapowanie relacji między konformerami z analizą głównych składowych oraz (5) porównanie przewidywanej dynamiki wewnętrznej za pomocą zespołowej analizy w trybie normalnym. Ta zintegrowana funkcja zapewnia kompletny przepływ pracy do badania relacji sekwencja-struktura-dynamika w rodzinach białek i nadrodzinach. Oprócz wygodnego, łatwego w użyciu dynamicznego interfejsu do badania efektów wyboru parametrów i metod, Bio3D-web rejestruje również pełne dane wejściowe użytkownika i późniejsze wyniki graficzne sesji użytkownika. Dzięki temu użytkownicy mogą łatwo udostępniać i odtwarzać sekwencję kroków analizy, które utworzyły ich wyniki. Bio3D-web jest zaimplementowany w całości w języku R i jest oparty na pakietach Bio3D i Shiny R. Można go uruchomić z naszego serwera online lub zainstalować lokalnie na dowolnym komputerze z uruchomionym językiem R. Obejmuje to instalację serwera lokalnego w celu zapewnienia dostosowanej instancji dla wielu użytkowników z dostępem do priorytetowych zestawów danych strukturalnych, takich jak te powszechne w przemyśle farmaceutycznym. Pełny kod źródłowy i obszerna dokumentacja są udostępniane na licencji open-source GPL-3 od: http://thegrantlab.org/bio3d/webapps

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bio3D-web
Strona internetowa	http://thegrantlab.org/bio3d-web/
Wymagania	Przeglądarka